一种治疗类风湿性关节炎的植物油组合物的制作方法

本发明涉及免疫学、药学及医学相关领域，特别涉及一种治疗类风湿性关节炎的植物油组合物。

背景技术：

类风湿性关节炎是一种慢性进行性自身免疫系统疾病，临床上患者多表现为四肢关节僵硬、变性及其他器官的累积病变。血液学检测结果发现，患者机体中氧化应激水平、炎性细胞因子(白细胞介素il-1β、肿瘤坏死因子tnf-α)含量显著升高；此外，自身免疫平衡被打破，主要发生辅助性t细胞2(th2)向辅助性t细胞1(th1)的偏移，促炎细胞的增殖分化进一步导致炎症细胞因子增高，从而加重疾病的发展。大量炎性细胞在关节处发生浸润，使得关节软骨发生侵蚀或坏死，导致关节发生扭曲变形等不可逆病变，给患者带来极大的痛苦。

目前对于类风湿性关节炎的具体发病机制尚不清楚，临床上也没有治疗该疾病的特效药。传统的治疗类风湿性关节炎的药物主要有以下4大类：针对环加氧酶设计的非甾体类抗炎药、具有免疫抑制作用的慢作用抗风湿药、靶向性较高的生物制剂及其他药物。虽然以上药物均能在不同程度上缓解类风湿性关节炎患者的关节疼痛及损伤，但是存在不少的毒副作用，且不能修复已发生的损伤，并且有些药物存在发挥作用需要时间较长，患者的耐受性较差等缺点。因此需要从新的角度寻找安全性较好、作用效果较为明显且患者较易接受的治疗类风湿性关节炎的药物分子。

牛至油作为一种天然的牛至全草提取物，主要分布在我国华北和西北及长江以南的区域，其从东汉开始作为一种中草药广泛应用于民间，主要用于治疗发热、腹泻、呕吐及头疼等症状，除此之外，主要是作为一种天然的抗菌剂应用于减少禽兽类动物的感染；近年来有学者发现其除了抗菌作用外的其他优势，比如具有止痛、抗炎、抗癌、抗糖尿病、保护心肌、保护胃肠道、保肝、保护神经等生物活性，同时还具有抑制对人类抗生素敏感和有耐药性的致病性细菌和病毒、抑制致病性真菌、抗虫、杀菌、抗真菌等生物活性作用。虽然其治疗上的作用大多还处于动物实验的阶段，但已经开发出保健品用于人体的日常调节和补充。不少文献报道了牛至油在糖尿病、癌症等疾病中能发挥一定的治疗效果，同时证明了其作用发挥主要的主要成分是酚类化合物、黄酮类化合物和萜类化合物。而且作为一种天然的植物提取精油，长期服用牛至油具有较高的安全性，患者对其的耐受性也较高。因此，探索以牛至油为主要成分的植物油组合物在自身免疫系统疾病-类风湿性关节炎的治疗效果具有实际意义，可以为临床上治疗药物的开发提供理论基础和方向。

本发明利用牛至油为主要成分的植物油组合物治疗牛ii型胶原诱导的类风湿性关节炎模型大鼠，发现其可以调节大鼠机体的氧化应激水平，抑制自身免疫t细胞的增殖，减轻关节肿胀程度，提高大鼠的活动能力。到目前为止，未见关于牛至油治疗类风湿性关节炎的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对现有药物存在的不足，提供一种长期服用副作用小，具有免疫调节作用的类风湿性关节炎治疗药物的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种治疗类风湿性关节炎的植物油组合物，本发明的技术方案如下：

较佳地，所述多功能植物油组合物主要成分为特级橄榄油、牛至油。

较佳地，所述多功能植物油组合物中特级橄榄油浓度为654.2mg/ml，牛至油浓度为351.4mg/ml。

较佳地，所述牛至油含有有效成分为2-甲基-5-异丙基苯酚

较佳地，所述2-甲基-5-异丙基苯酚的质量含量为245.8mg/ml。

较佳地，所述植物油组合物给药制备方法为：0.8ml植物油组合物+0.4g甘露醇溶于9.2ml20％力保肪宁(lipofundin)的比例制备油剂；溶剂对照组按照0.08g甘露醇溶于0.4ml20％力保肪宁(lipofundin)的比例制备而成。

较佳地，所述植物油组合物给药频率为每周2次。

较佳地，所述植物油组合物给药途径为腹腔注射。

较佳地，所述植物油组合物给药时长为9周。

较佳地，所述植物油组合物可以减轻胶原型类风湿性关节炎模型大鼠的关节肿胀度。

较佳地，所述植物油组合物可以提高胶原型类风湿性关节炎模型大鼠的抗氧化能力。

较佳地，所述植物油组合物可以抑制胶原型类风湿性关节炎模型大鼠自身免疫功能的异常活化。

本发明提供的植物油组合物作为治疗类风湿性关节炎的药物，具有调节类风湿性关节炎模型大鼠机体氧化应激水平及免疫平衡的作用，可以降低血清丙二醛的含量，抑制脾脏t细胞的增殖，缓解大鼠四肢关节的红肿情况及弯曲变形的症状，减轻关节的炎症和损伤程度，增强其行为能力。

