狭山野豌豆中总黄酮的制备方法
【专利摘要】本发明涉及狭山野豌豆中总黄酮的制备方法。采用的技术方案是：取狭山野豌豆药材粉末，以40?95％的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:10?20，70?90℃下提取，得提取液。选取填充有弱极性?中等极性大孔吸附树脂的吸附柱，上样总黄酮浓度为0.21?3.18mg/mL，调节pH为1?8，上样于吸附柱，上样体积为4?6倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2?6mL/min进行动态吸附，以30?95％的乙醇水溶液，2?6mL/min流速进行洗脱，收集洗脱液。本发明总黄酮大孔吸附树脂制备方法，总黄酮的收率高，解吸条件比较温和、使用周期长、再生简便、提取率高、成本低，适于工业化生产的推广和应用。
【专利说明】
狭山野魂豆中总黄酬的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药提取领域，具体地设及一种狭山野魏豆中药有效部位的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 狭山野魏豆（V.amoena Fisch.var.angusta Freyn.)为豆科化eguminosae)野魏 豆属(Vicia L.)植物，主要分布在我国东北、华北、西北等地，其地上部分作为中药透骨草 入药。2015年版《中国药典》一部中收载的中成药"坎离砂"、"养血荣筋丸"、"疏痛安涂膜剂" 处方中均有透骨草，且四部附录(成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片）中收录了狭山 野魏豆V.amoena Fisch.var.angusta Rr巧η.作为透骨草使用。
[000引狭山野魏豆"味甘、性平"，"能补、能和、能缓"，属于补肝肾型桂风湿药，其桂风湿 作用是通过调节免疫，进而补益肝肾，达到桂风湿的目的。狭山野魏豆中黄酬类物质是其免 疫调节的活性部位之一，总黄酬通过调节免疫，发挥补益肝肾、桂风湿的功效。现有技术中， 总黄酬的提取方法主要有抑梯度萃取法、乙酸乙醋萃取法、碱提酸沉法，提取率低。所W，优 化狭山野魏豆中总黄酬富集工艺，建立质量控制方法，可W为狭山野魏豆运一东北丰富植 物资源的开发与利用提供科学依据。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立狭山野魏豆总黄酬的制备方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是:狭山野魏豆中总黄酬的制备方法，包括提取步骤，方法 如下：取狭山野魏豆药材粉末，W40-95%的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:10-20,提取溫 度为70-90°C，提取1-3次，每次提取时间为1-1.5小时，得提取液。
[0006] 优选的，所述的提取步骤为：取狭山野魏豆药材粉末，W70%的乙醇水溶液为溶 剂，液料比为1:20，提取溫度为90°C，提取2次，每次提取时间为1小时，得提取液。
[0007] 上述的狭山野魏豆中总黄酬的制备方法，包括纯化步骤，方法如下:将提取液旋转 蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为0.21-3.18mg/mL，得上样液，调节上样液的抑为1-8; 选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液上样于吸附柱，上样体积为4-6倍树脂柱床体 积，调节吸附流速为2-6mL/min进行动态吸附，W30-95%的乙醇水溶液作为洗脱剂，W2- 6mL/min流速进行洗脱，W 5-12倍树脂柱床体积洗脱液洗脱，收集洗脱液。
[000引优选的，所述的纯化步骤为:将提取液旋转蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为 0.39mg/mL，得上样液，调节上样液的抑为5-6;选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液 上样于吸附柱，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2mL/min进行动态吸附，W 70 %的乙醇水溶液作为洗脱剂，W3mL/min流速进行洗脱，W10倍树脂柱床体积洗脱液洗 脱，收集洗脱液。
[0009]上述的狭山野魏豆中总黄酬的制备方法，所述的大孔吸附树脂是HPD-826型大孔 吸附树脂。
[0010] 本发明的原理是:本发明首次对狭山野魏豆中总黄酬的制备方法进行了优化，采 用大孔吸附树脂富集总黄酬，采用正交设计考察了药材提取溶剂、料液比、提取时间、提取 次数，建立了最佳的提取工艺;考察了树脂类型、上样浓度、pH值、上样体积、吸附流速、洗脱 剂、洗脱流速、洗脱体积，建立最佳的纯化工艺。
[0011] 本发明的有益效果是:本发明，总黄酬大孔吸附树脂制备方法和其他方法相比，总 黄酬的收率高于pH梯度萃取法、乙酸乙醋萃取法、碱提酸沉法；大孔树脂具有物理稳定性 高、不受无机物存在的影响、吸附选择性好、解吸条件比较溫和、使用周期长、再生简便、提 取率高、成本低等特点，适于狭山野魏豆总黄酬的制备，也适合工业化生产的推广和应用。
【具体实施方式】
[0012]实施例1狭山野魏豆总黄酬的制备方法
[OOU] 1)提取:取狭山野魏豆药材粉末10g，70%的乙醇水溶液200mL(液料比为1:20)，提 取溫度为90°C，提取2次，每次提取时间为1小时，得提取液；
