一种抗肿瘤药物的制作方法

本发明涉及抗肿瘤药物药理领域，更具体涉及一种抗肿瘤药物。

背景技术：

近年来，人类患癌症的比例逐年增加，其中乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。全世界范围内乳腺癌是女性中最为常见的肿瘤，占女性肿瘤病例总数的24.2％。2018年对肿瘤的调查报告显示女性中乳腺癌是发病率和死亡率最高的癌症，发病比例为46.3％，死亡比例为13.0％。手术切除后进行化疗或/和放疗是乳腺癌的常用治疗方法。天然产物是抗肿瘤新药发现的重要源泉，也是创新药物、药物候选结构和药物先导结构的重要来源，因此，寻找具有抗肿瘤效果的天然化合物对抗肿瘤，特别是抗乳腺癌有着非常重要的意义。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供洛克米兰醇在制备抗肿瘤药物中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种抗肿瘤药物，药物的活性成分为洛克米兰醇，所述洛克米兰醇的化学式为：

进一步的，所述抗肿瘤药物针对的肿瘤为乳腺癌。

进一步的，所述乳腺癌细胞是mcf7和/或mdamb231。

进一步的，所述洛克米兰醇通过抑制乳腺癌细胞增殖并阻滞细胞周期于g2/m期，从而起到抗肿瘤作用。

进一步的，所述洛克米兰醇阻滞细胞周期与g2/m期和g0/g1期相关蛋白的调控有关。

进一步的，所述相关蛋白为cyclinb1、cyclind1、p21和p27。

进一步的，所述洛克米兰醇抑制乳腺癌细胞的细胞迁移。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

洛克米兰醇是从红果樫木(dysoxylumbinectariferum)树皮中分离而来的flavagline类化合物，是一种天然的，具有抗肿瘤特别是抗乳腺癌的小分子化合物。

本发明发现洛克米兰醇抑制乳腺癌细胞的增殖与其阻滞乳腺癌细胞于g2/m期有关。进一步通过分析细胞周期蛋白发现，洛克米兰醇通过下调cdc25c失活cdc2(ther14)和增加cyclinb1的表达激活细胞分裂期促进因子(mpf)，并且洛克米兰醇抑制g0/g1期检测点蛋白cyclind1的表达。本发明分析这是乳腺癌细胞被阻滞于g2/m期的原因之一。

本发明的实施有助于从洛克米兰醇对乳腺癌细胞抑制作用的机制研究向临床应用转化，为乳腺癌治疗提供潜在有效的小分子化合物，为洛克米兰醇应用于人类癌症的治疗提供了参考，对乳腺癌治疗有着深远的意义。

附图说明

图1：洛克米兰醇对mcf7细胞和mdamb231细胞的生长抑制作用；其中(a和b)为显微镜下观察洛克米兰醇作用于mcf7细胞和mdamb231细胞48hr的变化(bar＝100μm)，(c和d)为mtt法分析指示浓度的洛克米兰醇作用于mcf7细胞和mdamb231细胞24hr、48hr、72hr和96hr的生存曲线。

图2：流式细胞技术检测洛克米兰醇(1μm和5μm)作用于mcf7和mdamb231细胞48小时后对细胞周期的影响。

图3：蛋白免疫印迹法检测洛克米兰醇(1μm和5μm)作用于mc231细胞24小时后对细胞周期蛋白的影响。

图4：细胞划痕实验检测洛克米兰醇(1μm)作用于mdamb231细胞20小时后对细胞迁移的影响(bar＝100μm)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述，所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不是以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1细胞活性测定

指定浓度的化合物洛克米兰醇处理细胞72hr后，采用mtt法进行活性检测或细胞生长测定。

(1)在化合物洛克米兰醇处理的前一天铺96孔板。收集细胞于15ml离心管中，吹匀，计数mcf7和mdamb231的细胞密度为3～5×10⁴个/ml，90μl/孔。

