红细胞和活化的血小板细胞膜作为载体在制备血栓治疗药物中的应用的制作方法

本发明涉及医学血栓治疗技术领域，具体涉及一种红细胞和活化的血小板细胞膜作为载体在血栓治疗中的应用。

背景技术：

当病理学进程已经无法由止血调控机制进行调控时，大量的凝血酶将会产生，从而引发血栓的形成。血栓形成是心血管疾病产生的重要因素，例如心肌梗死和中风等动脉疾病和静脉血栓栓塞紊乱，血栓的形成导致高发病率和死亡率。除此之外，静脉血栓症是导致癌症病人死亡的主要原因之一。

血栓的形成和多种因素有关，包括血小板、纤维蛋白、胶原、组织因子和凝血酶等。当血管壁受损或内皮细胞被破坏，胶原和组织因子暴露在流动的血液中，从而启动了血栓的形成。暴露的胶原引发了血小板的激活和聚集，同样的，组织因子的暴露导致了凝血酶的产生。凝血酶不止催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，同时也可以活化血小板。

血小板激活可以由两种独立的方式进行。研究人员从小鼠身上发现了有两种独立的方式可以分别激活血小板。一种方式为内皮下的胶原暴露启动了血小板的激活；另一种方式为血管壁或流动的血液中所包含的组织因子产生的凝血酶导致了血小板的活化。这两种方式谁占主导作用取决于血小板激活是因为受伤还是因为疾病，但无论是哪种方式占主导，最终导致的结果是相同的。

尚未成熟的血栓会在后续招募未受刺激的血小板，但是并不是所有招募过来的血小板最终都会形成血栓，一部分血小板还会脱离血栓部位。简而言之，血栓的形成是一种动态的过程，在这个过程中，一些血小板会粘附在血栓部位，而另一些血小板则从血栓部位分离。血栓凝结块的组成或结构很大程度上取决于剪切力、流动性、波动和循环中血小板的数量等因素。

急性炎症和感染、内毒素血症和败血症等会导致血液形成高凝状态。当调节机制已经无法进行调控时，急性弥散性血管内凝血继而发生，伴随着大量消耗凝血相关蛋白和血小板，最终导致出血的情况。而病人处于慢性弥散性血管内凝血状态时，相比于出血，血栓的形成情况更为严峻。血栓形成和炎症反应互相关联，并相互加强。

组织因子可以在体内循环的携带组织因子的微颗粒(tissuefactor–bearingmicroparticles)、单核细胞和活化的内皮细胞上进行表达。慢性弥散性血管内凝血导致血栓形成的主要原因是内源性凝血途径的破坏。在正常血液中无法检测出组织因子的活性，然而在健康的人体内存在携带组织因子的微颗粒。微颗粒携带的组织因子在被招募到血管损伤位点时会被激活。处于病态的微颗粒可以携带活化的组织因子，可能会导致血栓栓塞的发生。肿瘤细胞或炎症细胞产生的携带组织因子的微颗粒可以导致血栓的发生，携带活化的组织因子的微颗粒可以被用作血栓形成风险增加的生物标志物。癌症增加血栓风险的原因可能包括以下几点：肿瘤部位的组织因子激活了凝血途径；半胱氨酸蛋白酶激活了凝血因子x；黏性糖蛋白的产生；met致癌基因的激活以及肿瘤衍生的携带组织因子的微颗粒。

如果动脉粥样硬化没有导致血栓形成(急性冠状动脉疾病的主要致病过程)，那么动脉粥样硬化将属于一种慢性病，该病与血管狭窄病变导致靶器官血流减少有关，不会导致高死亡率。冠状动脉壁上长期的动脉粥样硬化损伤具有扩散的趋势，并且该趋势与斑块是否具有梗阻能力相关。目前的假设是，斑块纤维帽的破裂将细胞外基质中的胶原蛋白暴露于血液，从而引发血栓形成，该步骤先于含脂质巨噬细胞包含的组织因子暴露，或二者同时发生。组织因子是动脉粥样化的组成部分，并且在冠状动脉血栓形成过程中扮演重要角色。在冠状动脉损伤动物模型中，组织因子抑制剂的使用有效减小了血栓的尺寸。

