一种大麻二酚纳米白蛋白的制备方法及运用与流程

本发明属于医药制剂领域，具体涉及到一种大麻二酚纳米白蛋白的制备方法及运用。

背景技术：

工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻，我国将工业大麻称为汉麻(hemp)，是大麻科(cannabinaceae)大麻属(cannabis)1年生草本植物。目前从植物大麻中分离出的大麻素(cannabinoids，cbs)已有一百多种，主要包括四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，thc)、大麻二酚(cannabidiol，cbd)、大麻酚(cannabinol，cbn)及大麻萜酚(cannabichromene，cbc)等，其中thc及cbd含量最高。四氢大麻酚(thc)因具有致幻成瘾性，限制了其药用领域价值的发展。大麻二酚与四氢大麻酚活性作用截然不同，是一种非成瘾性活性成分，不具有神经毒性。具有保护神经的作用，无成瘾性且具有抗癫痫、抗痉挛、抗风湿关节炎及抗焦虑的作用，在医药学等领域引起广泛关注而成为近年的研究热点。

大麻二酚属于脂溶性化合物，由于不溶于水，该化合物很容易被肝脏破坏、分解或清除，导致向受试者的递送减少，生物利用度大大降低。如果不能解决水溶性的问题，就不能填加到饮料中，也很难开发出注射液制剂。在提高大麻二酚生物利用度上，有多篇相关专利报道。例如，专利cn1688290a、cn101516333a公开了一种粘膜给药的大麻素类液体制剂和水性屈大麻酚制剂的制备方法，主要是通过将大麻二酚溶解到有机溶剂中，加入助溶剂后，制成喷雾剂通过口腔粘膜表面给药或口服剂口服给药；专利cn101132781a公开了一种在室温下稳定的屈大麻酚剂型，主要是通过将分散在油基载体中的大麻二酚包裹在硬明胶胶囊内。这些方法只改变了大麻二酚的给药途径，并没有从根本上改变水溶性的问题。所以增加大麻二酚的水溶性，是开发大麻二酚药物至关重要的途径。

技术实现要素：

为针对技术背景所述的技术问题，本发明是将大麻二酚（cbd）及白蛋白通过高压均质技术，制成水溶性cbd白蛋白纳米粒。该技术能有效改善cbd的水溶性和生物相容性，使得cbd的运用范围得到很大扩展。cbd白蛋白纳米粒可以运用于药品，制成口服剂、针剂、固体胶囊剂、片剂、栓剂，也可以用于食品添加的任何剂型。

本发明的具体步骤如下：

（1）称取cbd粉末加入适量有机溶剂中，充分搅拌溶解，得到含cbd的有机相。

（2）称取白蛋白溶于适量去离子水中，搅拌、加微热使其充分溶解，得白蛋白水溶液。调节白蛋白水溶液的ph值6.0，加入适量有机溶剂，得到水相。

（3）在高速搅拌下，将有机相缓慢滴加入水相中，搅拌一定时间，制得水包油型乳状溶液。

（4）将水包油型乳状溶液转移至高压微射流纳米分散仪中进行高压均质。

（5）均质完成后，使用旋转蒸发仪浓缩，除去有机溶剂。

（6）低温冷冻干燥，即得大麻二酚纳米白蛋白。

所述步骤（1）中，有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈或其中某几种的混合溶剂；优选的，有机溶剂是乙醇。

所述步骤（2）中，白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白；优选白蛋白使用牛血清白蛋白；白蛋白水溶液的浓度，按照质量百分比为1～6%，优选的质量百分比为4%；有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈或其中某几种的混合溶剂。优选有机溶剂是乙醇；有机溶剂的加入量是白蛋白水溶液质量的1～4%，优选质量百分比1%。

所述步骤（3）中，按体积比，油相:水相＝1:(8～12)。更优选的，油相:水相＝1:10；高速搅拌转速5000～10000r/min；搅拌时间0.5～5h。

所述步骤（4）中，高压均质压力为1000bar，均质次数7～16次。优选均质次数为10次。

所述步骤（5）中，旋转蒸发真空度-0.05～-0.1mpa,温度25～45℃。

所述步骤（6）中，低温冷冻干燥在冷冻干燥机中进行，干燥时间36～72h。

本发明方法的优点和技术效果：

（1）该发明把不溶于水的大麻二酚在未改变分子结构的情况下，将cbd和白蛋白通过高压均质技术，制成水溶性cbd白蛋白纳米粒。使cbd分子的水溶性得到改变，有利于cbd的释放和代谢。

（2）利用白蛋白制备的水溶性包合物，具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点。同时因为白蛋白是人体内源性物质，具有良好的稳定性，不会因人体内环境的变化或免疫反应而变性或降解。

