一种磷酸二酯酶4抑制剂在预防及治疗帕金森病中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种磷酸二酯酶4抑制剂在预防及治疗帕金森病中的应用。

背景技术：

帕金森病(parkinson'sdisease,pd)是全球第二大神经退行性疾病，其发病率逐年上升且和年龄呈正相关。无论是从社会学角度还是经济学角度，pd已经成为影响我国人口健康水平和生活质量、严重阻碍经济持续发展的重大社会问题。pd主要的病理特征为：黑质多巴胺能神经元丢失、路易小体的形成以及纹状体神经末梢退行性变。这些病理特征导致pd患者出现静止性震颤、运动迟缓以及肌强直等临床表现。目前，国内临床使用的药物有左旋多巴类、抗胆碱类、促多巴胺释放剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶b型抑制剂等药物。这些抗pd药物能一定程度上缓解pd的运动症状，但使用一段时间后会出现耐药现象。同时这些药物还存在明显的不足之处，如长期应用左旋多巴类药，特别在剂量过大时，脑内多巴胺升高，在单胺氧化酶-b催化下产生自由基，是增加或加重神经元变性，导致本品久用后疗效渐减的促成因素之一。另外，现有的抗pd药物还会出现如剂末现象、开关现象、晨僵现象等反应，影响了患者的使用顺应性。其他常见的不良反应如胃肠反应(主要表现为恶心、呕吐、厌食及便秘)、心血管副作用(如直立性低血压、心律失常)、睡眠障碍和精神症状等都使得目前的抗pd药物都有待改进。因此，很有必要寻求新的抗pd药物靶点及新的抗pd化合物。

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase4,pde4)是细胞内环磷酸腺苷(camp)的特异性水解酶，在神经细胞、炎症细胞及气道平滑肌细胞中高表达。pde4含有4个亚亚型(pde4a/b/c/d)。其中：pde4a、pde4b及pde4d在基底神经节纹状体中均有不同程度的表达，pde4在调节纹状体中的camp介导的多巴胺信号传导中起关键作用。pde4抑制剂一直是世界科研工作者和跨国医药公司追逐的热点，已上市药物的适应症主要集中呼吸系统(如慢性阻塞性肺疾病)及其他自身免疫性疾病(如银屑病)。pde4抑制剂在中枢神经系统疾病的作用也引起了广泛关注，如第一代pde4抑制剂咯利普兰已证实可以增加大鼠学习记忆能力。第二代pde4抑制剂罗氟司特（roflumilast）是治疗慢性阻塞性肺疾病伴支气管炎的一线药物，同时也被证实具有一定的改善认知障碍的作用。这些结果显示出pde4抑制剂具有可观的临床治疗前景。但是，遗憾的是临床应用发现：现有的pde4抑制剂都会产生严重的恶心呕吐等胃肠道反应，这些副作用限制了该类药物的临床使用剂量，甚至阻碍了该类药物的临床应用。因此，获得有效、但不导致呕吐的pde4抑制剂是pde4抑制剂应用于临床的前提和基础。

roflupram是个新型的pde4抑制剂，与经典的pde4抑制剂如rolipram相比，roflupram对pde4催化中心(pde4cat)、pde4a、pde4b及pde4d的抑制作用要明显强于rolipram。与rolipram相比，roflupram的优势之一是对pde4b及pde4d的亚型选择性较高。最大的优势是：传统的pde4抑制剂如rolipram会导致难以耐受的呕吐反应，而roflupram在治疗剂量下，导致呕吐的潜能很小，即突破了现有pde4抑制剂的瓶颈，具有极大的开发价值和临床应用的潜能。有关roflupram对pde4酶活性的抑制作用及不导致呕吐样反应的研究已公开，参见：ffpm,apde4inhibitor,reverseslearningandmemorydeficitsinapp/ps1transgenicmiceviacamp/pka/crebsignalingandanti-inflammatoryeffects。