(2)用dmem培养基配制10倍浓度的指定浓度洛克米兰醇。

(3)加入配制好的化合物洛克米兰醇至细胞上，10μl/孔，化合物的终浓度即为指定浓度。实验设置5个复孔。

(4)化合物洛克米兰醇作用72hr后，加入5mg/mlmtt，10μl/孔。

(5)4hr后，1500rpm，15min，弃上清，尽量吸干残余液体。

(6)加入dmso，160μl/孔。

(7)酶标议，振板5min，读数od490nm。

(8)计算

ic50的计算方法：采用forecast函数求得化合物在mcf7和和mdamb231上的ic50。

相对增殖率的计算方法：相对增殖率＝处理组od490nm吸光值/对照组od490nm吸光值。

mtt法检测该化合物洛克米兰醇的活性，如图1所示，结果表明洛克米兰醇在mcf7和mdamb231上的ic50分别为86.45nm±10.33nm和121.17nm±29.08nm。通过对生长曲线的测定确定了洛克米兰醇能有效抑制mcf7和mdamb231的生长，呈现浓度和时间依赖性。

实施例2.蛋白免疫印迹

(1)洛克米兰醇处理及细胞总蛋白的提取

①待培养皿中细胞处于对数生长期，传代细胞，细胞稳定后，加入洛克米兰醇于细胞上，保证终浓度为指定浓度。

②处理24hr后，用细胞刮刮下细胞，收集细胞于15ml离心管中，1000rpm离心3～5min，弃去旧培养液。

③用体积为5ml的1×pbs洗涤细胞3次，1000rpm离心3～5min，弃去上清。

④加入适量的ripa裂解液(含1mmpmsf的ripa缓冲液)。

⑤4℃作用30min。

⑥10000g离心10min。

⑦小心吸取上清液，用于蛋白浓度的测定。

(2)bca法测定蛋白浓度

①稀释标准品：用1×pbs将bsa标准品稀释成终浓度为0.5mg/ml。加一定体积的标准品至96孔板中，使得标准品的浓度依次为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml和0.5mg/ml，1×pbs补足至20μl。

②将洛克米兰醇处理的蛋白样品进行1倍、2倍和4倍稀释，加20μl到96孔板中。

③根据标准品和样品数量计算所需bca工作液的体积，按cu试剂：bca试剂为1:50(v:v)配制成bca工作液，充分混匀。

④每个待测孔中加入200μlbca工作液，37℃作用30min。用synergy2酶标仪测定od562nm处吸光值。根据得到的标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度。

(3)sds-page

①制胶：将玻璃板用超纯水冲洗干净，晾干或擦干，组装成玻璃夹层，确保玻璃夹层底部水平。根据蛋白的分子量大小配制指定浓度的分离胶，将分离胶缓慢倒入玻璃夹层中，然后立即轻轻地用超纯水加满玻璃夹层，同时避免超纯水溢出玻璃夹层。等待约30min后，分离胶聚合，肉眼可见分离胶与超纯水层之间出现明显的界面，弃去超纯水，并用滤纸吸干。配制5％的浓缩胶，将浓缩胶加满玻璃夹层，立即插入10孔点样梳，小心避免梳子下方产生气泡，等待约30min后，浓缩胶聚合，拔点样梳。

②洛克米兰醇处理样品的准备：根据蛋白样品的体积加入一定体积的5×蛋白上样样品缓冲液，金属加热模块中100℃煮沸5min，置于冰上。

③电泳及后处理：将夹胶玻璃板固定在电泳电极卡槽上，向电泳槽内加入电泳缓冲液至相应的刻度。根据样品浓度计算加50μg样品需要的样品体积，用移液枪吸取样品加入上样孔中。接通bio-rad蛋白电泳仪电源，设定程序恒压100v，至溴酚蓝指示剂跑到玻璃夹层底部，大约2hr停止电泳。打开电泳电极卡槽，撬开玻璃夹层，取出凝胶。

(4)蛋白转膜

①量取凝胶大小，依据凝胶大小剪取与之相同大小的pvdf膜。将pvdf膜置于甲醇中激活30sec，然后将pvdf膜转移到1×蛋白电转移缓冲液工作液中。将凝胶和预先浸润的pvdf膜、滤纸和海绵垫按顺序摆放，分别为海绵垫-滤纸-聚丙酰胺凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫。避免pvdf膜、滤纸与凝胶互相之间产生气泡。

②将“海绵垫-滤纸-聚丙酰胺凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫”结构放入两块有机玻璃支持板之间，夹住。

③将夹有pvdf膜、滤纸与凝胶的有机玻璃支持板放入盛有1×蛋白电转移缓冲液的电泳槽内，pvdf膜面朝向阳极，凝胶置于阴极。接通bio-rad蛋白电泳仪电源，设定程序恒流220ma电转移2hr。

