提升supt4h在细胞中核苷酸重复序列扩张基因的转录调控能力的方法
技术领域：
：[0001]非临时申请案要求优先权是根据美国专利法条35u.s.c.§119(a)，根据专利no(s).(62/620,308)在2018年1月22日于美国提交，上述所列的专利参考文献全体皆引用作为本说明书的揭示内容。
背景技术：
：：[0002]核苷酸重复序列扩张疾病包括由简单串联重复(通常是三核苷酸重复序列)的不稳定性和扩张所引起的遗传性疾病组，致病性核苷酸重复序列扩张可发生在基因的编码或非编码序列中，例如弗里德赖希共济失调(friedreich'sataxia)之类的疾病中，非编码序列的扩张引起基因转录静默或下调，造成基因丧失功能，因此为隐性遗传。相反的，在亨丁顿氏舞蹈症(huntingtondisease)的病症中，cag三核苷酸扩张发生在基因的编码序列中，因此产生的蛋白质含有异常长度的麸酰胺酸(glutamine，谷氨酰胺)片段，导致蛋白质的功能变异并且对细胞产生毒害，这为显性遗传。[0003]三核苷酸重复序列扩张疾病(trinucleotiderepeatdisorders)(也称为三核苷酸重复扩张疾病、三联体重复扩张疾病或密码子重复疾病)是由三核苷酸重复序列异常扩张引起的一组遗传性疾病。三核苷酸重复扩张可发生在基因的编码序列中或内含子中，当核苷酸重复次数超过正常、稳定的阈值就会造成疾病的产生，并且每个基因产生病变所需的重复次数稍有不同；如果三核苷酸重复扩张存在于基因的编码序列中，则该突变可能导致缺陷基因，如果三核苷酸重复扩张存在于内含子中，则可能在细胞核中形成rna焦点，引起毒性作用。在超过一半这个类型的疾病中，重复密码子是cag，如果该核苷酸重复扩张存在于编码区中，这些疾病通常被称为多麸酰胺酸(或polyq)疾病，其余的被归类为非多麸酰胺酸疾病。[0004]表1.非多麸酰胺酸疾病[0005][0006][0007]肌强直萎缩症(dm，muotonicdystrophy)是最常见的成人肌肉萎缩症，其特征为渐进式的肌功能退化、肌强直和多重器官功能受损，迄今为止，已经鉴定了经由相似基因突变机制所引起的两种不同疾病；第1型肌强直萎缩症(dm1，steinert病)是由dmpk中的ctg核苷酸序列扩张所引起的，而第2型肌强直萎缩症(dm2)是由cnbp中的cctg核苷酸序列扩张所引起。此第2型肌强直萎缩症(dm2)是由第三条染色体上cnbp基因突变引起，特征为cnbp基因中胞嘧啶-胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟苷(cctg)四核苷酸的序列扩张，由于它涉及四个核苷酸的重复序列，所以它不是三核苷酸重复序列疾病，而是四核苷酸重复序列疾病，dm2的核苷酸重复扩张比dm1大得多，范围从75次重复到超过11,000次重复。[0008]此外，最近发现c9orf72基因突变是遗传性als和额颞叶痴呆最常见的原因。c9orf72基因突变在als的致病机制导因于六核苷酸重复序列ggggcc位于c9orf72内含子中的异常扩张，从未受影响的个体中的少数重复次数到受影响个体中的数百甚至数千个重复次数。[0009]脊髓小脑运动失调症第10型(sca10)的特征在于渐进式小脑运动功能失调，通常始于平衡不良和步态不稳，接着上肢运动失调，构音障碍和吞咽困难；一些人同时具有认知功能障碍、行为障碍、情绪障碍、轻度锥体束征和周围神经性病变，发病年龄从12岁到48岁不等。脊髓小脑运动失调症第10型(sca10)的诊断可基于临床发现并通过分子遗传学检测确认，以atxn10是否具有异常的attct五核苷酸重复序列扩张作为评估基准，atxn10基因突变已知是导致该病症的唯一因子，受影响的个体具有核苷酸序列扩张的等位基因，其重复次数高达4,500个，核苷酸重复次数较少时(280至850个重复次数)则会有较低的疾病外显率。[0010]脊髓小脑性运动失调第31型(sca31)是成人发作的显性遗传神经性病变，主要影响浦金氏细胞。最近，科学家发现脊髓小脑性运动失调第31型(sca31)是一种含有taaaa、tagaa和tggaa的复杂五核苷酸重复序列扩张所造成，该重复序列的大小范围为2.8至3.5千碱基对(kb)，在这些重复序列中，tggaa扩张对于脊髓小脑性运动失调第31型(sca31)发病机制是至关重要的。