有关roflupram在中枢神经系统疾病的作用，目前报道还很少。有研究显示roflupram可改善app/ps1转基因小鼠的认知功能，另有研究显示roflupram可抑制脂多糖(lps)+atp或aβ诱导的小胶质细胞炎症因子的产生。有关roflupram对多巴胺能神经元的保护作用及其作为保护剂治疗帕金森病的用途未见公开。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供pde4抑制剂在预防及治疗帕金森病中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种磷酸二酯酶4抑制剂在预防及治疗帕金森病中的应用，所述的磷酸二酯酶4抑制剂为roflupram；

所述的roflupram的结构式为：

；

所述的roflupram应用于预防和治疗帕金森病的药物中。

上述的roflupram应用于制备改善因帕金森病造成的神经元损伤的药物中。

上述的药物中包含所述roflupram的化合物或者药物可接受盐。

上述的药物的给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

上述的药物的制剂形式包括片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

与现有技术相比，本发明提供新型pde4抑制剂roflupram在抗帕金森病药物上的应用，其对多巴胺能神经元具有很好的保护作用，对pd的运动障碍具有很好的改善效果。

附图说明

图1为roflupram在sh-sy5y细胞中对mpp⁺诱导的细胞损伤的保护作用图；

图2为流式细胞术检测roflupram对mpp⁺造模后sh-sy5y细胞凋亡的影响图；

图3为roflupram在sh-sy5y细胞中可对抗mpp⁺导致的线粒体膜电位的下降图；

图4为roflupram在sh-sy5y细胞中可降低mpp⁺触发的活性氧的水平图；

图5为roflupram在爬杆实验(图5a)及转棒(图5b)中对mptp诱导的帕金森病模型小鼠运动功能的影响图；

图6为roflupram对mptp诱导的帕金森病模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数量的影响图；

图7为roflupram对mptp诱导的帕金森病模型小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶表达的影响图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一种磷酸二酯酶4抑制剂在预防及治疗帕金森病中的应用，所述的磷酸二酯酶4抑制剂为roflupram；

所述的roflupram的结构式为：

；

所述的roflupram应用于预防和治疗帕金森病的药物中。

上述的roflupram应用于制备改善因帕金森病造成的神经元损伤的药物中。

实施例中，药物中包含所述roflupram的化合物或者药物可接受盐。

实施例中，药物的给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

实施例中，药物的制剂形式包括片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

本发明建立mpp⁺诱导的帕金森病体外细胞模型，并建立mptp诱导的帕金森病整体动物模型，研究roflupram对sh-sy5y细胞的保护作用及作用机制；研究roflupram对帕金森病模型动物运动功能的改善作用及脑内多巴胺能神经元存活的影响。本发明提供新型pde4抑制剂roflupram在抗帕金森病药物上的应用，其对多巴胺能神经元具有很好的保护作用，对pd的运动障碍具有很好的改善效果。

下面通过实验证实pde4d抑制剂roflupram对于预防和治疗帕金森病的作用。

实验1.roflupram在1-甲基-4-苯基吡啶离子(mpp⁺)诱导的pd细胞模型中对sh-sy5y细胞的保护作用

一.材料与方法：

1.材料及主要试剂：

sh-sy5y细胞来自美国模式培养物集存库(atcc,usa)；dmem/f12培养基、胎牛血清(fbs)、胰蛋白酶消化液购自美国gibco公司；cck-8溶液购自日本东仁公司；annexinv-fitc/pi双染细胞凋亡检测试剂盒购自美国bd公司；tmre试剂盒、mitosox线粒体超氧化物红色荧光探针试剂盒购自美国thermo公司。roflupram及mpp⁺购自sigma-aldrich公司(st.louis,mo,usa)。

2.实验方法：

(1)cck-8法检测细胞活力

取对数生长期状态良好的sh-sy5y细胞，采用胰蛋白酶进行消化，含10%fbs的emem/f12培养基进行终止消化。细胞经离心、重悬，制成细胞悬液。加入含1%fbs的dmem/f12培养基并接种至96孔板中，每孔100μl细胞悬液，约8×10³个细胞。24h后，轻轻吸去孔内原有的液体，加入新鲜的培养基，每孔90μl。每组加入不同浓度的roflupram，1h后加入mpp⁺使其终浓度为500μm，放入培养箱继续培养48h。处理结束后，从培养箱中取出96孔板，每孔加入10μlcck-8反应溶液，37℃避光反应4h。反应结束后，用多功能酶标仪检测450nm处的吸光度值并进行计算。