④转移结束后，用镊子将pvdf膜取出置于1×tbs中浸泡5min。

(5)免疫印迹反应

①加5％脱脂奶粉或3％bsa于pvdf膜上，摇床左右晃动，室温封闭1hr，1×tbs洗涤3次，每次5min。

②加入相应蛋白的抗体，室温孵育1hr30min～2hr，1×tbs洗涤3次，每次5min。

③加入anti-rabbitigg(h+l)(dylighttm8004×pegconjugate)或irdyer800cwgoatanti-rabbit二抗，室温孵育1hr30min～2hr，1×tbs洗涤3次，每次5min。

④odysseyplatform扫膜，设置扫膜程序。

如图3所示，蛋白免疫印迹实验结果显示，洛克米兰醇可以显著增强乳腺癌细胞细胞周期g2/m期相关蛋白cyclinb1的表达，抑制细胞周期g0/g1期相关蛋白cyclind1的表达，在mcf7细胞中该小分子化合物还抑制了细胞周期g0/g1期相关蛋白p21和p27的表达。

cyclinb1结合于cdc2形成细胞分裂期促进因子(mpf)。mpf处于失活状态，直至g2期晚期cdc25c下调引起磷酸化的cdc2(ther14)失活从而激活mpf，引发细胞分裂期的起始。由蛋白免疫印迹实验结果推测，该小分子化合物洛克米兰醇可能通过抑制g0/g1期相关促进蛋白和增加g2/m期相关抑制蛋白的表达阻滞乳腺癌细胞于g2/m期。

实施例3.pi法测定细胞周期

(1)铺6孔板，5×105个细胞/ml，2ml/孔。

(2)加入指定浓度的药物。

(3)2d后，收集mcf7和和mdamb231细胞，用含edta的胰酶消化细胞，1000rpm离心3～5min，弃去上清。

(4)用5ml过滤的1×pbs洗涤细胞2次。1000rpm离心3～5min，弃去上清。

(5)向每个待测样品中加入1ml预冷的75％乙醇，置于1.5ml离心管中，-20℃固定过夜。

(6)用1ml过滤的1×pbs洗涤细胞2次。1000rpm离心3～5min，弃去上清。

(7)配制细胞周期染色液。在1×pbs中加入一定体积的pi至终浓度为50μg/ml，

加入一定体积的rnase至终浓度为0.1mg/ml，加入一定体积的tritonx-100至终浓度为0.05％。避光放置。

(8)每个样品用500μl细胞周期染色液重悬。

(9)37℃避光作用30min。

(10)用1ml过滤的1×pbs洗涤染色后细胞1次。1000rpm离心3～5min，弃去上清。

(11)用适量体积的过滤1×pbs重悬细胞沉淀，滤过200目滤筛。

(12)接通流式细胞仪电源，设置bdbiosciences流式细胞仪软件参数，保证每个样品的细胞数目至少10000个。

如图2所示，流式细胞技术结果表明，相比较于dmso对照组，小分子化合物洛克米兰醇处理组(1μm和5μm)g2/m期mcf7和mdamb231细胞的比例明显增加(p<0.005)。该小分子化合物洛克米兰醇对乳腺癌细胞有明显的细胞阻滞作用，阻滞mcf7和mdamb231于g2/m期。1μm和5μm小分子化合物处理组g2/m期mcf7细胞比例由dmso组的18.62％±1.13％增加为34.82±2.75％和39.92±1.68％(p<0.005)。1μm和5μm小分子化合物洛克米兰醇处理组g2/m期mdamb231细胞比例由dmso组的12.04±1.95％增加为22.22±3.49％和22.75±0.52％(p<0.005)。

实施例4.细胞划痕实验

(1)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划纵线，间隔相同的距离每孔共划5条纵线。

(2)收集mdamb231细胞，用含edta的胰酶消化细胞，1000rpm离心3～5min，弃去上清。加入新鲜的含5％fbs的dmem培养基，计数细胞调至细胞密度为5×105个细胞/ml。在6孔板中加入2ml细胞，37℃培养箱培养过夜。

(3)第二天弃去培养基，垂直于6孔板背后纵线用枪头比着直尺划横线，间隔相同的距离每孔共划5条横线。

(4)用1×pbs洗涤细胞3次，弃上清，加入2％fbs的dmem培养基。

(5)放入37℃，5％co2培养箱，培养。指定时间取出细胞，拍照记录。

如图4所示，细胞划痕实验结果显示，相比较于dmso对照组，该小分子化合物洛克米兰醇能够抑制mdamb231细胞的细胞迁移(p<0.005)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。