[0011]多麸酰胺酸(或polyq)疾病是一种遗传神经退化性疾病，由九种不同的疾病组成，它们包括亨丁顿氏舞蹈症(hd)、齿状红核苍白球肌萎缩症(drpla)、脊髓延髓肌肉萎缩症(sbma)和第1型、第2型、第3型、第6型、第7型和第17型小脑脊髓干运动失调症候群(sca1、2、3、6、7、17)，因为这些疾病的基因突变是由编码序列中的cag重复序列扩张引起，所以它们也被称为cag重复疾病。[0012]在这些多麸酰胺酸(或polyq)疾病中共有的病理特征是这些疾病的患者都被发现在其脑中具有蛋白质沉积物，虽然这些蛋白质沉积物由不同的疾病蛋白质构成，但蛋白质都含有扩张的麸酰胺酸片段，迄今为止，疾病相关蛋白质的多麸酰胺酸(polyq)扩张，是所有多麸酰胺酸(polyq)疾病中突变基因产物的共同特征及致病因子。[0013]通常，基因中cag重复的次数可以从小于36的良性数量到37或更多的病理数量，多次重复的cag序列与疾病的病理相关，因为含有长链麸酰胺酸的蛋白质和多肽具有体外形成淀粉样蛋白原纤维(蛋白质聚集体与β-折迭结构的聚合)的倾向(scherzinger等,1997)，异常扩增的polyq被认为会导致不同的蛋白质构象，并造成突变蛋白质聚集和最终的神经元细胞死亡(zoghbi和orr，2000)。[0014]于人体内，多麸酰胺酸(polyq)突变蛋白质在中枢神经系统(cns)细胞中广泛地表达，然而神经元的特定群组细胞对前述各个不同疾病蛋白质的感受度及病理反应不尽相同，因此可依照病患神经退化的脑区与临床特征，进而区分为九种不同的疾病。疾病之严重程度与cag序列重复的次数相关，以hd为例，当cag序列重复次数在28-35个之间仍属正常，35-40个被认为是低外显率(reducedpenetrance)，而重复次数大于40个则认为是高外显率(fullpenetrance)。[0015]表2列出了由于基因中含有扩张的cag重复序列所衍生的八种疾病，表中标列出这些疾病的突变基因、及其可导致患病的重复序列长度。第6型小脑脊髓干运动失调症候群(sca6)不包括在此列表中，因为sca6与其他多麸酰胺酸(polyq)疾病不同，其cag重复序列的长度不是决定发病时间的决定因子，同时，致病的核苷酸重复序列长度也比其他多麸酰胺酸(polyq)疾病短得多，当sca6的cag重复序列次数为21～30个之间，即足以引起病理表达型。[0016]表2.含有扩张的cag重复序列的基因所衍生的八种疾病[0017][0018]上述八种疾病中，亨丁顿氏舞蹈症(hd)对病患的影响较为一般大众所熟知，该疾病与特定的神经元细胞死亡有关，主要发生在皮层与纹状体中，这是一种致命的遗传性疾病，该疾病会逐渐使病患的行动能力丧失及认知失调，造成病患及病患家人承受重大经济与情感上的负担。亨丁顿氏舞蹈症(hd)的出现率在西欧人种中特别普遍(约20,000之1)，不幸的是，目前无法治愈这种可怕的疾病。[0019]目前，针对亨丁顿氏舞蹈症(hd)的治疗方法主要是症状的控制，例如，fda最近批准的化合物之一，丁苯那嗪(tetrabenazine)，为一种用于减少亨丁顿氏舞蹈症(hd)病患运动机能亢进的药物；丁苯那嗪(tetrabenazine)为一种囊泡单胺转运体(vmat)抑制剂，会促进神经传导物的降解，因此，此药物仅能治疗症状，而非根治该疾病。目前用于治疗亨丁顿氏舞蹈症(hd)的其他药物还有抗精神病药(neuroleptics)与苯二氮平类药物(benzodiazepines)这二种。随着病情的发展，针对不同亨丁顿氏舞蹈症(hd)的症状做治疗的药物，还包括抗精神病药物(antipsychotics)，以及用于抗运动机能减退的药物，但是目前并没有任何的治疗方法是可以根治亨丁顿氏舞蹈症(hd)。[0020]如上所述，亨丁顿氏舞蹈症(hd)的根本原因是htt基因中cag重复序列的异常扩增。在正常人中，大约有8-25个cag核苷酸重复序列在htt基因中，但亨丁顿氏舞蹈症(hd)病患，其cag重复序列的次数扩大增加至36个或更多，因为这种致病基因是显性的，所以若一旦经由遗传而得到一个突变的htt基因就会发展亨丁顿氏舞蹈症(hd)。