[0014] 2)纯化：选取填充有册D-826型大孔吸附树脂的吸附柱（Φ1.5cmX20cm，10g)，将 步骤1)获得的提取液旋转蒸发回收乙醇，得浓缩液，浓缩液加水调节浓度为〇.39mg/mL，用 HC1调节样品水溶液pH为5.5，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节流速为2mL/min进行动态 吸附，洗脱剂为70 %乙醇水溶液，W3mL/min流速进行洗脱，洗脱体积为10倍树脂床体积，收 集洗脱液。
[0015] 3) W金丝桃巧、异搬皮巧、山奈巧、搬皮巧及山奈酪-3-0-α-Ι^-阿拉伯糖作为检测 物，测定洗脱液中总黄酬的含量，得总黄酬34.Olmg。
[0016] 实施例2提取步骤的优化 [0017]( - )提取溶剂的影响
[0018] 精密称取狭山野魏豆药材粉末（4号筛）5g，共7份，置250ml锥形瓶中，分别加入 40 %、50%、60%、70%、80%、95 %乙醇水溶液75ml (料液比为1:15)，90°C，加热1小时，提取 2次，提取液合并，蒸干，甲醇溶解，定容至50ml。测定提取液中总黄酬的含量，结果如表1。
[0019] 表1提取试剂考察结果
[0020]
[0021] (二)提取条件的影响
[0022] 提取溶剂浓度为70%乙醇水溶液。W提取溫度、料液比、提取时间、提取次数4个因 素进行正交试验设计，因素水平见表2，L9(34)正交设计试验方案及结果分析见表2、表3和表 4。
[0023] 表2正交试验设计因素水平表
[0024]
[0029] 影响狭山野魏豆总黄酬提取效率的因素依次为:液料比(B)、提取次数(D)、提取溫 度(A)、提取时间（C)。综合考虑节省能源、节约时间等因素，确定最佳提取工艺，即采用70% 乙醇水溶液，提取溫度为90°C，液料比为1:20,提取次数为2次，提取时间为每次化。
[0030] 实施例3纯化步骤的优化
[0031 ]( - )大孔吸附树脂对狭山野魏豆总黄酬的影响
[0032]考察的树脂型号为 HPD-750、HPD-600、HPD-826、HPD-5000、ADS-17、ADS-7、AB-8、 0101心-5、01-130。精密称取10种经过预处理的大孔树脂各1肖(干燥无水），置于50血锥形瓶 中，分别加入50mL生药浓度为0.17g/mL溶液(5种黄酬巧浓度Co为0.6404mg/mL)，时时振摇 (12化/min),振摇2小时，滤过，取续滤液，测定5个黄酬巧含量，得浓度Cl。取上述滤过得到 的10种大孔树脂，分别置于50mL锥形瓶中，分别加入50mL70%乙醇水溶液，时时振摇（120r/ min)，振摇2小时，滤过，取续滤液，测定5个黄酬巧含量，得浓度C2，计算，结果见表5。
[0033] 表5 10种大孔树脂静态吸附与解吸附试验结果
[0034]
[0035] (二)上样浓度对狭山野魏豆总黄酬的影响
[0036] 称取5份经过预处理的册D-826型大孔树脂各lOg(干燥）湿法装于各层析柱（Φ 1.5cmX 20cm)中，取0.2g/mL生药浓度的样品20mL，共5份，分别经过稀释或浓缩至不同浓 度，超声溶解，使样品充分溶解。取样品分别上柱，控制流速为2mL/min，收集流出液，滤过， W 5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表6。
[0037] 表6上样浓度对总黄酬影响试验结果 [00；3 引
[0040] (Ξ)ρΗ对狭山野魏豆总黄酬的影响
[0041 ]分别量取样品溶液(总黄酬浓度为0.385 60mg/mL)100mL，共5份，其中4份用ImoL/ L肥1溶液或ImoL/L化0田容液调节PH范围1~2、3~4、5~6、7~8。将上述5份溶液依次加入 HPD-826型大孔树脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，控制流速为2血/min,收集流出液，滤过，W 5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表7。当上样液体抑5~即寸，HPD-826型大孔树脂对 狭山野魏豆总黄酬的吸附率达到95.67%，pH范围为1~2和3~4时，吸附率均达到了90% W 上，然而抑值偏低，在工业化生产中会腐蚀金属机器及色谱柱，故将上样液体抑范围定为5 ~6。
[0042]表7 pH对总黄酬影响试验结果
[0043]
[0044] (四）吸附流速对狭山野魏豆总黄酬的影响
[0045] 分别量取PH 5~6样品水溶液(总黄酬浓度为0.38971mg/mL)100mL，依次加入5根 HPD-826型大孔树脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，分别调节流速为2、3、4、5和6血/min进行动 态吸附，收集流出液，滤过，W5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表8。
[0046] 表8吸附流速对总黄酬影响试验结果
[0047]
[004引（五)上样体积对狭山野魏豆总黄酬的影响
[00例将抑5~6样品水溶液(总黄酬浓度为0.377 89mg/mL)，加入预处理好的HPD-826 型大孔树脂柱（Φ 1.5cmX20cm，lOg)中，调节流速为2mL/min进行动态吸附，按树脂床体积 倍数上样，收集流出液，滤过，W 5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表9。
[0050]表9上样体积对总黄酬影响试验结果
[0化1 ]
[0052] (六)洗脱剂对狭山野魏豆总黄酬的影响