本发明提供的植物油组合物为天然活性成分，对类风湿性关节炎具有缓解作用，其具有较高的安全性和可靠性，且成本和费用较低；此外，其在抗氧化、抗炎及调节免疫平衡方面的作用使其在各种治疗炎症、氧化应激及th1型免疫性疾病的药物中具有广大的应用前景。

附图说明

为了使本发明目的、技术方案和优点清楚，下面结合附图对本发明进行进一步详细描述，其中：

图1是实施例4中植物油组合物治疗模型大鼠关节炎指数变化图。

图2是实施例5中植物油组合物治疗模型大鼠血清丙二醛含量变化图。

图3为实施例6中植物油组合物治疗模型大鼠脾脏t细胞增殖变化图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：植物油组合物

植物油组合物含有从油橄榄鲜果中提取的特级橄榄油及植物牛至全草中提取的牛至油；其中植物油组合物中橄榄油浓度为654.2mg/ml，牛至油浓度为351.4mg/ml(2-甲基-5-异丙基苯酚245.8mg/ml)。

实施例2：类风湿性关节炎大鼠的模型构建

雌性6周龄wistar大鼠12只，体重170±10g，购自扬州大学比较医学中心(许可证号：syxk(苏)2017-0007，合格证编号：n0.201904708)。大鼠在标准条件下适应性喂养1周后开始造模

每天固定时间将6周龄雌性wistar大鼠置于冰水混合物中游泳15min，连续7天重复上述操作。冰浴结束后，每只大鼠以0.3ml/100g的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉处理，将麻醉后的大鼠尾根部脊髓两侧剃毛。采用尾根部、背部、右后足足跖部三点注射法注射制备好的牛ii型胶原与完全弗氏佐剂混合乳剂(cii/cfa乳剂，胶原浓度1mg/ml)0.25ml/只。7天之后采用同样方法对大鼠右后足足跖部、背部注射乳剂进行加强免疫，0.1ml/只。其中，cii/cfa乳剂的制备方法为利用三通阀将10mg/ml完全弗氏佐剂和牛ii型胶原按照1∶1的比例等体积乳化，所有操作需在冰上进行。

造模后，定期对大鼠的关节肿胀情况进行观察，并根据关节炎指数5级评分法对大鼠四肢关节病理严重程度分别进行评分，每只足爪关节炎指数最高评分为4分，四肢关节炎指数总分累计最高分为十六分，具体评分标准如下：0分，没有出现红肿现象；1分，1-2个趾关节出现红肿或轻度肿胀；2分，2-3个趾关节出现红肿或踝关节中度肿胀；3分，3-4个趾关节出现红肿或踝关节重度肿胀；4分，踝关节及整个足爪重度肿胀，伴有严重功能障碍，以关节炎指数评分≥4为判断模型成功的标准。

模型结果：大鼠进行加强免疫后定期对其关节肿胀情况进行监测，结果发现，所有大鼠加强免疫后均出现踝关节和整个足爪不同程度红肿，并且有继发性关节炎现象，四肢关节炎指数评分总分均在4分以上，说明模型的成功率为100％。

实施例3：分组及给药

将上述造模成功的大鼠随机分为溶剂组和植物油组合物给药组，每组6只大鼠。

药物制备：给药组按照0.8ml植物油组合物+0.4g甘露醇溶于9.2ml20％力保肪宁(lipofundin)的比例临时制备油剂，用振荡器震荡混匀；溶剂对照组按照0.08g甘露醇溶于0.4ml20％力保肪宁(lipofundin)的比例制备而成，用振荡器震荡混匀。

给药：给药组大鼠每只按照26.78mg/kg的2-甲基-5-异丙基苯酚进行腹腔注射给药，溶剂组给予相同体积的力保肪宁与甘露醇制备的溶剂。按照每周2次的频率进行给药治疗，持续给药9周。

