一种提高款冬花中异槲皮苷含量的方法与流程

本发明属于中药炮制技术领域，具体涉及一种提高款冬花中异槲皮苷含量的方法。

背景技术：

款冬花为菊科植物款冬(tussilagofarfaral.)的干燥花蕾,又称冬花，主要分布在河北、山西、内蒙古、陕西等地。款冬花始载于《神农本草经》，被列为中品，谓其“主咳逆上气,善喘,喉痹,诸惊痫、寒热邪气”。款冬花为止咳平喘方剂中的常用中药，具有润肺下气、止咳化痰的功效，主要用于治疗新久咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血等症。目前，款冬花已知的化合物类型主要有倍半萜、黄酮、酚酸、生物碱、挥发油等，现代药理实验表明，款冬花具有止咳祛痰平喘、抗血小板活化因子、抗炎、升高血压、抗氧化、神经保护等作用。款冬花中所含的吡咯里西啶生物碱具有一定肝毒性，可引起肝巨细胞症、肝细胞出血性坏死及静脉闭塞等证，使款冬花的临床使用受到一定限制。

款冬花的炮制方法主要有蜜炙法和甘草制法。蜜款冬花最早文献记载见于明代《医宗必读》，而款冬花的甘草制法则收载于较之更早的《雷公炮炙论》。甘草本身具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛、清热解毒、调和诸药的功效，款冬花经甘草制后不仅能缓和药性、降低毒性，更长于增强祛痰止咳作用。

目前款冬花的甘草制法主要是采用传统的方法炮制，这种炮制方法虽然操作简单，但处理时间长，生产效率低，工艺参数不易控制，且操作时烟尘大，容易污染工作环境，而且最主要的是甘草制过程中款冬花的有效成分含量低。

技术实现要素：

为了克服传统方法中款冬花有效成分含量低的问题，本发明提供了一种能够有效提高款冬花中异槲皮苷含量的方法，其操作简单，能够使异槲皮苷含量明显提高，而且同时能够使款冬酮、芦丁、醇浸出物的含量相对提高。

本发明所采用的技术方案是：

一种提高款冬花中异槲皮苷含量的方法，其由以下步骤组成：

1)取甘草汁，加入净款冬花内拌匀，闷润至透；

2)将闷润好的款冬花以一层厚度平铺于微波炉，加热使干燥，取出晾凉，使款冬花中异槲皮苷含量提高。

进一步限定，所述步骤1)中甘草的用量为款冬花质量的5％-20％，甘草汁的浓度为0.05-0.2g/ml。

进一步限定，所述步骤1)中款冬花的闷润时间为2-6h。

进一步限定，所述步骤2)中微波处理的条件为：微波功率为50～200w，火力为20％-100％，时间为80-120s。

进一步限定，所述步骤2)中微波处理的条件为：先将火力设定至20％-40％，处理10s，之后调整火力至80％-100％，处理80-100s，再调整火力至20％-40％处理10s。

进一步限定，所述款冬花中异槲皮苷的含量提高至1.44％。

本发明的提高款冬花中异槲皮苷含量的方法主要是将款冬花先用甘草汁闷润，后用微波辅助分阶加热处理，使甘草中的皂苷类成分在频率高、波长短的微波干扰下能够快速渗入款冬花起到增溶作用，使款冬花中的异槲皮苷含量提高，同时还能使款冬酮、芦丁、异槲皮苷和醇浸出物的含量分别能够达到0.28％、0.7％、1.44％和25.6％，使款冬花中总生物碱含量降低至0.0021％，且处理工艺合理、运行稳定。

附图说明

图1为芦丁、异槲皮苷对照品(a)和甘草制款冬花(b)的hplc图；注：1为芦丁，2为异槲皮苷。

图2为款冬酮对照品(a)和甘草制款冬花(b)的hplc图，注：1为款冬酮。

具体实施方式

现结合实施例和实验数据对本发明的技术方案进行进一步说明。

实施例1

本实施例的提高款冬花中异槲皮苷含量的方法，由以下步骤组成：

1)先用浓度为0.15g/ml的甘草汁将款冬花闷润4.5h至润透，甘草的用量为款冬花质量的15％。

2)将闷润好的款冬花以一层厚度(大约1cm)平铺于微波炉内，微波输出功率为100w，100％火力微波加热83s，使干燥，取出晾凉，使款冬花中异槲皮苷含量提高。

本实施例的款冬酮、总生物碱、芦丁和异槲皮苷的含量分别为0.2752％、0.0019％、0.68％和1.47％。

实施例2

本实施例的提高款冬花中异槲皮苷含量的方法，由以下步骤组成：

1)先用浓度为0.05g/ml的甘草汁将款冬花闷润6h至润透，甘草的用量为款冬花质量的5％。

2)将闷润好的款冬花以一层厚度平铺于微波炉，微波输出功率为50w，先将火力设定至20％处理10s，之后调整火力至100％处理80s，再调整火力至40％处理10s，使干燥，取出晾凉，使款冬花中异槲皮苷含量提高。