(2)流式细胞术检测细胞凋亡

sh-sy5y细胞接种至6孔板，每孔约含3×10⁵个细胞，培养基体积为2ml。细胞先经不同浓度的roflupram处理1h，再给予mpp⁺处理24h。处理结束后，事先取出fitcannexinv-pi试剂盒解冻，将细胞消化、离心、弃上清，用1×的bindingbuffer重悬，调整细胞悬液浓度为每100μl含1×10⁶个细胞，加入5µl的fitc-annexinv和5µlpi并轻轻吹打混匀，室温避光孵育15min（此步骤及之后所有操作均需避光进行操作），加入400μl1×的bindingbuffer轻轻吹打混匀，在1h内用流式细胞仪进行检测。

(3)线粒体膜电位检测

sh-sy5y细胞接种至6孔板。24h后，将原培养液更换为新鲜培养基，先20µmroflupram处理1h后，再加入mpp⁺(终浓度为500μm)。24h后，用pbs清洗细胞一遍，再加入tmre，其终浓度为100nm，于37℃避光孵育30min（此步骤及之后所有操作均需避光进行操作）。孵育结束后，用pbs缓冲液洗三遍，倒置荧光显微镜下进行观察和拍照。

(4)线粒体来源的活性氧检测

sh-sy5y细胞接种至6孔板。24h后，将原培养液更换为新鲜培养基，先20µmroflupram处理1h后，再加入mpp⁺(终浓度为500μm)。1h后，加入5μm的mitosox线粒体超氧化物红色荧光探针溶液，于37℃避光孵育10min（此步骤及之后所有操作均需避光进行操作）。孵育结束后，用预热的pbs缓冲液洗三遍，倒置荧光显微镜下进行观察和拍照。

(5)统计学出路

所有实验数据都用mean±sd表示，用spss19.0软件分析，组间差异采用单因素方差分析（one-wayanova），方差齐时应用bonferroni进行两两比较分析。用graphpadprism7.0绘制结果图。p<0.05表示有显著性差异。

3.实验结果：

(1)roflupram可对抗mpp⁺引起的sh-sy5y细胞损伤。我们首先在sh-sy5y细胞中考察roflupram本身是否具有毒性，加入不同浓度的roflupram(5-40μm)，孵育24h后，采用cck-8考察其细胞毒性。结果显示：与对照组比较，各浓度的roflupram均未引起细胞毒性(图1a，p>0.05)。我们继续考察在mpp⁺处理条件下，roflupram的神经保护作用。结果显示：500μm的mpp⁺处理可显著降低sh-sy5y细胞的存活(图1b，p<0.001)，而随着roflupram浓度的增加，细胞活力被损伤的程度逐渐降低。与mpp⁺处理组比较，当青篙素浓度达到20μm及以上时，可见有显著性差异(p<0.01)。

(2)roflupram在mpp⁺诱发细胞凋亡中的保护作用。上述结果表明roflupram可以保护mpp⁺诱导的细胞损伤，接下来进一步采用流式细胞术来考察roflupram抑制mpp⁺诱导细胞凋亡的作用。结果如图2a所示。roflupram不导致sh-sy5y细胞的凋亡(p>0.05)。与正常对照组相比，mpp⁺模型组中的细胞处于早期凋亡的比例(21.9%)和晚期凋亡的比例(10.3%)明显增加。与mpp⁺处理的模型组相比，给予10μm、20μm或40μm的roflupram处理细胞24h后，能剂量依赖性地降低凋亡细胞的比例。20μm的roflupram可使早期凋亡细胞的比例下降至7.84%，使晚期细胞凋亡的比例下降至8.71%。与模型组比较，凋亡细胞比例具有统计学差异(p<0.001)。40μm的roflupram则可进一步降低凋亡细胞的比例(p<0.001)。图2b为根据流式的结果，折算的细胞存活的比例。这些结果显示：roflupram在pd的细胞模型中具有显著的抗凋亡作用。

