一种用于治疗神经损伤疾病的药物组合物的制作方法

本发明属于神经损伤治疗领域，特别涉及一种包括fgf1、或fgf2和β-抑制蛋白-1的用于治疗神经损伤疾病的药物组合物。

背景技术：

神经损伤常导致患者运动和感觉功能出现障碍，其常见的类型包括：脊髓损伤、周围神经损伤、脑外伤和缺血缺氧导致的神经损伤等。

近年来，随着细胞生物学、分子生物学和神经生物学的快速发展，研究表明细胞因子如神经生长因子、睫状神经营养因子、成纤维细胞生长因子(fgfs)和胰岛素样细胞因子等多种细胞因子均具有神经营养作用，可促进如外周神经损伤后的再生和修复；另外，现有研究表明，β-抑制蛋白-1也能够防治缺血引起的神经损伤疾病(cn103341158a)。

成纤维细胞生长因子是机体重要的细胞生长因子，其具有多种生理功能，可促进细胞的增殖、迁移、存活和分化，在生命活动中发挥重要作用。

成纤维细胞生长因子家族目前已知包括23个成员，家族成员之间具有30-80％的同源性，可分为7个亚家族：fgf1亚家族，其包括fgf1和fgf2；fgf4亚家族，其包括fgf4、fgf5、fgf6；fgf7亚家族，其包括fgf3、fgf7、fgf10和fgf22；fgf8亚家族，其包括fgf8、fgf17和fgf18；fgf9亚家族，其包括fgf9、fgf16和fgf20；fgf19亚家族，其包括fgf19、fgf21和fgf23；fgf11亚家族，其包括fgf11、fgf12、fgf13和fgf14。

多种成纤维细胞生长因子已经被证实具有神经损伤修复能力，如fgf1和fgf2在中枢神经系统中有高水平的表达，fgf1在神经细胞中表达，其中感觉神经元和运动神经元中高表达，fgf2则主要由星形胶质细胞表达，研究发现fgf2对脊髓损伤的恢复和重建具有显著作用；并且，fgf10在急性脊髓损伤后起内源性保护作用，还能促进神经干细胞的增殖和分化。fgf9也具有多种功能，其参与骨骼发育、血管形成、胚胎发育、损伤修复、细胞凋亡、神经再生、肿瘤生长等多种生理和病理的过程,可有效促进有丝分裂和细胞生长。

但基于目前的研究现状，单独给予患者成纤维细胞生长因子对神经损伤的治疗效果并不完美，其仍然存在进一步改进的需求，因此，本发明的目的是提供一种能够与成纤维细胞生长因子组合施用从而获得更好的神经损伤治疗效果的药物组合物。

技术实现要素：

为解决现有技术中利用单独的成纤维细胞生长因子治疗神经损伤疾病的效果还存在进一步改进的问题，本发明提供了一种包括fgf1或fgf2的药物组合物，其能够用于治疗神经损伤疾病。

具体地，本发明提供一种用于治疗神经损伤疾病的药物组合物，所述药物组合物包括fgf1和β-抑制蛋白-1。

进一步地，本发明还提供一种用于治疗神经损伤疾病的药物组合物，所述药物组合物包括fgf2和β-抑制蛋白-1。

更进一步地，所述药物组合物包括fgf1、fgf2和β-抑制蛋白-1。

更进一步地，所述药物组合物的活性成分由fgf1和β-抑制蛋白-1、或由fgf2和β-抑制蛋白-1、或由fgf1、fgf2和β-抑制蛋白-1组成。

更进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稳定剂、和或防腐剂。

进一步地，所述神经损伤疾病为缺血缺氧性神经损伤。

更进一步地，所述神经损伤疾病包括脑卒中、神经元细胞损伤、谷氨酸兴奋性神经损伤。

本发明还提供fgf1和β-抑制蛋白-1在制备治疗神经损伤疾病的药物组合物中的应用。

进一步地，本发明还提供fgf2和β-抑制蛋白-1在制备治疗神经损伤疾病的药物组合物中的应用。

有益效果

本发明的药物组合物能够大大增强神经损伤疾病的治疗效果，其中fgf1或fgf2能够与β-抑制蛋白-1协同起效，极显著地促进神经干细胞的增殖从而有利于神经损伤疾病的治疗。

附图说明

图1：正常对照组海马brdu阳性细胞的分布(400×he染色)。

图2：缺氧缺血组海马brdu阳性细胞的分布(400×he染色)。

图3：治疗组(fgf1+β-抑制蛋白-1)海马brdu阳性细胞的分布(400×he染色)。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规实验方法，或按照制造厂商所建议的条件进行。

本发明所用实验材料，除细胞因子外均为商购；细胞因子由本实验室根据已知的细胞因子原核细胞重组表达方法制备，并通过活性测定方法验证了重组细胞因子具有功能活性。

实施例1：以谷氨酸损伤模型筛选神经损伤治疗药物

发明人选取了已知对神经损伤修复有益的数种成纤维细胞生长因子和数种其他细胞因子组合施用以确定获得的组合物是否能够获得更好的神经损伤治疗效果，具体的实验设计如下记载。

