本发明涉及植物成分提取领域，具体涉及一种从越橘中分离提取有效成分的方法。
背景技术：
：越橘又称为蓝浆果或蓝莓果，属于杜鹃花科越橘属植物，全世界越橘属植物约有450种，野生种广泛分布于北半球温带、亚热带等地区，越橘果实中含有丰富的营养物质，目前已研究的越橘提取物的用途包括改善视力、包括毛细血管和改善循环系统功能、抗氧化和清除自由基等，其中花青素具有很强的抗氧化性，研究价值较高。花青素属于黄酮类化合物，通常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷形成花色苷，越橘中主要有5种花青素，与半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖等以糖苷键结合形成花色苷。目前对于越橘提取物的处理方法包括浸提、微波萃取、超临界流体萃取等，如胡晓梅等研究大孔树脂吸附分析纯化欧洲越橘提取物，经过树脂精制得到的欧洲越橘提取物花青素含量在25以上，花色苷含量高于36%。花色苷类物质能够溶于水和乙醇溶液，但不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂，且光照、温度、ph等都会影响到花色苷的稳定性。在上个世纪80年代，花色苷作为一种抗氧化食品就已进入美国市场。越橘提取物作为药物或具有改善某一疾病特征发挥较好的功效一般要求纯度较高，简单的提取工艺比较难满足国际通用标准（液相测定花色苷≥36%）。目前国内也仅仅只有少数的几个公司能够做到高含量的越橘提取物，如北京金可公司、桂林莱茵公司等，北京金可公司在蓝莓提取物中的花色苷含量达到了36%以上。即对于我国越橘提取物的处理而言，高含量、高纯度的越橘提取物对于制约目前的越橘提取物生产的主要原因。技术实现要素：基于现有技术中存在的问题，本发明旨在获得一种花色苷含量高的从越橘中分离提取有效成分的方法。本发明的技术方案如下。一种从越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15-30%的冷水，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶和几丁质酶的组合，所述复合酶制剂的用量为0.001-2%，升温并恒温控制在20-60℃酶解处理，酶解时间控制在0.5-3h；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为50-80%的乙醇溶液至离心液中，乙醇溶液和越橘的体积重量比为8-15:1，添加越橘质量1-3%柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取30min-4h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为5-10倍树脂柱体积，然后利用5-10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为1-2bv/h，然后利用5-10倍35-50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物。对于花色苷而言，由于其受到光照、热等影响，会导致其稳定性受到破坏，因此本发明在步骤（1）中选择添加15-30%的冷水，降低其在制浆的过程中产生的热量而导致的有效成分的破坏，所述的冷水的温度为1-4℃。进一步地，所述的步骤（6）中干燥处理选择喷雾冷冻干燥；将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.10-1.20后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为15-25m3/h，空气压力为0.6-0.8mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度为-5至-10℃，干燥时间为1-8h得到越橘提取物。目前已有的研究中，喷雾干燥是较为常见的越橘提取物的处理方式，然而对于该方式而言，其在最终产品的性能表现中并不乐观，首先其较高的温度可能会给花色苷带来不利的影响，其次根据市场上的表现来看，长时间的贮藏期理化性质也出现了一定的不稳定情况。因此本发明选择喷雾冷冻干燥的方式处理，低温的处理条件能够避免温度对花色苷的影响，且产品吸潮及结块性能得到明显的改进。进一步地，所述的干燥时间为1-6h、2-5h、2-4h等，所述的真空冷冻干燥处理温度可以为-6℃、-8℃。进一步地，所述的步骤（2）中酶解温度优选为35-45℃，酶解ph控制在4-6。进一步地，所述的复合酶制剂中纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、几丁质酶的配比为10-15:8-10:1-2:1-2。对于越橘中的花色苷，其较大部分储存在细胞质中，因此在提取时有效地破壁手段对于提高提取率十分的关键。如cn101775417a采用了纤维素酶和果胶酶的复合酶来实现破壁，提高产率。如cn106749151a公开了采用果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶快速提取花青素，获得的产品纯净度高。而对其研究发现，有效地提高酶解效率，降低成本仍然存在较大的问题，如cn106749151a中酶的用量达到了1%以上。对于植物酶解破壁而言，纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶是较为常见的酶的种类，本发明在现有技术的基础上，进一步的探索研究复合酶制剂对于破壁或提取效率的影响，研究发现，本发明所述的酶组合可以有效地降低酶的使用量，且进一步的促进提取效率的提高。因此，进一步地，本发明中复合酶制剂的用量为0.005-1%、0.01-0.08%、0.008%、0.01%、0.05%等。进一步地，所述的步骤（4）中提取时间为1-2h，所述柠檬酸用量为1.2-2%。结果显示，添加柠檬酸后提取环境的软酸性能够在一定程度上促进提取效率的提高。进一步地，所述的步骤（5）中大孔树脂为da201-m8，所述的聚酰胺树脂为15-25目。对于大孔树脂而言，常见的型号包括hp-20、ab-8、da201、dm21等。大孔树脂是比较理想的纯化花色苷的方法，对于目标产物和杂质其在吸附性能上具有明显的差异，因此通过吸附和解析就能够获得纯度较高的产品。对于树脂吸附而言，已是本领域常见的研究，本发明进一步地选择大孔树脂和聚酰胺树脂的结合来提高吸附的效果，研究发现对于da201-m8与聚酰胺树脂的组合表现出较为理想的结果。进一步地，所述的真空干燥时间为2-5h。进一步地，本发明所述的制备方法得到的越橘提取物有效成分包括矢车菊素类花青素、飞燕草素类花青素、锦葵素类花青素、矮牵牛素类花青素。对于本发明而言，进一步研究提取物中活性物质的组成对于确保产品的性质十分的重要。本发明的有益效果为：本发明提取方法提取效率高，获得的越橘提取物中花色苷含量在36%以上，符合了欧美相关药典的要求。本发明选择酶的组合对于减少酶的用量、提高酶解效率和提高提取率方面效果显著。本发明选择喷雾冷冻干燥的方式处理提取物，对于确保产品的理化性质十分重要，越橘提取物的产品性能尤其是结块方面得到了明显的改善。