(3)roflupram在pd细胞模型中对线粒体膜电位的影响。继而我们考察了roflupram对抗mpp⁺诱导的sh-sy5y细胞损伤的机制。鉴于在pd发病机制中存在线粒体能量代谢障碍，同时mpp⁺也正是针对线粒体来影响能量代谢的。故而我们采用线粒体膜电位的探针tmre考察了roflupram对线粒体膜电位的影响，在线粒体膜电位下降的情况下，其荧光强度亦将显著下降。如图3a及图3b所示，我们发现mpp⁺显著降低了线粒体膜电位(p<0.001)，而roflupram则可以增加模型条件下线粒体膜电位(图3a,图3b,p<0.01)。这一结果说明roflupram在pd模型中可以稳定线粒体膜电位。

(4)roflupram在pd细胞模型中对线粒体来源的活性氧的影响。采用mitosox线粒体超氧化物红色荧光探针来标记线粒体来源的活性氧，活性氧增加的情况下，荧光强度增加，增加的活性氧会攻击细胞膜、细胞内蛋白及核酸，导致细胞的死亡。我们发现mpp⁺极大地增加了细胞内活性氧的水平(p<0.001)，同样，rof处理细胞后，细胞的活性氧的生成显著减少(图4a,图4b,p<0.01)。这一结果说明roflupram在pd模型中可以降低线粒体来源的活性氧，从而保护神经细胞。

综上所述，本研究在细胞中证明roflupram对mpp⁺损伤的神经细胞具有保护作用，其作用可能是通过稳定线粒体膜电位，减少活性氧的生成来发挥的。研究roflupram在pd模型中的神经保护作用，对于寻找新的治疗pd的药物有重要的意义。

实验2.roflupram在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)诱导的pd动物模型中对小鼠运动障碍及多巴胺能神经元的保护作用

一.材料与方法：

1.材料及主要试剂：

1.1实验动物：雄性c57bl/6小鼠，体重22~25g（12周龄），购自南方医科大学实验动物中心。实验动物许可证号：scxkscxkscxk（粤）2016-0041。小鼠放置饲养于实验动物房（24±2℃；湿度：50±10%），遵循昼夜规律，自由水食。实验前适应环境一周。所有动物实验操作实验动物遵守国际实验动物伦理学要求及南方医科大学实验动物福利和伦理管理委员会的相关要求。

1.2主要试剂：mptp、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、多聚甲酸、蔗糖、tritonx-100均为美国sigma公司产品；abc试剂盒购自vector公司；rabbitanti-thantibody购自美国santacruz生物技术公司；dab染料购自北京中杉金桥公司；sds-page凝胶配制试剂盒及ripa裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白marker及ecl发光液购自美国millipore公司；bca定量试剂盒来自美国thermo公司。

二.实验方法：

(1)pd动物模型的建立：将小鼠随机分为4组：溶剂对照(control)组、mptp模型组、roflupram组(1.0mg/kgroflupram＋mptp)、rolipram组(2.5mg/kgrolipram＋mptp)，，每组12只，分别称重并记录体重。rolipram为第一代经典的pde4抑制剂，该化合物的弊端在于容易导致呕吐反应，曾进入临床试验用于抑郁症的治疗，但由于致呕反应，后来中止临床试验，目前作为工具药，用于评价抑制pde4后，动物及细胞的表型变化。在本实验中，rolipram作为对照药使用。实验的第一天，roflupram组和rolipram组小鼠按体重10ml/kg的容积分别灌胃给予相应的药物，灌胃的药物溶解于0.5%cmc-na溶液，溶剂对照组及mptp模型组给予0.5%cmc-na溶液灌胃。实验的第二天至第六天，roflupram组和rolipram组先进行灌胃，其余组灌胃等容积的0.5%cmc-na溶液。1h后mptp组、roflupram组和rolipram组均腹腔注射30mg/kgmptp，溶剂对照组腹腔注射等容量的生理盐水，连续5天。实验第十六天，即mptp末次注射第十天，取各组小鼠进行行为学实验。