以含细胞因子的药物组合物对神经细胞损伤的保护作用作为筛选指标，即建立谷氨酸损伤模型以筛选对其具有良好治疗效果的药物组合物。

将冻存的细胞株sh-sy5y(温州医科大学)从液氮罐中取出，迅速投入37-40℃的水中，单方向轻轻摇动使其在1分钟内融化。将细胞悬液移至15ml离心管中，加入10倍体积的含体积分数10％胎牛血清的mem培养基，摇匀，800r/min离心5min，弃上清，加入含血清的mem培养基并接种于100ml培养瓶中，每瓶加培养基至8ml/瓶，放入5％二氧化碳(体积分数)培养箱中培养，镜检，当细胞汇合率达到70％以上时进行传代，弃培养基，用无血清培养基洗细胞1次，加入2ml的0.125％胰酶消化，镜检，当细胞突触回缩变圆时，弃胰酶，用马血清终止消化，收集细胞悬液，离心弃上清，加入含血清的mem培养基约2ml，混匀、计数，稀释至1×10⁵ml水平，接种于25ml培养瓶中进行培养。取对数生长期细胞接种于96孔板中培养24小时进行无血清培养，在无血清培养24小时后，加入100mmol/l的谷氨酸，并在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养30分钟，用d-hank’s缓冲液洗涤两次，换无血清的mem培养基进行培养并视分组情况加入(实验组)或不加入细胞因子(空白对照组)进行干预，24小时后检测细胞存活率，即在培养终止前4小时加入20μl的mtt溶液，37℃孵育4小时后弃液，加dmso100μl，30分钟内，用酶标仪在570nm进行检测，根据实验组与正常对照组的检测结果测定细胞存活率，重复5次。

fgf1、fgf2、fgf9、fgf10、ngf(神经生长因子)、bdnf(脑源性神经营养因子)、cntf(睫状神经营养因子)、β-arrestin-1(β-抑制蛋白-1)、igf(胰岛素样生长因子)的单独或组合用量均为50mmol/l。其中，正常对照组的细胞存活率为99.6％，空白对照组的细胞存活率为53.2±5.9％，实验组的细胞存活率如表1所示。

表1：实验组细胞存活率

**代表与空白对照、单独fgf1、单独fgf2或单独β-抑制蛋白-1施用相比，组合施用fgf1、β-抑制蛋白-1或组合施用fgf1、β-抑制蛋白-1的p＜0.01。

由表1的实验数据可知，当将fgf1或fgf2与β-抑制蛋白-1组合施用时，能够显著地增强神经细胞的存活率，不受理论限制地，fgf1或fgf2和β-抑制蛋白-1组合施用能够协同作用起到降低神经细胞损伤的保护作用。

实施例2：神经损伤治疗药物组合物对脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

本实施例进一步验证了fgf1、fgf2、β-抑制蛋白-1以及fgf1或fgf2与β-抑制蛋白-1制备的药物组合物对脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖的影响。

脑缺血大鼠动物模型的建立：

采用颈外动脉插入线栓法将sd大鼠(250-300g)右颈内动脉栓塞两小时后拔出线栓，制成短暂性脑缺血大鼠模型。

实验设计：

依据给予的药物，分为fgf1组、fgf2组、β-抑制蛋白-1组、fgf1+β-抑制蛋白-1组、fgf2+β-抑制蛋白-1组、和生理盐水对照组，每组包括18只脑缺血大鼠，相应大鼠在建模后第1-3天每日分别皮下给予生理盐水500μl、fgf1(1μg/500μl)、fgf2(1μg/500μl)、β-抑制蛋白-1(1μg/500μl)、fgf1(1μg/500μl)+β-抑制蛋白-1(1μg/500μl)(计为fgf1联合组)、fgf2(1μg/500μl)+β-抑制蛋白-1(1μg/500μl)(计为fgf2联合组)，以后每3天给药1次，至相应时间点(7天、14天、21天)处死大鼠。

在相应时间点处死大鼠前32小时，将brdu溶于生理盐水中配制成1％的溶液，并以50mg/kg.次的量进行腹腔注射，每4小时注射1次，共计注射3次，第3次给药后24h处死动物。

具体的处死方法即：用4％多聚甲醛500ml经大鼠左心室灌注后，断头取脑，利用4％多聚甲醛固定24小时，分别取出含侧脑室、海马的脑组织块常规处理后连续切片，每个组织块取1张切片供检测brdu阳性细胞用，brdu阳性细胞检测采用免疫组化sp法，并采用leica计算机图像分析系统对组织切片进行图像分析，以细胞内出现棕褐色颗粒为阳性，200倍光镜下分别计数每张切片缺血侧、缺血对侧的侧脑室室管膜下区(svz)、海马3个不同视野的brdu阳性细胞数，各部位brdu阳性细胞数之和计为阳性细胞总数，数据以均值±标准差表示

实验结果如表2-3所示。

表2各组缺血侧与对侧海马的brdu阳性细胞数的比较(个/mm²，n＝6)

与对照组、fgf1组、fgf2组或β-抑制蛋白-1组相同处理时间相比，**代表p＜0.01。

表3各组缺血侧与对侧svz的brdu阳性细胞数的比较(个/mm²，n＝6)

与对照组、fgf1组、fgf2组、或β-抑制蛋白-1组相同处理时间相比，**代表p＜0.01。

由表2和表3的实验数据可知，相对于生理盐水对照组、单独的fgf1组、单独的fgf2组或单独的β-抑制蛋白-1组，联合给药组在各个时间点双侧海马及缺血对侧的侧脑室室管膜下区的brdu阳性细胞数和brdu阳性细胞总数均显著增加；且相对于生理盐水对照组，单独的fgf1组、单独的fgf2组在各给时间点也能够显著增加双侧海马及缺血对侧的侧脑室室管膜下区的brdu阳性细胞数和brdu阳性细胞总数均显著增加；单独的β-抑制蛋白-1组则相对于生理盐水对照组并不能明显改善双侧海马及缺血对侧的侧脑室室管膜下区的brdu阳性细胞数和brdu阳性细胞总数(海马组织brdu阳性细胞的分布见图1-3)。

总之，由表2和表3的数据可知，将fgf1或fgf2与β-抑制蛋白-1联合施用获得了协同效果，其能够通过刺激神经干细胞的增殖而显著增强对神经损伤的治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。