本实施例的款冬酮、总生物碱、芦丁和异槲皮苷的含量分别为0.2742％、0.0018％、0.67％和1.46％。

实施例3

本实施例的提高款冬花中异槲皮苷含量的方法，由以下步骤组成：

1)先用浓度为0.2g/ml的甘草汁将款冬花闷润2h至润透，甘草的用量为款冬花质量的20％。

2)将闷润好的款冬花以一层厚度平铺于微波炉，设定微波输出功率为150w，先将火力设定至40％处理10s，之后调整火力至80％处理100s，再调整火力至20％处理10s，使干燥，取出晾凉，使款冬花中异槲皮苷含量提高。

本实施例的款冬酮、总生物碱、芦丁和异槲皮苷的含量分别为0.2732％、0.0020％、0.71％和1.43％。

实施例4

本实施例的提高款冬花中异槲皮苷含量的方法，由以下步骤组成：

1)先用浓度为0.18g/ml的甘草汁将款冬花闷润3h至润透，甘草的用量为款冬花质量的18％。

2)将闷润好的款冬花以一层厚度平铺于微波炉，设定微波输出功率为200w，先将火力设定至20％处理10s，之后调整火力至100％处理90s，再调整火力至40％处理10s，使干燥，取出晾凉，使款冬花中异槲皮苷含量提高。

本实施例的款冬酮、总生物碱、芦丁和异槲皮苷的含量分别为0.2735％、0.0020％、0.69％和1.45％。

为了验证本发明的技术效果，申请人按照下述测定方法对本发明方法处理后的款冬花中的芦丁、异槲皮苷、款冬酮以及总生物碱含量进行测定，具体如下：

1、芦丁、异槲皮苷的定量测定

1.1色谱条件hypurityc18色谱柱(250×4.6mm，5μm)，以甲醇为流动相a，乙腈为流动相b，0.1％甲酸溶液为流动相c，按表1进行梯度洗脱；检测波长255nm，柱温25℃，流速1ml·min^-1，进样量10μl。芦丁、异槲皮苷混合对照品及甘草汁闷润、晾干后的款冬花的hplc图谱见图1。图1中a为芦丁、异槲皮苷混合对照品，b为本发明的方法处理后的款冬花样品。结果表明，样品中其它成分对芦丁、异槲皮苷的测定无干扰。

表1样品梯度洗脱程序

1.2对照品溶液制备分别取芦丁、异槲皮苷对照品6.3mg、5.8mg，精密称定，至50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别制成浓度为126、116μg/ml的对照品溶液。分别精密量取芦丁、异槲皮苷对照品溶液2.5ml至5ml容量瓶中，得到浓度分别为63μg/ml、58μg/ml的芦丁、异槲皮苷混合对照品溶液。

1.3供试品溶液制备取款冬花粉末(过3号筛)0.3g，精密称定，精密加入90％甲醇35ml，超声处理45min，取出，90％甲醇补足失重，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过,即得。

1.4标准曲线绘制取稀释后的对照品溶液，依次取2、4、6、8、10、12、14μl进样，以进样量为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得芦丁回归方程y＝1623x+70.64，r＝0.9999(n＝7)，结果表明，芦丁在0.126-0.882μg与峰面积有良好的线性关系；得异槲皮苷回归方程y＝2387x+46.37，r＝0.9999(n＝7),结果表明，异槲皮苷在0.116-0.812μg与峰面积有良好的线性关系。

1.5精密度实验取芦丁、异槲皮苷混合对照品溶液，按照上述相同的色谱条件，连续进样6次，得芦丁、异槲皮苷峰面积的rsd分别为0.48％，0.69％，表明仪器精密度良好。

1.6稳定性实验按照上述1.3项下方法制备供试品溶液(响应面实验3号样品)，分别在0、4、8、12、24h按照上述相同的色谱条件测定，芦丁、异槲皮苷峰面积的rsd分别为0.58％、0.95％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

1.7重复性实验取同一样品6份(响应面实验3号样品)，每份0.3g，按照上述1.3项下方法制备供试品溶液，按照1.1项下色谱条件测定芦丁、异槲皮苷峰面积，rsd分别为1.02％、1.18％，表明本实验方法重复性良好。

1.8加样回收率实验取已测定芦丁、异槲皮苷含量的样品6份，每份0.3g，分别加入一定量芦丁、异槲皮苷对照品溶液，按照上述1.3项下方法制备供试品溶液并测定峰面积，计算其含量及回收率，结果平均回收率分别为98.12％、96.84％，rsd分别为1.51％、1.84％，表明本方法回收率良好。

2、浸出物的定量测定

按照《中国药典》2015版第四部2201(浸出物测定法)项下热浸法依法测定醇溶性浸出物。

3、总生物碱的定量测定

3.1对照品溶液制备取氧化苦参碱4.72mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀释至刻度，得浓度为47.2μg/ml的对照品溶液。

