莲心碱作为5-脂氧合酶抑制剂的应用的制作方法

本公开属于5-脂氧合酶(5-lox)抑制剂技术领域，具体涉及莲心碱作为5-lox抑制剂的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

莲心碱(liensmine，lie)系从睡莲科莲属植物莲(nelumbonucifern)的莲子心中提取的一种双苄基四氢异喹啉类生物碱。目前研究表明，莲心碱具有降血压、抗心律失常，清除自由基，修复氧自由基与多不饱和脂肪酸反应引起机体的各种氧化损伤。

5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-lox)是炎症机制中的重要部分，是花生四烯酸(arachidonicacid，aa)代谢到白三烯a4(leukotrienea4，lta4)的关键酶，参与机体对外界刺激产生的炎症反应。目前，哺乳动物loxs的研究多侧重于分析其与细胞功能、肿瘤及癌症的关系，以及其在验证中促炎与抗炎作用。freiremoetal’s研究表明，炎症的消退是一个由多种细胞和抗炎、促炎消退介质共同参与的主动程序性过程，促炎消退脂质介质(specializedproresolvingmediators，spms)在其中发挥关键作用，通过限制多形核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophil，pmn)募集、诱导pmn凋亡以及清除组织细胞碎片等方式促进炎症机体恢复稳态，而5-lox则是合成spms的关键酶。

目前，关于5-lox抑制剂作为抗炎药物的相关报道较为丰富，其中不乏关于天然药物提取物在抗炎治疗中的应用。km等对伞形科植物dystaeniatakeshinana(nakai)根部进行提取分离得到香豆素、苯乙醇衍生物及黄酮类物质。其中，香豆素及黄酮限制较好的cox-2/5-lox抑制效应。假马齿苋[bacopamonniera(l.)wettst]是一种治疗炎症的印度草药,viji等从中分离得到了假马齿苋皂素,活性测试显示醇提物、乙酸乙酯组分以及假马齿苋皂素在鼠单核细胞模型中可显著抑制5-lox活性。

技术实现要素：

中医药作为我国具有原创优势的科技资源和创新药物发展的原动力，传承了历代医家几千年的用药经验，从中草药资源中发掘具有良好生物活性的单体成分，对于开发拥有自主知识产权的创新药物具有重要意义。本公开是基于文献挖掘，发现古代文献记载莲子心有“泻心，坚肾”(《医林纂要》)、“清心火，平肝火，泻脾火，降肺火”(《本草再新》)等传统功效，进一步通过分子对接、分子互作等相关实验研究从莲子心的物质成分中发现莲心碱(cas：2586-96-1)对5-lox有良好的抑制活性，提供了莲心碱作为5-lox抑制剂的应用，该研究结果启示莲心碱有望开发成为5-lox和/或白三烯相关疾病或炎症疾病的治疗药物。

针对上述技术效果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供莲心碱作为5-lox抑制剂的应用。

本公开第二方面，提供一种5-lox活性抑制剂，所述抑制剂当中包含莲心碱。

优选的，所述5-lox活性抑制剂为5-lox活性抑制模型工具药物。

优选的，所述5-lox活性抑制剂为5-lox抑制剂药物。

本公开通过分子互作实验筛选证实莲心碱对于5-lox具有良好的抑制活性。基于该研究结果，本领域技术人员可以容易的联想到将莲心碱用于5-lox抑制模型的制备，以及5-lox抑制药物的开发和应用。

进一步优选的，所述5-lox抑制剂药物包括但不限于脑缺血性损伤、pd炎症、神经退行性疾病、神经元损伤、脑脊髓损伤、帕金森病、阿尔兹海默病、溃疡性结肠炎和急性胰腺炎等疾病。

本公开第三方面，提供莲心碱在制备用于预防和/或治疗与5-lox相关的疾病或病症的药物中的应用。

本公开第四方面，提供用于治疗与5-lox相关的疾病的药物组合物或药物制剂，其包含莲心碱。

优选的，莲心碱作为活性成分占该组合物或药物制剂总重量的1-99％。

发明人通过实验发现莲心碱具有优越的5-lox抑制活性，本公开提供的化合物也许将成为治疗与5-lox和/或白三烯相关的疾病的强效的化学实体。可用于制备5-lox抑制剂、5-lox抑制剂的实验模型工具药或制备用于预防和/或治疗白三烯相关疾病的药物。

在本公开的一些实施方式中，本公开的药物组合物含有治疗有效量的莲心碱，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。该药用组合物还可以进一步包含气味剂、香味剂等常规辅料。

在本公开的一些实施方式中，本公开所提供的药物组合物优选含有重量比为1-99％的活性成份，其理想的比例是，莲心碱作为活性成分占总重量比65-99％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液；本公开不排除一种或多种与莲心碱具有相同或近似活性的成分间的联用，而这种联用很大可能上会降低莲心碱在组合物中的用量，比如该用量占总重量的1-65％，也有可能在联用效果极好时，极大地降低莲心碱的使用量，比如该用量会低至占总重量的不足1％，本领域技术人员视具体情形通过常规实验可以获得所需的用量。