新型的药物制剂在治疗和预防血栓类疾病方面具有替代华法林、肝素以及低分子量肝素等临床常用凝血抑制剂的潜在趋势，最前沿的策略是直接抑制fxa或凝血酶。这些新药相比于传统的凝血抑制剂提高了方便性、安全性，并具有等效或更加高效的特点。然而，这些抑制剂的靶点与肝素或华法林的靶点相同，可能会导致止血过程受阻，从而在抑制血栓形成时引发出血。理想的抗栓药物应该只抑制血栓却不影响止血过程。血栓形成的机制在不同情境下并不完全相同。发展用来阻止与特定疾病相关血栓形成的病理学制剂，应该考虑不同影响机制的变化。

凝血系统作为人体中最重要的防护机制之一，是维持体内稳态，保证体内不受外界干扰的重要屏障。当把纳米材料通过静脉给药进入体内时，势必要经过血液循环系统，而研究纳米材料是否对动物体内的凝血系统产生影响则成为评价其安全性的首要任务。在复杂的生物体内环境中，天然的细胞膜包裹被认为是一种合理的纳米颗粒设计方法。细胞膜作为细胞的最外层结构，通过与周围环境中的配体、其他细胞和细胞外基质接触，以完成其特定的功能。细胞膜包覆的方法可以赋予纳米颗粒细胞的生物界面能力，包括延长循环时间，降低网状内皮系统摄取率，降低免疫原性，甚至靶向能力。我们应用了单纯纳米颗粒以及分别包覆了红细胞膜以及活化的血小板膜的纳米进行了体外靶向性实验，通过实验我们可以得出细胞膜包覆的纳米颗粒可以显著提高纳米颗粒在纤维蛋白的富集能力，降低网状内皮系统的摄取的作用。但是在机体复杂的环境中，细胞膜包覆的纳米颗粒是否能够在血栓部位富集，并达到良好的溶栓效果还有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：

目前，多种溶栓药物如链激酶、尿激酶和组织纤溶酶原激活剂被用于治疗血栓栓塞。从链球菌中提取的链激酶具有免疫原性。尿激酶作为人体内的一种固有酶，不具有免疫原性。两者的半衰期都极短，对血栓无靶向性。组织纤溶酶原激活剂(tpa)是一种新型的溶栓药物，对纤维蛋白具有很高的亲和力，但成本高，限制了其在不发达国家的广泛应用。这些药物在血液系统中都存在半衰期短、易失活、易被清除、靶向性不足且存在出血相关风险等。因此，开发一种能够将溶栓药物运送到局部血栓部位的药物传递系统，以达到更好的溶栓效果和减少全身副作用的目的是非常重要的。

为实现上述目的，本发明提供一种红细胞膜和活化的血小板膜包覆的药物传递系统在溶栓治疗方面的应用。研究发现红细胞膜和活化的血小板膜包覆的药物传递系统具有明显的溶栓效果。通过生物膜载带溶栓药物能够增强血栓的靶向性和富集程度，显著延长循环时间，降低出血风险，起到良好的溶栓效果。

本发明的任务之一在于提供细胞膜作为载体在制备溶栓和/或抗栓治疗药物中的应用。

上述的细胞膜为红细胞膜和活化的血小板膜。

本发明的另一任务在于提供细胞膜作为载体包覆纳米颗粒载药系统在制备溶栓和/或抗栓治疗药物中的应用。

上述的细胞膜为红细胞膜和活化的血小板膜。

本发明的任务之三在于提供一种用于抑制和/或溶解血栓的组合物，其包括溶栓药物、介孔硅、红细胞膜、活化的血小板膜及在各种生理病理条件下的衍生膜。

经试验研究，申请人惊喜的发现，上述组合物能够溶解血栓和抗血栓形成。

进一步优选，上述的组合物还包括溶剂和/或药学上可接受的载体。

本发明的任务之四在于提供上述一种用于抑制和/或溶解血栓的组合物的制备方法，其是利用所述的介孔硅通过物理吸附的方式吸附所述溶栓药物，通过所述的红细胞膜和活化的血小板膜包覆介孔硅所得。

进一步的，上述的制备方法具体包括：

所述的介孔硅和所述的溶栓药物按照一定的配比混合后并置于室温搅拌一段时间来完成吸附；将红细胞膜和活化的血小板膜加入至混合后的介孔硅和溶栓药物中，经超声振荡，得混合体系，将该混合体系加入到截留分子量3500的透析袋中透析，即得。

