海藻提取物组合物及其在化妆品中的用途的制作方法

本发明涉及一种海藻提取物组合物，具体地，所述组合物可提高丝聚蛋白的表达，从而改善皮肤屏障。本发明还涉及所述组合物在化妆品中的用途。

背景技术：

皮肤表皮被覆于人体体表，保持人体的水分，维持正常的生理功能，在缺水环境中，皮肤对人体的防护功能将严重下降。与皮肤保湿有关的皮肤结构和成分，主要为表皮最上层的皮脂膜、角质细胞中的天然保湿因子、角质层细胞间脂质、颗粒层的紧密连接蛋白、基底层的水通道蛋白等，如果这些结构和成分发生改变时，皮肤保湿能力便会发生明显的下降。

现有保湿类化妆品的保湿机理比较单一，保湿效果不明显，保湿时间短，24小时后几乎没有什么保湿效果，不具有长效保湿的功效。

丝聚蛋白(filaggrin，flg)是哺乳动物皮肤基底细胞中透明角质颗粒的碱性蛋白质，是表皮外层角化包膜的重要组成部分。丝聚蛋白的前体是丝聚蛋白原(profilaggrin)，一种约500kda的高磷酸化的富含组氨酸的多肽。当细胞从颗粒层到达角质层后，丝聚蛋白原被半胱氨酸肽酶-14(caspase-14)水解成丝聚蛋白，进而水解成各种天然保湿因子(naturalmoisturizingfactor，nmf)。

现有技术报道了脂肪酸能够从基因水平上促进丝聚蛋白的表达，从而可能在改善异常的皮肤屏障功能中发挥着重要的作用。然而，脂肪酸在使用时被证实在细胞毒性试验中的耐受性较差。因此仍然需要寻找能够从基因水平上促进丝聚蛋白的表达，从而能够改善异常的皮肤屏障功能的物质。

技术实现要素：

申请人意外发现包含两种不同含量的海藻提取物的组合物对丝聚蛋白的基因水平相对表达量有上调作用，具有促丝聚蛋白提升功效，从而改善皮肤屏障。因此将所述海藻提取物组合物应用于化妆品中，能有效增加皮肤中的天然保湿因子，使皮肤保持水润健康状态，强健皮肤屏障。

因此，本发明的第一个目的是提供一种海藻提取物组合物，其特征在于，所述组合物包含：

0.001-5.0wt％，优选0.25-2.0wt％的皱波角叉菜提取物，

0.0001-2.0wt％，优选0.05-0.5wt％的软毛松藻提取物，

0.01-50wt％的多元醇，优选1.0-10wt％的多元醇，

0.001-5.0wt％的增稠剂，优选0.01-2.0wt％的增稠剂，

0.01-15wt％的乳化剂，优选0.1-10wt％的乳化剂，

0.001-40wt％的植物油脂，优选0.01-20wt％的植物油脂，和

0.001-2wt％的中和剂，优选0.01-0.5wt％的中和剂。

皱波角叉菜(chondruscrispus)是采自夏威夷火山石的珍稀海藻“anhfelticcoccina”，带有大量阴离子，可以吸附阳离子性老化物质，提高皮肤保护能力。其提取物对人体白细胞弹性蛋白酶有抑制，显示具有抗炎活性；对胶原蛋白的生成有很好的促进，有活跃作用，因此具有抗衰老作用。

软毛松藻(codiumtomentosum)是生活在潮间带的一种海藻，其提取物主要成分为l-瓜氨酰胺基-l-精氨酸和半乳糖甘油，能促进表皮细胞水通道蛋白-3(aqp3)的合成，从而增强皮肤的水循环和皮肤屏障功能。

申请人意外发现包含较大剂量皱波角叉菜提取物和较小剂量软毛松藻提取物的特定配比的海藻提取物组合物能够有效增加丝聚蛋白的表达，从而改善皮肤屏障。

根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物中皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的重量比为1-100:1，优选5-40:1。

根据本发明的一个优选实施方案，所述多元醇选自甘油、丁二醇、丙二醇、辛甘醇和乙基己基甘油中的一种或多种。本发明组合物中的多元醇可以吸附并保留水分，维持皮肤水合作用。