3.2供试品溶液制备称取款冬花样品粉末(过四号筛)5.0g，加入150ml90％乙醇，称定重量，回流3h，放冷，用90％乙醇补足减失的重量，滤过，回收至无醇味，加入1mol/l的盐酸调节ph至2.0-3.0，加适量石油醚脱脂2次，脱脂后的酸水液加5％氢氧化钠溶液调ph＝10，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷液，加水洗涤，取二氯甲烷层，即得总生物碱，用二氯甲烷定容至10ml，得供试品溶液。

3.3标准曲线绘制分别精密吸取氧化苦参碱对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0ml，置于分液漏斗中，加入0.05％溴甲酚绿溶液1.5ml，振摇后静置，取二氯甲烷层于10ml容量瓶中，加二氯甲烷定容，30min内于415nm处测定吸光度。以氧化苦参碱浓度(x)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y＝0.059x－0.026，r＝0.9998(n＝7)。结果表明，总生物碱在4.72-18.88μg/ml与吸光度呈良好的线性关系。

3.4精密度实验取氧化苦参碱对照品溶液，按上述3.3的方法测定y值，重复测定6次，rsd为0.42％，表明本方法精密度良好。

3.5稳定性实验取同－供试品溶液(响应面实验3号样品)，按3.3的方法，分别在0、10、20、30、40min测定y值，rsd为0.56％，表明供试品溶液在40min内基本稳定。

3.6重复性实验取同一样品6份(响应面实验3号样品)，每份5g，按3.2项下方法制备供试品溶液，每份精密吸取3ml，按3.3项下方法测定y值，rsd为2.24％，表明本方法重复性良好。

3.7加样回收率实验取已知总生物碱含量的样品6份，每份5g，分别加入一定量氧化苦参碱对照品溶液，按3.2项下方法制备供试品溶液并测定y值，计算其量及回收率，结果平均回收率为97.02％，rsd为1.18％，表明本方法回收率良好。

4、款冬酮的定量测定

4.1色谱条件hypurityc18色谱柱(250×4.6mm，5μm),流动相为甲醇-水(85：15)，检测波长220nm，流速1.0ml/min，进样量10μl，柱温25℃。款冬酮对照品及本发明的方法处理后的款冬花样品的hplc图谱见图2，图2中a为款冬酮对照品，b为本发明的方法处理后的款冬花样品。结果表明，样品中其它成分对款冬酮的测定无干扰。

4.2对照品溶液制备取款冬酮对照品3.1mg，精密称定，加流动相超声溶解，定容至25ml的容量瓶，制成浓度为124μg/ml的对照品溶液。

4.3供试品溶液制备取款冬酮样品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，称定重量，超声处理(功率200w，频率40khz)1h，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.4标准曲线绘制取4.2项下对照品溶液，浓度稀释一半，依次取2、4、6、8、10、12μl进样，以进样量为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到回归方程y＝2595x+2.053，r＝1(n＝6)，结果表明，款冬酮在0.124-0.744μg与峰面积有良好的线性关系。

4.5精密度实验取款冬酮对照品溶液，按照4.1项下色谱条件，连续进样6次，得款冬酮峰面积的rsd为0.48％，表明仪器精密度良好。

4.6稳定性实验按照4.3项下方法制备供试品溶液(响应面实验3号样品)，分别在0、4、8、12、24h按照4.1项下色谱条件测定，峰面积的rsd为0.78％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

4.7重复性实验取同一样品6份(响应面实验3号样品)，每份1g，按照4.3项下方法制备供试品溶液，按4.1项下色谱条件测定款冬酮峰面积，rsd为1.23％，表明本实验方法重复性良好。

4.8加样回收率实验取已测定款冬酮含量的样品6份，每份1g，分别加入一定量款冬酮对照品溶液，按4.3项下方法制备供试品溶液并测定峰面积，计算其含量及回收率，结果平均回收率为96.43％，rsd为1.16％，表明本方法回收率良好。

用上述的测定方法分别对本发明的方法所处理的款冬花中的款冬酮、异槲皮苷、芦丁等有效成分以及总生物碱的含量进行测定，并以步骤(1)甘草汁闷润后炒干的款冬花以及生品款冬花的成分测定结果进行对比，结果如表2所示。

表2为本发明异槲皮苷等有效成分含量与甘草汁闷润炒干品、生品的测定结果对比(n＝3)

从上述表2可以看出，本发明的方法处理后款冬花中的异槲皮苷的含量明显高于甘草汁闷润后炒干的款冬花，也远高于生品中的异槲皮苷含量，说明本发明的方法优势在于甘草汁渗入款冬花中，在频率高、波长短的微波干扰下，甘草所含皂苷类成分进入款冬花组织细胞内溶解有效成分，起到增溶作用而使异槲皮苷等成分的含量增加。

从上述表2的数据对比同时也能够看出，本发明不仅使异槲皮苷的含量提高，款冬酮、芦丁和醇浸出物的含量也均有提高，总生物碱含量降低，说明本发明的方法不仅能够使异槲皮苷的含量增加，也能够使款冬酮、芦丁和醇浸出物含量增加。