[0053] 分别量取抑5~6样品水溶液(总黄酬浓度为0.377 89mg/血）100血，分别加入4根 预处理好的HPD-826型大孔树脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，调节流速为2mL/min进行动态 吸附，收集流出液，滤过，定容。先用水洗脱至近无色，再分别用30 %、50 %、70 %和95 %乙醇 水溶液洗脱至近无色，洗脱液滤过，定容。W 5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表1 ο。 [0054]表10洗脱剂对总黄酬影响试验结果
[0化5]
[0056](屯)洗脱速度对狭山野魏豆总黄酬的影响
[0化7] 分别将抑5~6样品水溶液(总黄酬浓度为0.361 29mg/血）100血，加入5根预处理 好的HPD-826型大孔树脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，调节流速为2血/min进行动态吸附，收 集流出液，滤过。先用水洗脱至近无色，再70 %乙醇水溶液洗脱，分别W2、3、4、5、6血/min流 速进行洗脱，收集洗脱液，滤过，W 5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表11。
[0058]表11洗脱流速对总黄酬影响试验结 [0化9]
[0060](八)洗脱体积对狭山野魏豆总黄酬的影响
[00川将pH 5~6样品水溶液（总黄酬浓度为0.359 25mg/mL)100mL，加入预处理好的 HPD-826型大孔树脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，调节流速为2mL/min进行动态吸附，收集流 出液，滤过。先用水洗脱至近无色，再70%乙醇水溶液洗脱，W3mL/min流速进行洗脱，按树 脂床体积倍数收集洗脱液，滤过，W 5个黄酬巧含量为指标进行检测。结果见表12。
[0062] 表12洗脱体积考察试验结果
[0063]
[0064]综合考虑节省能源、节约时间等因素，确定最佳纯化工艺，即，填料采用HPD-826型 大孔吸附树脂，用HC1调节样品水溶液抑为5-6，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节流速为 211117111111进行动态吸附，洗脱剂为70%乙醇水溶液，^311117111111流速进行洗脱，^10倍树脂柱 床体积洗脱液洗脱。
【主权项】
1. 狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，其特征在于，包括提取步骤，方法如下：取狭山野 豌豆药材粉末，以40-95%的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:10-20，提取温度为70-90°C，提 取卜3次，每次提取时间为1_1.5小时，得提取液。2. 根据权利要求1所述的狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，其特征在于:所述的提取步 骤为:取狭山野豌豆药材粉末，以70%的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:20,提取温度为90 °C，提取2次，每次提取时间为1小时，得提取液。3. 根据权利要求1或2所述的狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，其特征在于:包括纯化 步骤，方法如下：将提取液旋转蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为0.21-3.18mg/mL，得 上样液，调节上样液的pH为1-8;选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液上样于吸附柱， 上样体积为4-6倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2-6mL/min进行动态吸附，以30-95 %的乙 醇水溶液作为洗脱剂，以2_6mL/min流速进行洗脱，以5-12倍树脂柱床体积洗脱液洗脱，收 集洗脱液。4. 根据权利要求3所述的狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，其特征在于:所述的纯化步 骤为:将提取液旋转蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为〇. 39mg/mL，得上样液，调节上样 液的pH为5-6;选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液上样于吸附柱，上样体积为5倍树 脂柱床体积，调节吸附流速为2mL/min进行动态吸附，以70 %的乙醇水溶液作为洗脱剂，以 3mL/min流速进行洗脱，以10倍树脂柱床体积洗脱液洗脱，收集洗脱液。5. 根据权利要求3所述的狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，其特征在于:所述的大孔吸 附树脂是HPD-826型大孔吸附树脂。
【文档编号】A61P29/00GK105998154SQ201610427486
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】桑育黎, 郝延军, 郭方岩, 陈长兰, 陈立江, 刘玉峰, 徐亮, 孔玉梅, 王宇
【申请人】辽宁大学