根据本发明的一个优选实施方案，所述增稠剂选自卡波姆、丙烯酸酯/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物(碳链长度为10-30的烷醇)、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/vp(乙烯基吡咯烷酮)共聚物和聚丙烯酸钠中的一种或多种。本发明组合物中的增稠剂是亲水性高分子化合物，能调节流变性，并赋予良好的稳定性，赋予产品不同的使用感。

根据本发明的一个优选实施方案，所述乳化剂选自鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、甘油硬脂酸酯、peg-100硬酯酸酯、蔗糖棕榈酸酯和蔗糖硬脂酸酯中的一种或多种。本发明组合物中的乳化剂均为非离子型乳化剂，能够改善组合物中各种构成相之间的表面张力，使之形成均匀稳定的分散体系或乳霜状的物质。

根据本发明的一个优选实施方案，所述植物油脂选自牛油果树果脂(即乳木果油)、向日葵籽油、辛酸/癸酸甘油三酯、棕榈酸乙基己酯、霍霍巴籽油、角鲨烷、氢化聚癸烯、橄榄油、澳洲坚果籽油和鳄梨油中的一种或多种。本发明组合物中的植物油脂可保留在皮肤表面，在角质层内起润滑作用，填充皮肤表面的空间，代替在角质层内损失的脂质，保持皮肤柔软、柔韧、平滑，减少鳞片状皮肤，改善皮肤外观。

根据本发明的一个优选实施方案，所述中和剂选自氢氧化钾和/或氢氧化钠。本发明组合物中的中和剂能与组合物中的酸性物质相互作用，调节组合物的ph值。

根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物还包含防腐剂。所述防腐剂可以选自山梨酸、苯氧乙醇和/或苯甲醇。本发明组合物中的防腐剂能抑制微生物在化妆品中生长和繁殖，避免产品使用过程中的二次污染，保证产品功效和稳定性。

根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物还包含选自以下的一种或多种可选成分：0.0001％-0.5％的保湿剂，例如水解透明质酸钠、透明质酸钠、乙酰化透明质酸钠、尿囊素、尿素；0.001％-0.3％的金属螯合剂，例如edta-2na；0.001％-0.3％的抗炎舒缓剂，例如甘草酸二钾；0.0001％-0.5％的抗氧化剂，例如生育酚(维生素e)、生育酚乙酸酯；和0.01％-0.1％的香精。

本发明的第二方面是提供包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物在具有保湿作用的化妆品中的用途。

本发明的第三方面是提供包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物在具有提升角质层含水量作用的化妆品中的用途。

本发明的第四方面是提供包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物在具有降低经皮失水作用的化妆品中的用途。

本发明的第五方面是提供包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物在具有改善肌肤纹理作用的化妆品中的用途。

本发明的第六方面是提供包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物在具有改善皮肤屏障作用的化妆品中的用途。

本发明的第七方面是提供包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物在制备用于治疗由皮肤屏障受损引起的湿疹、尿布疹、痱子等皮肤病的药物中的用途。

根据本发明的第二到第七方面，所述包含皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的海藻提取物组合物中皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的重量比为1-100:1，优选5-40:1。

本发明的包含两种海藻提取物的组合物可根据不同需要制备成不同剂型，优选皮肤外用制剂，包括液体剂；添加了增稠剂等而制成的凝胶剂；添加了乳化剂、增稠剂等而制成的乳剂、霜剂；添加了乳化剂、表面活性剂等而制成的泡沫剂；浸泡在无纺布中而制成的贴剂等。然而，本领域技术人员理解，本发明所述组合物可以根据组合物的各种剂型添加各种所需添加剂。

出乎意料地，发明人意外发现皱波角叉菜提取物能够与软毛松藻提取物协同增效，从而提高细胞丝聚蛋白的表达，改善皮肤屏障。

本发明用于改善皮肤屏障的海藻提取物组合物的优点在于：

1.通过对海藻提取物组合物的各组分的含量范围进行特定配比，尤其是选择较大剂量皱波角叉菜提取物和较小剂量软毛松藻提取物的特定配比，获得了可持续至24小时的显著保湿效果。

2.所述海藻提取物组合物对丝聚蛋白的基因水平相对表达量有上调作用，有促丝聚蛋白提升功效。应用于化妆品中，可以提升角质层含水量，降低经皮失水(tewl)，改善肌肤纹理。