本发明无有机溶剂的残留，且无污染，未采用强酸等溶液也进一步地确保的活性成分的稳定。具体实施方式实施例1一种从欧洲越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15-30%的冷水，冷水温度为2℃，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶和几丁质酶的组合，所述复合酶制剂的用量为0.005%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1h，纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、几丁质酶的配比为15:8:1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为60%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为10:1，添加越橘质量1%柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用da201-m8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为8倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，具体选择喷雾冷冻干燥；将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.10-1.20后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为15-25m3/h，空气压力为0.6-0.8mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度至-10℃，干燥时间为4h得到越橘提取物。实施例2一种从红豆越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入25%的冷水，冷水温度为2℃，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶和几丁质酶的组合，所述复合酶制剂的用量为0.008%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1h，纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、几丁质酶的配比为15:8:1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为60%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为10:1，添加越橘质量1.2%的柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用da201-m8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为10倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，具体选择喷雾冷冻干燥；将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.20后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为25m3/h，空气压力为0.8mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度至-10℃，干燥时间为3.5h得到越橘提取物。实施例3一种从欧洲越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15%的冷水，冷水温度为1℃，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶和几丁质酶的组合，所述复合酶制剂的用量为0.08%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1.5h，酶解ph控制在4-6，复合酶制剂中纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、几丁质酶的配比为10:8:1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为50-80%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为8-15:1，添加越橘质量1.5%柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用da201-m8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为8倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过20目聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍35-50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，干燥处理选择喷雾冷冻干燥,将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.10后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为18m3/h，空气压力为0.7mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度为-8℃，干燥时间为4h得到越橘提取物。分析该产物，有效成分包括矢车菊素类花青素、飞燕草素类花青素、锦葵素类花青素、矮牵牛素类花青素。对比例1一种从欧洲越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15-30%的冷水，冷水温度为2℃，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶组合，所述复合酶制剂的用量为0.5%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1h，纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶的比例为1:1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为60%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为10:1，添加越橘质量1%柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用da201-m8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为8倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，具体选择喷雾冷冻干燥；将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.10-1.20后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为15-25m3/h，空气压力为0.6-0.8mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度至-10℃，干燥时间为4h得到越橘提取物。