上述的用于抑制和/或溶解血栓的组合物在制备溶栓和/或抗栓治疗药物中的应用。

进一步的，上述的应用，其给药方式采用静脉注射、腹腔内注射或局部给药。

进一步的，上述的溶栓药物为富勒醇或/和含有富勒醇的组合物。

血小板和红细胞作为血栓中的重要组成成分，在血管形成的过程中聚集在血栓中。同时能够有与纤维蛋白相互作用，影响的血栓的形成和稳定性。作为机体的固有成分，不会进一步引起凝血级联反应。已有研究表明，红细胞膜和活化的血小板膜具有免疫逃逸,长循环时间,和减少网状内皮系统系统捕获的能力。因此，血小板和红细胞膜包裹系统非常适合用于溶栓治疗。

与现有技术相比，本发明带来了以下有益技术效果：

红细胞膜和活化的血小板膜包覆的药物传递系统具有良好的生物相容性，血液半衰期长，提高药物对纤维蛋白(原)的靶向性，提高了溶栓药在血栓部位的药物浓度，提高溶栓效果，同时降低出血风险。在与目前临床上应用的脂质体包覆的药物传递载体相比，生物膜包覆的药物传递不会导致凝血级联反应，不会促进血栓形成，不会产生anti-pegigm抗体等优点。

目前临床应用的溶栓药物，半衰期短，出血风险高，缺乏靶向性等种种原因限制了溶栓药物的使用。基于此，本发明构建的红细胞膜和活化的血小板膜伪装颗粒，发现这两种细胞衍生的膜载药体系具有良好的生物安全性，抗巨噬细胞吞噬效果。利用这两种细胞的膜伪装载药体系载带富勒醇纳米颗粒，其血液安全性好，血液半衰期延长，降低出血风险，并且溶栓效果显著增强。

附图说明

下面结合附图说明对本发明做进一步说明：

图1为红细胞和活化的血小板膜包覆的载药体系的构建和表征，其中：

a为氮气吸附-脱附实验；

b为动态光散射检测纳米颗粒的水合粒径；

c为纳米颗粒的zate电势变化；

d为红细胞膜包覆纳米颗粒(rnp)的sem和tem图像；

e为活化的血小板膜包覆纳米颗粒(pnp)的sem和tem图像；

f为纳米颗粒表面蛋白的sds-page结果；

图2为膜伪装颗粒对huvec和hepg-2细胞活力影响；其中，依次为rnp孵育24小时，48小时和72小时对huvec和hepg-2细胞活力的影响，图(2d)、(2e)、(2f)依次为pnp孵育24小时，48小时和72小时对huvec和hepg-2细胞活力的影响。

图3为膜伪装颗粒对huvec/hepg-2细胞凋亡；

图4为膜伪装颗粒能够延长循环时间，其中(a)纳米颗粒在大鼠个组织脏器中的分布(心、肝、脾、肺和肾)(b)纳米颗粒的血液半衰期(c)平均荧光强度统计(d)raw246.7细胞对纳米颗粒的摄取情况；

图5为膜伪装颗粒的靶向性，其中(a)纳米颗粒纤维蛋白的富集情况(b)纳米颗粒在血栓部位的富集情况；

图6为膜伪装颗粒溶栓效果，其中(a)纳米颗粒对三氯化铁制备的颈动脉血栓模型的治疗效果(b)血栓重量的统计结果和血栓闭合程度的统计结果；

图7为膜伪装颗粒抗栓效果，其中(a)纳米颗粒对三氯化铁制备的颈动脉血栓模型的治疗效果(b)血栓重量的统计结果和血栓闭合程度的统计结果；

图8为膜伪装颗粒颗粒的体内安全性评价，其中(a)剪尾实验评价纳米颗粒的出血风险(b)纳米颗粒对血细胞数目影响(c)心、肝、脾、肺和肾的he结果评价纳米颗粒在体内的安全性。

具体实施方式

本发明提出了一种红细胞和活化的血小板细胞膜作为载体在制备血栓治疗药物中的应用，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。

