一种丝素蛋白止血材料及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料和生物医疗
技术领域：
，具体涉及一种丝素蛋白止血材料的制备方法以及采用该制备方法制备得到的丝素蛋白止血材料。
背景技术：
：开发高效、快速、安全、经济的止血材料是临床手术、急救中急需解决的关键难点。现有的医用止血材料主要有壳聚糖、纤维胶原、纤维蛋白胶、氧化纤维素、海藻酸钙纤维素、明胶海绵等。但是这些止血材料都存在生物相容性不高、合成复杂、价格昂贵、止血速度不快、易引发感染有等缺点。开发一种具有良好生物相容性、价格低廉、止血性能优异的材料具有很大的社会效益。丝素蛋白是一种天然纤维材料，具有人体中必要的数种氨基酸，对机体无毒、无刺激作用，可生物降解；此外丝素蛋白还可以根据需要加工成各种形态的材料，通过不同的化学试剂改性，具有很大的可塑性，广泛应用于纺织行业、生物医药领域。现有的丝素蛋白止血材料，多采用胶原蛋白以及壳聚糖进行研制，并在快速止血性能方面存在缺陷，因此在实际生活中并没有广泛应用，研究丝素蛋白快速止血材料具有现实意义。目前该领域中，2016年，王鑫等人用浓度为10％、20％、40％的cacl2溶液对丝素进行微溶处理，而后丝素在-80℃冷冻2h、4h、6h、12、24h、48h后烘干或冷冻干燥。通过改性提高丝素的吸水性，同时添加促凝血因子来提高丝素的止血性能，同时对所得材料的生物相容性、体内降解性能进行研究，研究发现制得的丝素止血纱其止血性能优于医用纱布。但其体内降解性差，快速止血性能存在缺陷。如专利申请号cn201710088690.4，名称为“丝素蛋白止血材料及其制备方法”的发明专利中公开了将丝素蛋白溶液与聚乙二醇溶液以体积比10:0.25-10:3的比例相互混合，经冷冻干燥制得丝素蛋白止血材料；该丝素蛋白止血材料，吸水性好、与创口结合紧密不易掉落，但制备过程中将丝素蛋白与聚乙二醇溶液混合中容易将丝素蛋白完全诱导形成稳定的β-折叠结构，不具有组织粘附特性，影响止血效果。技术实现要素：有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种丝素蛋白止血材料的制备方法，以及采用该制备方法制备得到的丝素蛋白止血材料。为达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：一种丝素蛋白止血材料的制备方法，包括以下步骤：(1)向丝素蛋白水溶液中加入光敏剂核黄素，混合均匀得到混合液；(2)向所述混合液中持续通入氧气，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态；(3)将氧饱和的所述混合液倒入透明模具中并进行冷却；(4)用紫外光照射所述混合液，得到交联的丝素蛋白水凝胶，控制紫外光照射过程中所述混合液的温度为0～8℃，可以通过将混合液放置在冰浴条件下实现；(5)将所述丝素蛋白水凝胶从模具中取出并进行干燥，得到丝素蛋白干凝胶；(6)将所述丝素蛋白干凝胶粉碎成粉末，得到丝素蛋白止血材料。根据本发明的一些优选方面，步骤(1)中所述丝素蛋白水溶液的浓度为15g/l～30g/l；所述混合液中核黄素的浓度为0.1mmol/l～0.5mmol/l。核黄素参与体内生物氧化与能量代谢，与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢有关，可提高肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育，维护皮肤和细胞膜的完整性，具有保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能。加入的核黄素较多，一方面能够减少光照的时间，另一方面，残留的核黄素可以提高材料吸血后的组织愈合能力。根据本发明的一些优选方面，步骤(3)中所述透明模具中的混合液的深度为10mm～30mm。降低混合液的深度可使交联点分布更均匀，限制结晶结构的产生。根据本发明的一些优选方面，步骤(4)中紫外光照射的参数为：紫外光照射的距离为10cm～20cm；紫外光照射的时间为5min～30min。根据本发明的一些优选方面，步骤(4)中所述紫外光照射的参数为：步骤(4)中的紫外光为功率50w～500w、波长350～400nm的紫外灯发出的紫外光。根据本发明的一些优选方面，步骤(5)中干燥的环境为温度20～30℃、相对湿度10～50％的恒温恒湿环境。根据本发明的一些优选方面，步骤(6)中所述粉末的粒径为0.1～1mm。将丝素蛋白干凝胶粉碎后制成粒径较小的粉体可增大材料比表面积，提升材料快速吸血能力。本发明还提供了一种采用如上所述的制备方法制备得到的丝素蛋白止血材料，该所述丝素蛋白止血材料的吸血倍率为7.5～11.5，凝血时间为55～80s。吸血倍率为单位质量(1克)的丝素蛋白材料吸血饱和后增加的质量与原干燥质量之比；凝血时间是指血液离开血管，在体外发生凝固的时间。本发明的原理是：核黄素在紫外光的照射下，发生能量的转移生成单线态氧为主的活性氧自由基，活性氧自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的酪氨酸残基基团产生化学交联，从而凝胶化，将水凝胶干燥剪切粉碎成粉末状，得到止血材料。本发明在冰浴的低温环境中，向丝素蛋白溶液中加入核黄素溶液，并预先通入氧气使混合液氧饱和，利用核黄素的光敏性，降低混合液的深度，使其在紫外光下快速交联固化，制备过程简单方便，时间短，效率高，可充分保持丝素本身的生物相容性。由于混合液的深度浅，制备形成的粉末，比表面积大，不仅具有与水快速结合再溶胀的性能，同样具有快速吸血的性能。粉末状凝胶内部具有较大的孔隙率，保证了该止血材料的高吸血倍率和吸血速度。制得的丝素蛋白止血材料可达到物理封堵血管和止血目的，止血性能优良。含有丝素蛋白和核黄素的混合液在光固化的同时也会吸收紫外光放出的大量热能，混合液的温度过高会促使分子构象发生转变，产生部分β-折叠结构，通过提高照射距离，且在冰浴的低温环境下交联可有效降低反应温度，使形成的凝胶保持混合液中的无规卷曲结构，从而有效限制结晶结构的产生，大大提升材料的溶胀能力。降低混合液的深度可使交联点分布更均匀，限制结晶结构的产生。由于采用了以上的技术方案，本发明与现有技术相比具有如下的有益之处：本发明的制备方法通过在低温环境下交联可有效降低反应温度，使形成的凝胶保持混合液中的无规卷曲结构，从而有效限制结晶结构的产生，大大提升材料的溶胀能力以及快速吸血的性能；制备过程中，只加入了核黄素，因此该丝素蛋白止血材料具有良好的生物相容性和可降解性；丝素蛋白止血材料为粉末状，比表面积大，不仅具有与水快速结合再溶胀的性能，同样具有快速吸血的性能；丝素蛋白材料为粉末状，粉末状凝胶内部具有较大的孔隙率，保证了该止血材料的高吸血倍率和快吸血速度。