一种基于孕妇外周血对双胞胎合子性质的无创鉴定方法与流程

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种基于孕妇外周血对双胞胎合子性质的无创鉴定方法。

背景技术：

20世纪80年代以来，随着辅助生殖技术的不断进步，双胎妊娠率不断提高，在美国，怀孕20周或以上的胎儿死亡率为6.22％双胞胎的胎儿死亡率比单胎婴儿高2.7倍。双胎妊娠的较高风险可能有几个原因，例如双胎输血综合征(ttts)，染色体缺失等，此外，在之前的研究中发现在同卵双胞胎中观察到的风险显著增加。

因此，双胎的合子性质对非整倍体筛查十分重要，对于同卵双胎而言，每个胎儿的非整倍体风险与单胎妊娠相同。但在异卵双胎中，每个胎儿都有独立患染色体非整倍体的风险，非整倍体的可能性约是单胎妊娠的两倍。双胎合子性质的鉴定对nipt(无创产前筛查)，临床血清标志物检测以及产前诊断有非常重要的意义。

目前存在的判定双胎合子性质的方法有：

(1)dna印记可以判断双胎的合子性；该方法需要取材绒毛或羊水，属于一种侵入式方法，在一定程度上有很大的风险，可能对胎儿的细胞的分裂，分化造成不可挽回的损失，导致胎儿畸形，有可能导致胎儿流产。

(2)早期超声法；目前临床上常通过早孕期超声上的绒毛膜性来帮助判断合子性质。所有异卵双胎均为双绒毛膜，而同卵双胎根据胚芽分裂时间的不同，可以是单绒毛膜双胎(约66％)，亦可以是双绒毛膜双胎(约占33％)。故该方法对于单绒毛膜可以肯定是同卵双胎，但是对于结果是双绒毛膜没有办法确定的。

因此，发明一种新的算法对双胞胎的合子性质(即同卵双生或异卵双生)进行鉴定，克服以上鉴定方法的不足迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明提供一种基于孕妇外周血对双胞胎合子性质的无创鉴定方法，通过收集怀有双胎的孕妇的外周血，采用一种新的算法对双胞胎的合子性质(即同卵双生或异卵双生)进行鉴定的方法，本发明克服了以上鉴定方法的不足，属于一种无创的鉴定方法，精准的合子鉴定方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：一种基于孕妇外周血对双胞胎合子性质的无创鉴定方法，其特征在于，包括：

采集母亲血浆样本和采集父亲身体组织样本；

通过所述母亲血浆样本获得母亲的snp位点序列，通过所述父亲身体组织样本获得父亲snp位点序列；

计算胎儿浓度f和测序错误率e；

选择父亲和母亲snp位点中只包含有两种等位基因的位点，且母亲为纯合基因型，父亲为杂合基因型的情况，计算双胞胎合子性质为同卵双生的概率pm和双胞胎合子性质为异卵双生的概率pt；

计算计算

其中，y为所有母亲为纯合基因型，父亲为杂合基因型的位点数量；

当logl为0时，胎儿为同卵双生或异卵双生的概率相等，各为50％；当logl大于0时，同卵双生的概率高于异卵双生的概率；当logl值小于0时，异卵双生的概率高于同卵双生。

本发明的有益效果如下：

本发明通过收集怀有双胎的孕妇的外周血，采用一种新的算法对双胞胎的合子性质(即同卵双生或异卵双生)进行鉴定的方法，本发明克服了现有鉴定方法的不足，属于一种无创的鉴定方法。本发明精准的合子鉴定方法将测序错误率纳入预测模型，模型变得复杂但考虑也更加全面，有助于更准确地判断双胞胎的合子性质。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是一种基于孕妇外周血对双胞胎合子性质的无创鉴定方法的流程图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参考图1，一种基于孕妇外周血对双胞胎合子性质的无创鉴定方法，包括：

第一步：采集母亲血浆样本和采集父亲身体组织样本。在本发明实施例中，采用10ml游离dna保存管，取母亲的静脉血液，再进行两次血浆分离可得到所述血浆样本。所述采集父亲身体组织样本可以是：血液样本或者其他可提取dna的样本，血浆用10ml游离dna保存管，其他用组织采样盒。

第二步：通过所述母亲血浆样本获得母亲的snp位点序列，通过所述父亲身体组织样本获得父亲snp位点序列。在本发明实施例中，通过所述血浆样本提取dna，然后母体血浆游离dna和经片段化处理后的父本dna，用于文库构建，再加入探针杂交捕获序列中的snp位点，再通过基因测序得到snp位点。所述探针是针对我们需要测序的位点设计的。

第三步：计算胎儿浓度f和测序错误率e。

具体地，当计算胎儿浓度f时，选择父亲和母亲snp位点中只包含有两种等位基因的位点，且母亲为一种纯合基因型，父亲为另一种纯合基因型，在本发明实施例中，假设母亲的纯合基因型为aa，父亲的纯合基因型tt，则

其中，n为所有符合母亲为一种纯合基因型，父亲为另一种纯合基因型的位点数，fi为通过第i个位点计算出的胎儿浓度，ni(a)和ni(t)分别为该位点a和t的测序深度。需要说明的是，上述计算方法假设以母亲为纯合基因型aa，父亲为另一种纯合基因型tt为例进行计算，在其他实施例中换成其他种基因型也是相同计算原理，例如父亲为cc，母亲为gg，在此不再赘述。