对比例2一种从欧洲越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15-30%的冷水，冷水温度为2℃，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶和几丁质酶的组合，所述复合酶制剂的用量为0.005%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1h，纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、几丁质酶的配比为15:8:1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为60%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为10:1，添加越橘质量1%柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用ab-8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为8倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，具体选择喷雾冷冻干燥；将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.10-1.20后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为15-25m3/h，空气压力为0.6-0.8mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度至-10℃，干燥时间为4h得到越橘提取物。对比例3一种从欧洲越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15-30%的冷水，冷水温度为2℃，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶和几丁质酶的组合，所述复合酶制剂的用量为0.005%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1h，纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、几丁质酶的配比为15:8:1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为60%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为10:1，添加越橘质量1%柠檬酸，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用da201-m8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为8倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，具体选择喷雾干燥；控制进风口温度为170-220℃，出风口温度为70-120℃。对比例4一种从欧洲越橘中分离提取有效成分的方法，包括如下的步骤：（1）取越橘洗净，加入15-30%的常温水，利用打浆机将越橘制成浆；（2）加入复合酶制剂，所述复合酶制剂的组成为纤维素酶、果胶酶的组合，所述复合酶制剂的用量为1.2%，恒温控制在40℃，酶解时间控制在1h，纤维素酶、果胶酶的配比为1:1；（3）离心分离，得到离心液和滤渣；（4）提取，添加体积浓度为60%的乙醇溶液，乙醇溶液和越橘的体积重量比为10:1，控制温度为50-60℃，提取2h；（5）过柱处理，将步骤（4）处理得到的提取液利用da201-m8大孔树脂进行吸附处理，洗脱流速为2bv/h，吸附完毕后利用蒸馏水洗涤，蒸馏水用量为8倍树脂柱体积，然后利用10倍40-60%乙醇溶液进行洗脱，收集得到洗脱液；将洗脱液再经过聚酰胺树脂吸附处理，洗脱流速为2bv/h，然后利用10倍50%乙醇溶液洗脱，收集得到洗脱液；（6）干燥处理得到越橘提取物，具体选择喷雾冷冻干燥；将洗脱液浓缩至在25℃下相对密度为1.10-1.20后，进行喷雾冷冻干燥，所述的喷雾方式为气流喷雾，空气流量为15-25m3/h，空气压力为0.6-0.8mpa，喷雾室的温度为-45℃，处理至所述的提取物成针状产物；然后真空冷冻干燥处理，处理温度至-10℃，干燥时间为4h得到越橘提取物。结果分析利用hplc法测定提取物中花色苷的含量。虽然hplc法与uv-vis相比较为繁琐，但其测定准确，因此选择hplc法分析其含量，是以矢车菊-3-o-葡萄糖苷标准对照品和矢车菊标准对照品为参照，在535nm波长下分别标定各种的花色苷和花色素单体的峰，通过相应的算法计算出单个花色苷和花色素的含量，相加得到总花色苷含量。试验方法的部分参数如下：色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱，长度250mm；流动相：a相为水：甲酸=91.5:8.5，将915ml水和85ml甲酸混匀，脱气备用；b相为225ml甲醇，225ml乙腈，100ml甲酸和400ml水混匀，脱气备用；检测波长为535nm；流速为1ml/min。分别测定实施例和对比例的结果（国际通用标准），根据单个氯化花色苷或氯化花色素的分子量与氯化矢车菊素-3-o-葡萄糖苷标准品或氯化矢车菊素标准品的分子量的比值来测定单个花色苷的含量，总花色苷含量是单个花色苷含量的总和，结果如下。项目花色苷含量实施例152%对比例141%对比例244%对比例439%由此可以看出，本发明的在获得的越橘提取物产品中花色苷含量高，与对比例相比，整个工艺获得了良好的提取效果，与对比例对比分析可知，本发明在酶的组合、树脂的组合和工艺的改进（打浆过程中冷水的添加、柠檬酸的添加等）方面取得了更优的效果。稳定性分析将样品置于40±1℃、相对湿度75%的条件下进行稳定性分析（加速试验），以实施例1和对比例3为实验对象进行测定，分别测定第0天、30天、60天、90天的结块情况，将样品过60目筛，结块率=留在筛网上的质量/产品质量*100%，试验结果如下：实施例1在第0天、30天、60天、90天的结块情况分别为0、0、0和0.14%，对比例3第0天、30天、60天、90天的结块情况分别为0、0.15%、0.68%、1.79%。可见本申请选择的处理方式与对比文件相比在产品结块性能上具有较大改进，产品性能较好。当前第1页12