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明优选实施例2中制备的丝素蛋白止血材料的凝血照片一；图2为本发明优选实施例2中制备的丝素蛋白止血材料的凝血照片二。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1丝素蛋白溶液的制备在煮沸的4l去离子水中，加入称取好的3g无水nahco3和1g无水na2co3，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10min用玻璃棒搅拌一次，30min后用去离子水洗涤干净，再重复上述操作3次；充分洗净后，将蚕丝扯开铺平，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40min，充分冷却后装入透析袋中密封透析，低温下在去离子水中透析3～4d，透析完成后，将得到的丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。实施例2丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为15g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.1mm。核黄素在紫外光的照射下，发生能量的转移生成单线态氧为主的活性氧自由基，活性氧自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的酪氨酸残基基团产生化学交联，从而凝胶化。(2)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气15min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(3)将氧饱和的混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为10mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为4℃。由于混合液深度浅，制备形成的粉末，比表面积大，不仅具有与水快速结合再溶胀的性能，同样具有快速吸血的性能。且混合液深度较浅可使交联点分布更均匀，限制结晶结构的产生。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为4℃，紫外光照射的参数为：光源为功率300w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为10cm；紫外光照射的时间为15min。含有丝素蛋白和核黄素的混合液在光固化的同时也会吸收紫外光放出的大量热能，混合液温度过高会促使分子构象发生转变，产生部分β-折叠结构，通过提高照射距离，且在冰浴的低温环境下交联可有效降低反应温度，使形成的凝胶保持混合液中的无规卷曲结构，从而有效限制结晶结构的产生，大大提升材料的溶胀能力。降低混合液深度可使交联点分布更均匀，限制结晶结构的产生。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在温度20℃、湿度为40％的恒温低湿环境中鼓风干燥8h，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.5mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。粉末状凝胶内部具有较大的孔隙率，保证了该止血材料的高吸血倍率和吸血速度。制得的丝素蛋白止血材料可达到物理封堵血管和止血目的，止血性能优良。且将丝素蛋白干凝胶粉碎后制成粒径较小的粉体可增大材料比表面积，提升材料快速吸血能力。本实施例的制备方法通过在冰浴的低温环境下交联可有效降低反应温度，使形成的凝胶保持混合液中的无规卷曲结构，从而有效限制结晶结构的产生，大大提升材料的溶胀能力以及快速吸血的性能；制备过程中，只加入了核黄素，因此该丝素蛋白止血材料具有良好的生物相容性和可降解性；丝素蛋白止血材料为粉末状，比表面积大，不仅具有与水快速结合再溶胀的性能，同样具有快速吸血的性能；丝素蛋白材料为粉末状，粉末状凝胶内部具有较大的孔隙率，保证了该止血材料的高吸血倍率和吸血速度。实施例3丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为15g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.2mm。(2)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气10min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(3)将氧饱和的混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为15mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为6℃。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为6℃，紫外光照射的参数为：光源为功率100w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为15cm；紫外光照射的时间为20min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在温度25℃、湿度为30％的恒温低湿环境中鼓风干燥5h，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.4mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例4丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为20g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.3mm。(2)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气8min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(3)将氧饱和的混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为18mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为8℃。