(2)爬杆实验（poletest）：实验装置为一根木杆，其顶端固定有小木球（直径为2.5厘米）。实验时，将c57bl/6小鼠放置于小木球上，并开始计时，小鼠的生理反应为顺着木杆向下爬行，其运动功能受损时，爬行时间明显延长。记录的时间包括：小鼠在木杆小球上完成转头朝下动作所用时间；小鼠爬完木杆上半部分所使用的时间；小鼠爬完木杆下半部分所使用的时间。根据小鼠的运动情况予以评分，上述任一动作在3秒内完成的记3分；在6秒内完成的记2分；超过6秒完成的记1分。累计三项得分，并作统计学分析。

(3)滚轴实验(rotarod)：该实验为评价小鼠运动协调能力的经典实验。正式实验前先进行训练，每只小鼠训练5min，使其能够在大小鼠疲劳转棒仪上停留，随后休息5min开始实验，本实验中转棒仪的转速为12rpm。以180秒作为实验终止时间。记录小鼠在疲劳转棒仪上停留时间。实验时，将c57bl/6小鼠放置于正在运转的转棒仪上，开始计时。记录小鼠在转棒上停留的时间作为潜伏期(即第一次掉落的时间)以此表示其运动协调能力。每只小鼠测定3次，每次间隔30min，取平均值。

(4)th的abc染色：在mptp末次注射后第七天，取小鼠进行心脏灌注。操作如下：腹腔注射10%水合氯酸将小鼠麻醉。之后开胸暴露心脏；将灌注针从小鼠的左心室插入主动脉的根部，剪开右心耳。以生理盐水迅速冲出小鼠体内的循环血液。之后缓慢灌注约50ml预冷的4%多聚甲醛，直至小鼠全身僵硬。断头取脑组织，将脑组织浸泡于4%多聚甲酸溶液直至沉底，转移到20%蔗糖溶液中4度过夜，最后转移至30%蔗糖溶液中4度过夜。切片机切取经黑质致密部的35μm的脑片置于24孔板内，用含0.1%的tritonx-100的tbst溶液漂洗1次后，用含0.3%双氧水的tbst溶液处理脑片30min，室温下tbst溶液漂洗脑片3次，每次5min。用3%山羊血清室温孵育脑片1.5h后，用含3%bsa的tbst溶液稀释的一抗（anti-th）抗体4度解育过夜。室湿下加入tbst漂洗脑片3次，每次5min。用含1%bsa的tbs溶液稀释的生物素标记的二抗孵育切片2.5小时。室温静置30min，tbst溶液漂洗3次，每次5min。在abc溶液中室温孵育1小时。tbst溶液漂洗脑片3次，每次5min。在dab中孵育切片2-5min，室温下tbs漂洗脑片后，把脑切片转移至玻片上。之后把切片依次放入50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇中脱水，每次2min，再使用50%：50%的乙醇／二甲苯处理2min、100%二甲苯透明处理3min。最后用中性树脂封片，干燥后，在光学显微镜下观察分析拍照。

(5)蛋白免疫印迹：westernblotting实验按常规使用的方法进行。简言之，试验后，迅速取出脑组织，用预冷的pbs洗去血液后，快速分离出中脑黑质部位，并迅速置干冰中冷冻，以备下一步裂解。组织中加入ripa裂解液，裂解液中预加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，采用超声裂解，整个过程在冰上操作。裂解后的蛋白质样品经高速离心去除不溶物后，采用bca蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，再采用sds上样缓冲液95-100℃变性10min。再用sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离蛋白，转移到pvdf膜上。转膜结束后，采用5%bsa对pvdf膜进行封闭处理，室温封闭2h，再使用特异性抗体(anti-th及anti-gapdh)4℃孵育过夜，使用tbst吸膜3次，每次5min，再在室温条件下孵育二抗2h。最后使用ecl发光液试剂盒进行曝光测定th和gapdh的蛋白水平，。对获得的图片利用imagej软件对印迹进行量化。