实施例4：植物油组合物治疗模型大鼠关节肿胀度和形态变化

通过测量大鼠踝关节宽度、厚度、掌厚度及足容积，可以从数字上直观的反映大鼠关节的肿胀情况。首次给药之后，定期对大鼠的关节肿胀情况进行检测；采用电子游标卡尺对大鼠后足的踝关节宽度、厚度及足掌掌厚度进行测量，同时采用排水法原理用自制足容积测定仪对大鼠后足的足容积进行测定；采用关节炎指数五级评分标准对大鼠的四肢关节炎指数进行评分，结果表明，连续9周给药后，大鼠关节炎指数评分降低(**p＜0.01)，关节肿胀度也有所减轻；此外，随着实验的进行，溶剂组大鼠关节发生严重变形，尤其是踝关节发生不可逆变化，出现不能弯曲的情况；相比之下，给药组治疗大鼠关节弯曲变形程度没有溶剂组严重(见表1，图1)，说明植物油组合物给药后能减轻大鼠四肢关节的损伤程度，增强其行为能力，使病情发生好转。

表1植物油组合物治疗模型大鼠关节肿胀度和形态变化(mean±sem)

实施例5：植物油组合物治疗模型大鼠血清丙二醛含量变化

大鼠连续给药9周，每周1次从其眼眶静脉丛取血；将血液放置在4℃冰箱过夜后，以4000rpm的转速离心10min，取上层血清保存在-20℃冰箱中。对终末血清进行氧化应激指标检测。采用硫代巴比妥酸(tba)法测定大鼠血清丙二醛(mda)的水平，按照南京建成公司的mda试剂盒说明书进行测定。结果显示，与溶剂组相比，植物油组合物给药组大鼠血清mda含量较低，且差异具有显著性(*p＜0.05)。说明本发明提供的植物油组合物在类风湿性关节炎大鼠中具有抗氧化的作用，从而减轻大鼠类风湿性关节炎的症状(图2)。

实施例6：植物油组合物治疗模型大鼠大鼠脾脏t细胞增殖变化

大鼠脾脏t细胞的获得：实验末期，采用颈椎脱臼法处死大鼠，放置75％的酒精中浸泡3min。将取下的脾脏放在100目筛网上，用5mlpbs缓冲液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清；加红细胞裂解液5ml，小心用移液枪吹打混匀脾细胞，静止5min，待红细胞完全破碎，1000rpm离心5min，弃上清去除红细胞；用pbs缓冲液液洗2遍，再用rpmi1640培养液重悬细胞，计数调整细胞浓度为8-10×10⁶个/ml。将用培养基重悬的脾细胞倒入已用支架固定好的尼龙毛柱注射器中，关闭阀门，孵育30min。之后松开注射器下方乳胶管上的夹子，收集液体，进行离心，即可获得所需t淋巴细胞。

mtt法检测脾脏t细胞增殖：体外培养的淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下被活化增殖，加入染料噻唑蓝(mtt)后被活细胞代谢产生紫色的甲瓒(formazan)。用酶标仪直接测定各孔的在波长450nm处的吸光度值，可以反映甲瓒的生成量，由此能推断细胞内线立体氧化酶活性，间接反映活细胞的数目，即淋巴细胞的增殖水平，具体操作如下：先在96孔板各孔中分别加入100μl的t细胞悬液(每孔10000个)，另设3孔为本底对照组，加入等体积rpmi1640培养基；置于37℃，5％细胞培养箱中培养30min；然后分别加入100ulrpmi1640培养基、终浓度为2.5μg/ml的刀豆蛋白a(cona)、终浓度为500μg/ml的2-甲基-5-异丙基苯酚刺激各组细胞，每组设3个复孔；再放置于37℃，5％细胞培养箱中培养72h；之后取出96孔培养板，每孔加入5mg/ml的mtt液20μl，相同条件继续培养4h；之后用板式离心机以2500rpm转速离心10min，收集保留上清培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)100μl，以充分溶解甲瓒，最后用酶标仪在波长490nm下测定吸光度。

t细胞增殖指数＝(待测组平均吸光度值-本底对照组平均吸光度)/(培养基组平均吸光度值-本底对照组平均吸光度)

结果表明，终浓度为500μg/ml的2-甲基-5-异丙基苯酚刺激下，溶剂组与给药组t细胞增殖指数的差异具有显著性(*p＜0.05)，说明该浓度下的2-甲基-5-异丙基苯酚可以较有效的抑制脾脏t细胞的增殖，从而起到免疫保护的作用，有治疗类风湿性关节炎的作用(图3)。

结论：本发明提供的植物油组合物可以发挥抗氧化和调节机体免疫平衡的作用，而且可以减轻类风湿性关节炎大鼠的关节红肿和弯曲变形症状，增强其行为能力。该植物油组合物具有有效调节机体的免疫平衡的功能，可用于类似于类风湿性关节炎的th1型免疫调节偏高相关疾病；该植物油组合物较强的抗氧化能力较强的特点可应用于氧化应激紊乱引起的痛风、动脉粥样硬化、糖尿病并发症、心血管疾病等方面的研究。此外，本发明涉及的植物油组合物是天然的植物提取物，具有较高的安全性和广泛性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的某些优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。