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为8℃，紫外光照射的参数为：光源为功率50ww、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为20cm；紫外光照射的时间为22min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在温度28℃、湿度为30％的恒温低湿环境中鼓风干燥2h，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.3mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例5丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为20g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.4mm。(2)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气13min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(3)将氧饱和的混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为20mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为2℃。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为2℃，紫外光照射的参数为：光源为功率150w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为18cm；紫外光照射的时间为17min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在温度30℃、湿度为35％的恒温低湿环境中鼓风干燥3h，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.6mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例6丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为20g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.5mm。(2)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气9min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(3)将氧饱和的混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为20mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为0℃。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为0℃，紫外光照射的参数为：光源为功率250w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为12cm；紫外光照射的时间为15min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在温度27℃、湿度为45％的恒温低湿环境中鼓风干燥8h，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.7mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例7丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为30g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.1mm。(2)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气11min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(3)将氧饱和的混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为14mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为4℃。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为4℃，紫外光照射的参数为：光源为功率300w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为14cm；紫外光照射的时间为20min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在温度23℃、湿度为38％的恒温低湿环境中鼓风干燥8h，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.2mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例8丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为30g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.2mm。(2)将混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为10mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为6℃。(3)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气15min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为6℃，紫外光照射的参数为：光源为功率500w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为16cm；紫外光照射的时间为20min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在恒温低湿环境中干燥20h成膜，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.2mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例9丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为30g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.3mm。(2)将混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为10mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为8℃。(3)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气15min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为8℃，紫外光照射的参数为：光源为功率400w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为20cm；紫外光照射的时间为20min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在恒温低湿环境中干燥20h成膜，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.2mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例10丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为30g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.4mm。(2)将混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为10mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为4℃。(3)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气15min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为4℃，紫外光照射的参数为：光源为功率450w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为20cm；紫外光照射的时间为30min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在的恒温低湿环境中干燥20h成膜，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.3mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。实施例11丝素蛋白止血材料的制备(1)用去离子水调节实施例1中的纯丝素蛋白溶液的浓度为30g/l，得到丝素蛋白水溶液。向丝素蛋白水溶液中加入核黄素，混合均匀得到混合液，混合液中核黄素的浓度为0.5mm。(2)将混合液倒入透明模具如烧杯中，使得混合液的深度为10mm，并放入冰浴中冷却，冰浴温度为4℃。(3)利用制氧机制取纯氧，向混合液中持续通入氧气15min，保持所述混合液中氧气分压处于饱和状态。(4)将混合液在冰浴的低温环境内用紫外光照射，得到交联的丝素蛋白水凝胶。冰浴温度为4℃，紫外光照射的参数为：光源为功率400w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为10cm；紫外光照射的时间为20min。(5)将丝素蛋白水凝胶从模具中取出，并在恒温低湿环境中干燥20h成膜，得到丝素蛋白干凝胶。(6)将丝素蛋白干凝胶粉碎成粒径为0.3mm的粉末，得到丝素蛋白止血材料。对比例1本对比例与实施例2中的制备过程基本一致，区别点在于本对比例中的紫外光照射环境为室温，即在紫外光照射时不进行降温处理。对比例2本对比例与实施例2中的制备过程基本一致，区别点在于本对比例中的紫外光照射时保持紫外光与反应液之间的距离在5cm以内。对比例3本对比例与实施例2中的制备过程基本一致，区别点在于本对比例中在进行紫外光照射时透明模具内反应液的深度为50mm。实施例6测试与分析对实施例2-11和对比例1-3制备得到的丝素蛋白止血材料测试吸血倍率、凝血时间。其中，吸血倍率的测试方法为单位质量(1克)的丝素蛋白材料吸血饱和后增加的质量与原干燥质量之比；凝血时间测量的是丝素蛋白材料吸血饱和后血液发生凝固的时间。结果见表1。表1实验结果样品吸血倍率凝血时间(s)实施例211.158实施例38.963实施例48.669实施例58.379实施例67.980实施例79.859实施例88.767实施例99.371实施例1010.855实施例118.568对比例14.590对比例26.685对比例33.598从表1可以看出实施例2-11制备得到的丝素蛋白止血材料与对比例1-3的丝素蛋白止血材料相比，实施例2-11中由于在紫外线照射时将混合液置于冰浴的低温环境下，且拉长了紫外光照射的距离、减薄了反应液的深度，使得得到的丝素蛋白止血材料有效限制结晶结构的产生，为无规卷曲结构，具有很好的吸血倍率以及较快的吸血速度。本发明通过以丝素蛋白为原料制备具有快速止血性能的丝素蛋白止血材料，在丝素蛋白水溶液中加入核黄素，持续通入氧气，并在冰浴的低温环境内用紫外光照射，形成水凝胶，水凝胶干燥并粉碎成粉末，形成丝素蛋白止血材料，制备过程简单方便，加入的核黄素含量极低，可充分保持丝素本身的生物相容性，制得的丝素蛋白止血材料可达到物理封堵血管和止血目的，止血性能优良；通过在冰浴的低温环境下交联可有效降低反应温度，使形成的凝胶保持混合液中的无规卷曲结构，从而有效限制结晶结构的产生，大大提升材料的溶胀能力以及快速吸血的性能。制备得到的丝素蛋白止血材料为粉末状，比表面积大，不仅具有与水快速结合再溶胀的性能，同样具有快速吸血的性能。粉末状凝胶内部具有较大的孔隙率，保证了该止血材料的高吸血倍率和吸血速度。因此该丝素蛋白止血材料具有瞬时溶胀、吸血倍率高、快速止血、降解性好的性能，可用于伤口和组织修复的止血材料。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12