(6)统计学处理：所有实验数据都用mean±sd表示，用spss19.0软件分析，组间差异采用单因素方差分析（one-wayanova），方差齐时应用bonferroni进行两两比较分析。动物行为学采用非参数检验(non-parametrickruskal-wallistest)并采用dunn’smultiplecomparisons进行统计分析，用graphpadprism7.0绘制结果图。p<0.05表示有显著性差异。

三.实验结果：

(1)roflupram可显著改善pd模型小鼠的运动能力。通过在c57bl/6小鼠采用腹腔注射mptp(30mg/kg)的方法为目前公认及经典的亚急性帕金森病动物模型。我们采用爬杆实验评价小鼠的运动功能。结果如图5a所示：溶剂对照组小鼠的运动功能没有收到影响，完成三项运动的时间均较少，行为学评分较高。而在mptp模型组，小鼠运动迟缓，三项评分均用时较长，得分较低(p<0.001)，而给予roflupram或rolipram处理后，模型小鼠的运动功能可见明显改善，行为学评分较mptp模型组小鼠高(p<0.001)。这一结果提示：pde4抑制剂roflupram可显著改善pd模型小鼠的运动能力。

(2)roflupram可显著改善pd模型小鼠的运动协调能力。为进一步评价小鼠的运动协调能力，我们采用了转棒试验。小鼠成功造模后，将小鼠置于转速为12rpm的转棒仪上，并开始计时。记录小鼠在转棒上停留的时间作为潜伏期(即第一次掉落的时间)以此表示其运动协调能力。每只小鼠测定3次，每次间隔30min，取平均值。结果见图5b，我们发现溶剂对照组小鼠在转棒仪上停留的时间最长，与溶剂对照组小鼠相比，mptp模型组小鼠的运动协调能力明显下降(p<0.001)，表现为潜伏期明显缩短。与mptp模型组相比,roflupram及rolipram组小鼠在转棒上停留的潜伏期明显延长(p<0.001)。这一结果提示：roflupram具有改善小鼠运动协调能力的作用。

(3)roflupram对mptp诱导中脑黑质多巴胺能神经元丢失的影晌。实验结束后，我们采用abc法检测中脑黑质内残余多巴胺神经元的数目。结果如图6所示：以溶剂对照组小鼠多己胺神经元数目为参照，mptp导致小鼠中脑黑质多巴胺能神经元大量丢失(图6a及图6b)，约为溶剂对照组小鼠的60%左右(p<0.001)；而roflupram可对抗mptp的神经毒性，减少mptp导致的神经元丢失(p<0.05)；小鼠黑质多巴胺能神经元数目与溶剂对照组接近。鉴于中脑黑质多巴胺能神经元在运动功能及运动调节中的关键作用，与pd的发生高度相关；本结果提示roflupram能减少pd病理条件下多巴胺能神经元的死亡，维持动物的运动能力。

(4)roflupram对pd模型小鼠中脑黑质th表达的影晌。th是多巴胺合成的限速酶，pd患者中脑黑质部分的th表达水平显著下降。为评价roflupram对th的影响，我们采用westernblot考察了黑质部位th的蛋白表达水平。结果如图7所示：溶剂对照组小鼠中脑黑质部位th的表达水平较高，而在mptp模型小鼠中，th的表达显著下降(p<0.001)，下降幅度达70%。而给予roflupram及rolipram后，th的表达显著增加(p<0.001)。这一结果提示：roflupram在pd模型中可显著th的表达，利于多巴胺的合成。

综上所述，本研究在pd的动物模型中证明roflupram对mptp诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具有显著的保护作用，可减少多巴胺能神经元的丢失，改善pd模型小鼠的运动及运动协调能力。提示roflupram具有极大的改善pd运动障碍及临床应用价值。

本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。