3.较大剂量皱波角叉菜提取物能够与较小剂量软毛松藻提取物协同增效，进一步提升在细胞丝聚蛋白表达中的效率。

附图说明

图1为包含本发明海藻提取物组合物的润肤霜a1、a2、a3、d1、d2和d3以及润肤乳b1、b2、b3、c1、c2和c3的3d表皮模型实验结果。

图2表明使用本发明润肤霜a2和空白对照进行24小时保湿测试的肌肤角质层水分含量时间点对比情况，其中“*”表示有显著性差异，0.01≤p<0.05；“**”，0.001≤p<0.01；“***”，p<0.001。

图3表明使用本发明润肤霜a2和空白对照进行24小时保湿测试的肌肤水分蒸发量时间点对比情况，其中“*”表示有显著性差异，0.01≤p<0.05；“**”，0.001≤p<0.01；“***”，p<0.001。

图4表明使用本发明润肤霜a2进行4周连用保湿测试的肌肤角质层水分含量时间点对比情况，其中“*”表示有显著性差异，0.01≤p<0.05；“**”，0.001≤p<0.01；“***”，p<0.001。

图5表明使用本发明润肤霜a2进行4周连用保湿测试的肌肤水分蒸发量时间点对比情况，其中“*”表示有显著性差异，0.01≤p<0.05；“**”，0.001≤p<0.01；“***”，p<0.001。

图6为使用本发明润肤霜a2和空白对照进行24小时保湿测试后的小腿肌肤照片，其中上排照片显示本发明润肤霜a2的效果，下排照片显示空白对照的效果。

图7为使用本发明润肤霜a2进行4周连用保湿测试后的脸部肌肤照片，其中上排照片显示左侧脸部，下排照片显示右侧脸部。

具体实施方式

实施例1：根据下表所列成分制备包含本发明的海藻提取物组合物的润肤霜a1、a2和a3，其中百分比为相对于组合物重量的重量百分比。

制备方法如下：

1)将水、甘油、1,3-丙二醇、辛甘醇、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、黄原胶和丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物用搅拌器混合均匀，加热至80℃，获得水相。

2)将鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、牛油果树果脂、向日葵籽油、辛酸/癸酸甘油三酯、生育酚(维生素e)混合均匀，加热至80℃，获得油相。

3)将水相加入调和釜中，再加入油相，混合均匀，在80℃条件下真空乳化30min。降温至60℃后加入氢氧化钾，继续降温至40℃以下。再加入苯氧乙醇、皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物、丁二醇、山梨酸以及水解透明质酸钠、尿囊素、edta二钠、甘草酸二钾和香精，搅拌10min后出料，制得润肤霜a1、a2和a3。

实施例2：根据下表所列成分制备包含本发明的海藻提取物组合物的润肤乳液b1、b2和b3，其中百分比为相对于组合物重量的重量百分比。

制备方法如下：

1)将水、甘油、1,3-丙二醇、辛甘醇、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、黄原胶和丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物用搅拌器混合均匀，加热至80℃，获得水相。

2)将鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、牛油果树果脂、向日葵籽油、辛酸/癸酸甘油三酯、生育酚(维生素e)混合均匀，加热至80℃，获得油相。

3)将水相加入调和釜中，再加入油相，混合均匀，在80℃条件下真空乳化30min。降温至60℃后加入氢氧化钾，继续降温至40℃以下。再加入苯氧乙醇、皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物、丁二醇、山梨酸以及水解透明质酸钠、尿囊素、edta二钠、甘草酸二钾、和香精，搅拌10min后出料，制得润肤乳液b1、b2、b3。

实施例3：根据下表所列成分制备包含本发明的海藻提取物组合物的润肤乳液c1、c2和c3，其中百分比为相对于组合物重量的重量百分比。

制备方法如下：

1)将水、甘油、丁二醇、辛甘醇、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和卡波姆用搅拌器混合均匀，加热至80℃，获得水相。

2)将鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、角鲨烷、霍霍巴籽油、辛酸/癸酸甘油三酯、生育酚乙酸酯混合均匀，加热至80℃，获得油相。

3)将水相加入调和釜中，再加入油相，混合均匀，在80℃条件下真空乳化30min。降温至60℃后加入氢氧化钾，继续降温至40℃以下。再加入苯氧乙醇、皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物、丁二醇、山梨酸以及透明质酸钠、尿囊素、edta二钠、甘草酸二钾和香精，搅拌10min后出料，制得润肤乳液c1、c2、c3。