本公开所述莲心碱和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。

这些药物组合物通常安全、无毒且为生物学上所需要的，因此，本公开中所述药学上可接受的载体或赋形剂是无毒且安全的，而且其与莲心碱的组合也是无毒且安全的。本公开所述的药学上可接受的载体和赋形剂通常为本领域人员所熟知的，或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的。

所述药学上可接受的辅料包括但不限于赋形剂、载体等等。本领域技术人员可根据赋形剂所具有的不同的目的，选择适宜的赋形剂。比如根据药物性质或者给药模式，常用的赋形剂比如溶剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、填充剂、乳化剂、粘结剂、崩解剂、稳定剂、矫味剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、ph调节剂、压力调节剂等，或者这些种类中的二种或多种的组合等等。

莲心碱或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是常规剂型，比如液体剂型例如乳剂剂型、胶体类、真溶液类、微粒剂型、混旋剂型；比如其他常规机型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、口服液、粉剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包合物、填埋剂等。这些剂型可按照药学领域的常规制备方法制备，比如混合、制粒、压片、填充、溶解或混悬分散等。其制剂配方的单位计量中包含0.05-200mg莲心碱，优选地，制剂配方的单位计量中包含0.1mg-100mg莲心碱。

本公开的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

本公开针对天然单体化合物进行筛选，结果表明莲心碱对5-lox具有良好的抑制活性。本公开进一步通过酶促反应实验确定了莲心碱对5-lox的半数抑制浓度为1.456mg/ml，并通过分子对接实验对莲心碱的具体抑制机制进行探究，为莲心碱作为5-lox抑制剂加以应用提供了进一步的依据。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中分子互作实验结果图；

图2为实施例1中酶促反应实验酶抑制率结果图；

图3为实施例1中分子互作实验模型图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，5-lox在机体炎症反应通路中具有重要的意义，本公开提供了天然药物中的单体成分——莲心碱作为5-lox抑制剂的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1)互作实验：

将5-lox用醋酸盐缓冲溶液(ph＝4.5)稀释为20μg/ml采用氨基偶联的方式偶联至cm5芯片上(偶联量为6452ru)，将莲心碱以及阳性对照药物棉酚分别溶于dmso中至10mmol/l，用pbs-p稀释至500μmol/l再用缓冲溶液pbs-p+(含5％dmso)稀释为250μm作为最高进样浓度，逐步设置浓度梯度进样，最终中确定最佳浓度梯度为5、2.5、1.25、0.625、0.31μmol/l，依次进样，结果如图1所示。用biacoret200evaluationsoftware进行数据分析可以得到ka,kd,kd，ka(1/ms)＝308.8、kd(1/s)＝0.02639、kd(m)＝8.547e-5。

其中ka,代表结合常数，单位是1/ms；kd,代表解离常数，单位是1/s；kd,代表亲和力，kd＝kd/ka,此时亲和力kd越小，则药物解离越少。根据检测结果，莲心碱与5-lox有良好的亲和力，以及较低的解离常数，证明莲心碱有望作为一种长效抑制5-lox的化学单体。

2)酶促反应实验：

本实施例中，通过酶促反应实验检测莲心碱对5-lox酶活性的抑制作用。空白组采用灭活的5-lox作为参照，实验组包括对照组及样品组，分别向5-lox中加入莲心碱样品及空白溶剂，通过检测吸光度确定酶的活性。

步骤：将样品溶于dmso，配置溶液浓度为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.31mg/ml、0mg/ml，设置三个平行组，如上表格进行分组以及加样，加样至pbs后线性振摇4sec，37℃孵育20min后加入aa，加入aa时边孵育边加入，最后加入tmpd，最终于酶标611nm下进行吸光度检测，5-lox抑制率如图2所示。

611nm波长测吸光度，检测抑制率。试剂浓度如下：

10mmpbsph＝8.0

hrp2mg+1ml(pbs)＝2mg/ml

aa10mm

tmpd8mg+2ml(pbs)＝4g/l母液，临用前稀释为0.5g/l.

5-lox30ul+1970ul(pbs)＝0.1ug/ml

加样方式如表1所示，经prism5.0计算结果ic50＝1.456mg/ml。

表1

3)分子对接

运用dsmodeler模块进行5-lox的晶体构建，通过序列比对，将来自pdb数据库中的3v98作为模板进行构建(相似度是92.5％)，运用cdocker算法进行莲心碱与5-lox的对接计算，poseclusterradius设置为0.5，orientationtorefine设置为10，计算范围是(-18.7328,73.129,2.09484)，半径设置为12.。结果如图3所示，莲心碱与arg247、leu449、thr546形成氢键，与ile366、ala454、val244形成疏水键，与asp443形成静电中心与5-lox发生相互作用。(注：arg代表精氨酸；leu代表亮氨酸；thr代表苏氨酸；ile代表异亮氨酸；ala代表丙氨酸；val代表缬氨酸；arg247代表5-lox序列的第247位为精氨酸，leu449表示5-lox序列的第449位为亮氨酸，其他可以以此类推。)

通过分子对接实验进一步验证了莲心碱能够与5-lox结合发挥抑制活性，并且为莲心碱的具体抑制方式提供了可供参考的依据。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。