本发明所需原料均可通过商业渠道购买获得。

实施例1：

制备血栓抑制组合物：

所需组分：溶栓药物、介孔硅、红细胞膜及活化的血小板膜。

制备方法：

第一步、大鼠心脏取血，通过离心，分离获得红细胞和血小板，加入低渗溶液，放入液氮中，进行反复冻融5次，除去细胞内容物，获得红细胞膜和活化的血小板膜。

第二步、合成140nm左右的介孔硅，按照一定的比例混合介孔硅和溶栓药物，室温搅拌24小时。加入红细胞膜和活化的血小板膜，超声2分钟。将混合体系加入到截留分子量3500的透析袋中透析72小时，收集伪装纳米载药颗粒作为血栓抑制组合物。

实施例2：

制备血栓抑制组合物：

所需组分：溶栓药物、介孔硅、红细胞膜、活化的血小板膜及溶剂生理盐水。

制备方法：

将实施例1中的血栓抑制组合物分散在生理盐水中即获得。

具体实验步骤：

1.1红细胞膜(rnp)以及活化的血小板膜包覆的介孔硅载药体系的构建和表征

大鼠心脏取血，通过离心，分离获得红细胞和血小板，加入低渗溶液，放入液氮中，进行反复冻融5次，除去细胞内容物，获得红细胞膜和活化的血小板膜。

合成140nm左右的介孔硅，按照一定比例的比例混合介孔硅和溶栓药物，室温搅拌24小时。加入红细胞膜和活化的血小板膜，超声2分钟。将混合体系加入到截留分子量3500的透析袋中透析72小时，收集伪装纳米载药颗粒。粒径分析仪分析水合粒径和zeta电势。sem电镜检测形态。透射电子显微镜(tem)鉴定细胞膜包覆效果。sds-page检测伪装颗粒表面的蛋白与细胞膜蛋白的一致性。如图1所示，其中，a为氮气吸附-脱附实验；b为动态光散射检测纳米颗粒的水合粒径；c为纳米颗粒的zate电势变化；d为红细胞膜包覆纳米颗粒(rnp)的sem和tem图像；e为活化的血小板膜包覆纳米颗粒(pnp)的sem和tem图像；f为纳米颗粒表面蛋白的sds-page结果。

1.2为膜伪装颗粒对huvec和hepg-2细胞活力影响

细胞存活率：人脐静脉血管内皮细胞(huvec)和肝癌细胞(hepg-2)接种于96孔板中，加入不同的药物处理，孵育24小时，48小时和72小时，用cck-8检测试剂盒检测细胞的存活率变化；如图2所示，图中，(2a)、(2b)、(2c)依次为rnp孵育24小时，48小时和72小时对huvec和hepg-2细胞活力的影响，图(2d)、(2e)、(2f)依次为pnp孵育24小时，48小时和72小时对huvec和hepg-2细胞活力的影响

1.3为膜伪装颗粒对huvec细胞凋亡的影响

细胞凋亡检测：人脐静脉血管内皮细胞(huvec)接种于6孔板中，加入不同的药物处理24小时后，消化成单细胞，利用annexin-v/pi细胞凋亡检测试剂盒进行染色，通过流式分析检测细胞凋亡比例变化，如图3所示。

1.4膜伪装颗粒血液安全性评价

大鼠心脏，20mmedta·2na抗凝，经离心获得血细胞，pbs清洗3次后，计数后，取2x105个细胞加入1mg/mlrnp(pnp)，37℃孵育4小时后，2500rpm，离心10min，取上清于541nm处检测吸光度。

1.5膜伪装颗粒的脏器分布

以20％三氯化铁制备大鼠颈动脉血栓模型。大鼠麻醉后，将浸泡于20％三氯化铁的1cmx2cm的滤纸片孵在左侧颈动脉。5min后，取出滤纸片，尾静脉注射1mg/ml的膜伪装颗粒纳米颗粒后一小时后，取出心、肝、脾、肺和肾在小动物活体成像仪中进行荧光成像。如图4所示。

1.6膜伪装颗粒的血液半衰期

将fitc标记的纳米颗粒以1mg/ml的剂量尾静脉注射后(每组3只大鼠)，分别在5min，30min，1h，2h，3h，4h，8h和24h眼眶采血，经离心后，取上清，用生理盐水5倍稀释后，检测fitc的荧光强度，拟合曲线，计算血液半衰期。