实施例4：根据下表所列成分制备包含本发明的海藻提取物组合物的润肤霜d1、d2和d3，其中百分比为相对于组合物重量的重量百分比。

制备方法如下：

1)将水、甘油、丁二醇、辛甘醇、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/vp共聚物用搅拌器混合均匀，加热至80℃，获得水相。

2)将甘油硬脂酸酯、peg-100硬脂酸酯、牛油果树果脂、棕榈酸乙基己酯、生育酚乙酸酯混合均匀，加热至80℃，获得油相。

3)将水相加入调和釜中，再加入油相，混合均匀，在80℃条件下真空乳化30min。降温至60℃后加入氢氧化钠，继续降温至40℃以下。再加入苯氧乙醇、皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物、丁二醇、山梨酸以及乙酰化透明质酸钠、尿素、edta二钠、甘草酸二钾和香精，搅拌10min后出料，制得润肤霜d1、d2、d3。

实施例5：3d表皮模型实验测定

将实施案例1-4所制备的样品通过3d表皮模型实验测定并分析本发明海藻提取物组合物对丝聚蛋白的基因水平表达量的影响。本实验以表皮模型(广东博溪生物科技有限公司)为研究对象，采用表面给药的方式，将样品模拟人体使用过程，均匀涂布于表皮模型表面，通过rt-pcr法分析丝聚蛋白在基因水平的含量，应用prism(graphpad)作图，采用单因素方差统计分析待测样品促进丝聚蛋白提升的功效具体操作如下：

在表皮模型表面均匀涂抹实施案例1-4的各类样品，在27℃，95％rh环境中，培养24小时后，使用打孔器将细胞打孔后，在细胞中加入加1ml的trizol试剂，均质后反复吹打，转移至无杂核酸和核酸酶的1.5ml的ep管中，加入200μl的氯仿，涡旋1min，静置1-2min，12000g，4℃，离心10min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的异丙醇。涡旋，12000g，4℃，10min，小心的抽掉上清，加入1ml的75％depc乙醇，9000g，4℃，离心5min，小心的抽掉乙醇，加入50μl的无酶水，用qubit3.0进行rna定量调整浓度后，使用反转录试剂与poly(a)引物反转录为cdna。根据实际要求，将cdna浓度调整至25ngμl-1，取50ng混合所需引物，并进行荧光定量pcr。以gapdh作为内参基因进行矫正加样误差，计算flgmrna的表达量(具体方法请参见roche的faststartessentialdnagreenmaster，第6版，其可从罗氏诊断的官方网站下载获得)。

用于实时荧光定量pcr的cdna引物设计

通过3d表皮模型实验表明，从丝聚蛋白的基因水平表达量结果分析，将本发明海藻提取物组合物应用于化妆品例如润肤霜a1、a2、a3、d1、d2和d3以及润肤乳b1、b2、b3、c1、c2和c3中时，丝聚蛋白相对表达量显著上调，且当组合物中皱波角叉菜提取物和软毛松藻提取物的比例为5：1时表达效果最佳，说明本发明海藻提取物组合物具有促丝聚蛋白提升功效(参见图1)。

实施例6：通过角质层水分含量测定和肌肤水分蒸发量测定评估实施例1中获得的包含本发明海藻提取物组合物的润肤霜a2对角质层含水量、经皮失水以及肌肤纹理的影响

通过角质层水分含量测定和肌肤水分蒸发量测定评估实施例1中获得的包含本发明海藻提取物组合物的润肤霜a2的保湿功效。

测试方法：选择脸部及小腿外侧肌肤干燥，且伴有皮屑症状的健康女性受试者，年龄范围在18-45周岁。35名受试者完成24小时保湿测试，34名受试者完成4周连用保湿测试。受试者在小腿外侧使用润肤霜a2前与使用后2小时、4小时、6小时、8小时、24小时；脸部使用润肤霜a2前与连用1天、1周、2周及4周后分别完成角质层水分含量和肌肤水分蒸发量的测量，并完成visioscan照片的拍摄。