（3）本发明制备的cbd白蛋白纳米粒，制备工艺简单，有机溶剂用量少且无残留，制剂安全性好，成本低，易工业化。

（4）将大麻二酚包埋做成cbd白蛋白纳米粒后，该化合物的使用范围得到很大扩展；可以做成口服剂、针剂、固体胶囊剂、片剂、栓剂，也可以用于食品添加的任何剂型；可以配制液体饮料，也可以包装成固体饮料。

附图说明

图1是本发明的标准品cbd液相谱图。

图2是本发明cbd的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

一种大麻二酚纳米白蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）准确称取2gcbd粉末加入10g乙醇中，充分搅拌溶解，得到含cbd的有机相。

（2）准确称取4.76g白蛋白溶于100g去离子水中，搅拌、加微热使其充分溶解，得白蛋白水溶液。滴加1mol/l的盐酸，调节白蛋白水溶液的ph值6.0，加入1g乙醇，搅拌混合均匀，得到水相。

（3）将上述水相置于30℃水浴锅中，机械搅拌，转速为5000r/min。待温度稳定后，将有机相缓慢滴加入水相中，充分搅拌3h时间，制得水包油型乳状溶液。

（4）将水包油型乳状溶液转移至高压微射流纳米分散仪中进行高压均质。均质压力为1000bar，均质次数为10次。

（5）均质完成后，使用旋转蒸发仪浓缩，旋转蒸发真空度-0.1mpa，温度30℃。

（6）将浓缩物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，干燥时间36h，即得cbd白蛋白纳米粒。

实施例2

（一）大麻二酚纳米白蛋白包封率的测定

取上述大麻二酚纳米白蛋白10g，加入25ml甲醇破乳，0.22μm滤膜过滤，取少许滤液测定纳米白蛋白的总cbd含量w总。另取10ml滤液于超滤离心管内，以4000r/min离心20min，分离白蛋白和游离cbd，取外管溶液，测定游离cbd的含量w游。按下式计算包封率：

y包封率＝(1－w游/w总)×100％。

（二）高效液相色谱检测方法

1、色谱条件

agilent1260高效液相色谱仪

色谱柱：c184.6×150mm×4μm；

流动相：甲醇-水-四氢呋喃=71:24:5（体积比）；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃

检测波长：228nm；

进样量：10μl

保留时间：12.322min；

cbd对照品液相色谱图见图1。

2、标准曲线的建立

将cbd标准物质（1mg·ml^-1）转移至10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得cbd溶液浓度100μg·ml^-1；移液管移取适量置于容量瓶中，甲醇稀释定容，得40、20、10、8、4、2、1、0.8、0.4、0.2、0.1μg·ml^-1不同浓度梯度的cbd溶液。；利用上述检测条件，在228nm测定不同浓度的cbd溶液吸收峰面积a，以浓度c(μg·ml^-1)为横坐标，峰面积a为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，并计算相关系数。结果见图2。线性结果显示，cbd在0.1～100μg·ml^-1浓度范围内，线性关系良好(y=42.31x+8.25，r²＝0.99989)。

（三）正交实验的设计

通过实验可知，有机溶剂种类、油相与水相的体积比、均质次数是形成大麻二酚纳米白蛋白的关键影响因素。

有机溶剂的种类：a：乙醇；b：乙腈；c：乙醇-乙腈(v:v＝1:1)。

油相与水相的体积比：a：1：4；b：1：7；c：1:10。

均质次数：a：4次；b：7次；c：10次，实验设计见表1。

表1正交试验设计表

表2正交试验结果

正交设计分析表格如表2，表中k1、k2、k3为相应因素三个水平下实验结果（包封率）的平均值，r值为各因素的极差，即各因素下三个水平包封率最大值与最小值的差值。由各因素水平的均值可知，有机溶剂种类最优水平为a，即有机溶剂优选a乙醇；油相与水相的体积比最优水平为c，即油相与水相的体积比优选1：10；质次数最优水平为c，即均质次数优选10次。由r值可知，有机溶剂种类对包封率影响最大，其次为油相与水相的体积比，匀质次数影响最小。故初步将匀质次数定为10次，进一步考察有机溶剂种类和油相水相的体积比。

（四）有机溶剂对包封率的影响

将匀质次数定为10次，油相水相的体积比定为1:10，对有机溶剂种类进行单因素考察，实验结果见表3。

表3有机溶剂种类对包封率的影响

由表3结果可知，有机溶剂种类对包封率影响很大，极性溶剂的包封率要远远强于非极性溶剂；甲醇做有机溶剂对cbd的包封率要略高于乙醇，但考虑到溶剂残留及毒性问题，故优选乙醇做溶剂。

（五）油相水相的体积比对包封率的影响

将有机溶剂定为乙醇，匀质次数定为10次，对油相水相的体积比进行单因素考察，实验结果见表4。

表4油相水相的体积比对包封率的影响

由表4结果可知，油相水相的体积比从1:6减至1:10，包封率逐渐升高；油相水相的体积比从1:10减至1:14，包封率又开始降低。故油相水相的体积比较优范围在1:8～12，最优为1:10。

以上实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。