1.7raw246.7对纳米颗粒的摄取情况。

将raw246.7细胞接种于confocal小皿中，待细胞贴壁后，加入10ug/ml的纳米颗粒，37℃培养两小时后，加入pbs清洗3次，hoechst33342避光孵育30min后，pbs清洗3次，共聚焦显微镜进行荧光成像并统计分析。

1.8膜伪装颗粒的靶向性

将20μl0.5u/ml的凝血酶与20mm的tris-hcl(ph＝7.4)和纤维蛋白原混匀，在37℃孵育1h，使之形成成熟的纤维蛋白聚合物，加入1mg/ml的纳米颗粒孵育1min，pbs清洗3次。将沉淀转移至硅片，经过戊二醛固定，酒精梯度脱水后，通过扫描电子显微镜观察纤维蛋白的形态变化。结果如图5所示。

大鼠麻醉后，将浸泡于20％三氯化铁的1cmx2cm的滤纸片孵在左侧颈动脉。5min后，取出滤纸片，尾静脉注射1mg/ml的膜伪装颗粒纳米颗粒后一小时后，取出颈动脉于小动物活体成像仪中进行荧光成像并统计光子数。

1.9膜伪装颗粒溶栓效果

本实验利用血栓模型来检测膜伪装颗粒的体内溶栓情况。首先，使用戊巴比妥钠利用腹腔注射的方式将160g左右的sd大鼠进行麻醉。注射后立即使用手术工具将大鼠的左侧颈动脉进行分离暴露，其余组织利用止血钳进行分离固定，为了之后的实验药品不会腐蚀其它组织，将适宜尺寸的透明保鲜膜垫在血管和组织之间。将滤纸片裁剪成1cm×2cm大小，浸入至20％fecl3溶液中，使其完全浸满fecl3溶液，再将滤纸片环形包覆在已暴露的动脉血管周围，开始计时，5min后，将滤纸片取走，在刚刚包覆的部位利用无菌生理盐水进行清洗，清洗三次后，通过尾静脉注射的方式注射纳米颗粒。20min后利用止血钳将损伤部位血管两端钳住，利用锋利的手术剪刀轻轻剪下损伤部位血管，立即放入组织容器中，置于4％多聚甲醛中，4℃固定24-48h。之后，将固定好的组织进行石蜡包埋切片，再进行苏木精-伊红(he)染色，切片结果利用多功能光学显微镜进行拍照记录，利用imagej进行照片中血栓定量的统计,并称重血栓重量。结果如图6所示。

1.10膜伪装颗粒的抗血栓形成效果

本实验利用血栓模型来检测膜伪装颗粒的体内抗爽情况。首先，使用戊巴比妥钠利用腹腔注射的方式将160g左右的sd大鼠进行麻醉。将伪装颗粒药物尾静脉注射到大鼠体内。而后立即使用手术工具将大鼠的左侧颈动脉进行分离暴露，其余组织利用止血钳进行分离固定，为了之后的实验药品不会腐蚀其它组织，将适宜尺寸的透明保鲜膜垫在血管和组织之间。将滤纸片裁剪成1cm×2cm大小，浸入至20％fecl3溶液中，使其完全浸满fecl3溶液，再将滤纸片环形包覆在已暴露的动脉血管周围，开始计时，5min后，将滤纸片取走，在刚刚包覆的部位利用无菌生理盐水进行清洗，清洗三次后，通过尾静脉注射的方式注射纳米颗粒。20min后利用止血钳将损伤部位血管两端钳住，利用锋利的手术剪刀轻轻剪下损伤部位血管，立即放入组织容器中，置于4％多聚甲醛中，4℃固定24-48h。之后，将固定好的组织进行石蜡包埋切片，再进行苏木精-伊红(he)染色，切片结果利用多功能光学显微镜进行拍照记录，利用imagej进行照片中血栓定量的统计,并称重血栓重量。结果如图7所示。

1.11膜伪装颗粒的体内安全性评价

将生理盐水、富勒醇、介孔硅、红细胞伪装颗粒和血小板伪装颗粒通过尾静脉注射入大鼠体内，1小时后，血常规分析仪检测血液中白细胞、红细胞、血小板以及中性粒细胞的变化，结果如图8所示。

发明中未述及的部分借鉴现有技术即可实现。

需要说明的是：在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。