现场五次访问的测试环境控制在温度21℃±1℃且湿度控制在40％rh-60％rh。

第1次访视为筛选入组及基线测量，由工作人员向受试者介绍项目概况、讲解测试内容，受试者如同意参加后需要签署知情同意书，问卷的填写以及入选标准和排除标准的筛选。如果受试者符合标准，则正式入组。受试者洗脸后，在恒温恒湿环境中静坐平衡30分钟，由工作人员对受试者进行仪器测量及照片拍摄。最后由工作人员发放润肤霜，并指导受试者在面部及小腿外侧使用润肤霜。使用润肤霜后的2小时、4小时、6小时、8小时，在小腿外侧皮肤完成仪器测量及照片拍摄。由工作人员发放润肤霜使用日记，要求受试者在下次来访前，小腿外侧皮肤不能清洗或涂抹任何润肤霜。面部润肤霜正常使用(按每天早、晚各使用1次，每日2次)。

第2次访视、第3次访视、第4次访视、第5次访视为润肤霜使用1天/24小时后(day1/24h)、润肤霜使用1周(w1)、润肤霜使用2周(w2)、润肤霜使用4周(w4)后回访，受试者按约定时间到访后洗脸，在恒温恒湿的环境中静坐平衡30分钟后，由工作人员对受试者面部、小腿外侧皮肤进行仪器测量及照片拍摄。完成访视2的流程后，受试者按要求每天早晚在面部和小腿外侧各使用润肤霜，一天两次。在完成4周的润肤霜使用阶段后，工作人员回收润肤霜并检查润肤霜使用日记，则测试流程全部结束。

(1)测试结果：24小时保湿测试(测试部位：小腿外侧)

表1.使用本发明润肤霜a2和空白对照的肌肤角质层水分含量

*均值(±标准误差)，与使用前相比的变化率

结果表明(参见图2)：

受试者小腿外侧肌肤的水分含量在使用本发明润肤霜a2后2小时、4小时、6小时、8小时及24小时与使用前相比显著提升，提升率分别为2小时提升126.32％、4小时提升114.32％、6小时提升101.58％、8小时提升88.35％及24小时提升61.93％。

受试者小腿外侧空白对照区域肌肤的水分含量在2小时、4小时、6小时、8小时及24小时与使用前相比略有提升，由于整体无趋势性变化，故而视为可接受的皮肤自身波动。

因此受试者小腿外侧测试区域肌肤的角质层水分含量均显著高于小腿外侧空白对照区域。

表2.使用本发明润肤霜a2和空白对照的肌肤水分蒸发量

*均值(±标准误差)，与使用前相比的变化率

结果表明(参见图3)：

受试者小腿外侧肌肤的水分蒸发量在使用润肤霜a2后2小时、4小时、6小时及8小时与使用前相比显著改善，改善率分别为2小时改善41.95％、4小时改善27.70％、6小时改善19.61％、8小时改善11.17％。使用润肤霜a2后24小时与使用前相比无明显变化。

受试者小腿外侧空白对照区域肌肤的水分蒸发量在2小时、4小时、6小时、8小时及24小时与使用前相比略有提升。由于整体无趋势性变化，故而视为可接受的皮肤自身波动。

因此受试者小腿外侧测试区域肌肤水分蒸发量均显著低于小腿外侧空白对照区域。

(2)测试结果：4周连用保湿测试(测试部位：脸部)

表3：使用本发明润肤霜a2的肌肤角质层水分含量

*均值(±标准误差)，与使用前相比的变化率

结果表明(参见图4)：受试者脸部肌肤的水分含量在使用润肤霜1天、1周、2周及4周后与使用前相比显著提升，提升率分别为1天提升52.45％、1周提升64.25％、2周提升78.08％及4周提升72.29％。

表4：使用本发明润肤霜a2的肌肤水分蒸发量

*均值(±标准误差)，与使用前相比的变化率

结果表明(参见图5)：受试者脸部肌肤的水分蒸发量在使用本发明润肤霜1天、1周、2周及4周后与使用前相比显著改善，改善率分别为1天改善11.28％、1周改善16.59％、2周改善20.62％及4周改善23.69％。

因此，实施例1的润肤霜a2通过35例中国健康女性受试者24小时保湿测试和4周连用保湿测试，人体皮肤安全性好，并由结果可得知受试者小腿肌肤角质层水分含量得到显著提升，并且该显著效果可持续至24小时；肌肤经皮失水量得到显著改善，并且该显著效果可持续至8小时。说明本发明润肤霜a2具有保湿功效，能够有效改善肌肤干燥、起皮屑症状。

此外，根据图6和图7的照片显示，本发明实施例1的润肤霜a2不论在24小时保湿测试还是在4周连用保湿测试均能明显改善肌肤纹理。