当计算测序错误率e时，选择父亲和母亲snp位点中只包含有两种等位基因的位点，且母亲和父亲为相同的纯合基因型；在本发明实施例中，假设母亲的纯合基因型为aa，父亲的纯合基因型aa，则

即e是将求出非a等位基因的深度占所有等位基因深度的比例；其中，z为所有符合要求的位点数，ei为第i个位点计算出的测序错误率，ni(c)和ni(g)分别为该位点c和g的测序深度。需要说明的是，上述计算方法假设以母亲为纯合基因型aa，父亲为纯合基因型aa为例进行计算，在其他实施例中换成其他种基因型也是相同计算原理，例如当母亲为纯合基因型tt，父亲为纯合基因型tt时，在此不再赘述。

第四步：计算双胞胎合子性质为同卵双生时所述血浆样本中出现a、t、c、g各深度分布的概率pm和双胞胎合子性质为异卵双生时所述血浆样本中出现a、t、c、g各深度分布的概率pt。

选择父亲和母亲snp位点中只包含有两种等位基因的位点，且母亲为纯合基因型，父亲为杂合基因型的情况；假设某个位点母亲的纯合基因型为aa，父亲的杂合基因型at,则双胞胎基因型的分布有以下几种情况：

根据上表，可以看出胎儿基因型的分布在同卵和异卵双胞胎中不同，是能够对双胞胎合子性质鉴定的基础。根据上表可知，双胞胎基因型有三种情况：(1)都为aa型；(2)都为at型；(3)一个为aa，一个为at型。因此下面分三种情况进行分析。

(1)当两个胎儿都为aa型时，此时各碱基概率为：

在这种情况下，母亲血浆中出现a、t、c、g各深度分布的条件概率为：

x为碱基出现的总深度，xa、xt、xc和xg分别为母亲血浆中a、t、c、g的深度。需要说明的是a、t、c、g的深度具体指的是各碱基的测序层数，测序深度一般需要大于50层。

(2)当两个胎儿都是杂合基因型at时，此时各碱基概率为：

在这种情况下，母亲血浆中出现a、t、c、g各深度分布的条件概率为：

x为碱基出现的总深度，xa、xt、xc和xg分别为母亲血浆中a、t、c、g的深度。

(3)当两个胎儿的基因型一个是aa一个是at时，此时各碱基概率为：

在这种情况下，母亲血浆中出现a、t、c、g各深度分布的条件概率为：

x为碱基出现的总深度，xa、xt、xc和xg分别为母亲血浆中a、t、c、g的深度。

pm＝0.5*p(plasma|fetus＝aa+aa)+0.5*p(plasma|fetus＝at+at)；

具体推导过程如下：

pt＝0.25*p(plasmafetus＝aa+aa)+0.25*p(plasmafetus＝at+at)+0.5*p(plasmafetus＝aa+at)；

具体推导过程如下：

其中，mz和dz分别表示胎儿为同卵双生和异卵双生。需要说明的是，当两个胎儿都为aa基因型时，p(plasma|fetus＝aa+aa,mz)＝p(plasma|fetus＝aa+aa,dz)＝p(plasma|fetus＝aa+aa)，即血浆中a、t、c、g分布的概率不受合子性质的影响，而p(plasma|fetus＝aa+aa)在胎儿都为aa基因型时已给出计算公式。胎儿为其他基因型时也是同理，在此不再赘述。

第五步：计算和其中，y为所有母亲为纯合基因型，父亲为杂合基因型的位点数量。

第六步，判断双胞胎合子性质。

当logl为0时，胎儿为同卵双生或异卵双生的概率相等，各为50％；当当logl大于0时，同卵双生的概率高于异卵双生的概率；当logl值小于0时，异卵双生的概率高于同卵双生。

需要说明的是，为便于理解，上述推导过程以母亲为aa，父亲为at基因型为例进行说明。事实上，只要满足snp位点只包含两种等位基因类型，母亲为纯合基因型，父亲为杂合基因型，则计算原理与上述完全相同，在此不再赘述。

在本发明实施例中，我们采集了一位母亲血浆样本和父亲身体组织样本，通过所述母亲血浆样本获得母亲的snp位点序列，通过所述父亲身体组织样本获得父亲snp位点序列。具体，采用trimmomatic软件对原始数据进行过滤，过滤掉q值<20的序列，然后通过fastqc软件进行质量控制，得到的双端(pe)reads用bwa0.7.17比对到参考基因组(hg19,build37.3)，用picard删除pcr重复，得到的reads去除多重比对。最后，使用soapsnp挖掘母亲血浆中各碱基的分布和对父亲基因型进行分型。根据上述公式，最终鉴定结果如下：

当logl等于3时，表示胎儿是同卵双生的概率为异卵双生的1000倍；同理，当logl等于-3时，表示胎儿是异卵双生的概率为同卵双生的1000倍。因此通过logl可以推断双胞胎的合子性质。此外，由于第1和第2组的测序错误率较高，如果不考虑此因素，可能会增加误判的概率，因此将测序错误率纳入预测模型有助于更准确地对双胞胎合子性质进行推断。

显然，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。