[0021]根据2003年及2004年sanchez及tanaka等人的细胞模式与动物研究显示：在亨丁顿氏舞蹈症(hd)病理发展中，突变htt基因产物所形成的蛋白质聚集扮演着关键角色。当蛋白质水解时，突变的htt蛋白质可留下包含polyq扩张的片段；当高度重复的麸酰胺酸(glutamine)片段存在于突变的htt蛋白质中，蛋白质极性(polarnature)会导致htt与其他蛋白质产生不良的相互作用。尤其是蛋白质互相形成氢键且聚集在一起，如此一来这些蛋白质的结构就会产生变异，无法折迭成具有功能的蛋白质，随着时间的推移，积累的蛋白质聚集会损害神经细胞，导致病患神经细胞死亡与神经功能缺损。此蛋白质聚集的破坏作用已经由实验证实，确实会造成人体神经伤害，并且实验数据显示藉由抑制蛋白质聚集形成的化学试剂，可增加细胞存活，改善亨丁顿氏舞蹈症(hd)疾病小鼠的病理变化。[0022]除了使用抑制剂来防止蛋白质聚集之外，减少突变亨丁顿(htt)基因表达也是一种可行的替代方法，用来抑制不溶性蛋白质聚集的发生。根据1999年scherzinger等人的活体外研究已显示polyq蛋白质聚集的程度与蛋白质浓度相关，因此，理论上可藉由降低突变亨丁顿(htt)基因表达，减少polyq扩张蛋白质产出，藉此抑制蛋白质聚集的形成及推迟亨丁顿氏舞蹈症(hd)的发病。[0023]这些结果指出可藉由一种简单而有效的策略来抑制亨丁顿氏舞蹈症(hd)的发病机制，该策略为降低因htt基因表达所产生的不溶性蛋白质聚集，例如，一种可调控polyq突变基因表达或polyq蛋白质聚集的试剂，该试剂有可能解决polyq疾病的根本原因，而非仅治疗其疾病症状，但目前仍缺乏能调控突变polyq基因表达的相关细胞因子与试剂，因此造成此治疗策略的发展限制。[0024]多聚谷氨酰胺(polyq)疾病，是一类由编码蛋白质的基因中cag三核苷酸重复序列的异常延伸所引发的神经退行性疾，此重复序列过度扩张，导致基因产物异常。因此，研发一种能预防或清除突变的基因产物之方法，着实有其必要性。在我们早期的研究中，我们发现藉由转录延伸因子spt4/supt4h的功能缺失可选择性抑制含有较长cag重复序列基因的转录作用并降低polyq蛋白质聚集。然而，在转录延伸过程中，为何通过高度重复的核苷酸序列需要spt4/supt4h协助，目前其分子机制仍不清楚。[0025]r-loops(r环)是由转录作用产生的mrna和转录过后的dna模板相互结合的核酸复合物，是转录延伸作用的副产物，并且已被证明是基因表达的负向调节因子。[0026]细胞中具有多种蛋白质可调节rna/dna杂合体(即r-loops)，研究最为详细的是rnaseh酶，其酵素活性能专一地分解rna/dna杂合体中的rna(cerritelli和crouch，2009)。另外，藉由解旋酶的作用也可以移除r-loops；在真核细胞中，rna/dna杂合体可以经由pif1dna解旋酶(boule和zakian，2007)或sen1/senataxin(kim等，1999)解开。有人提出在酵母细胞中，sen1的主要功能是防止r-loops积累(mischo等，2011)。此外，在防止r-loops形成的过程中，拓扑异构酶i也具有重要的调节角色(drolet，2006)。技术实现要素：[0027]名词解释[0028]在整个揭示内容中，基因名称是以大写字母表示，而只有在酵母菌细胞中，与基因有关的蛋白质会以第一个字母大写表示。例如，关于spt4基因，「spt4」一词表示基因，而「spt4」一词表示由该基因所产生的蛋白质。[0029]如本发明文中所使用的基因spt4是指产生转录延伸蛋白质spt4的基因。该基因是经由(malone等人，1993)作特征鉴定，其整个内容是并入本
发明内容供参考。该蛋白质spt4是经由(malone等人，1993)作特征鉴定，其整个内容是并入本
发明内容供参考。[0030]如本文中所使用，基因spt5是指产生转录延伸蛋白质spt5的基因。该基因经由(swanson等人，1991)作特征鉴定，其整个内容并入本
发明内容供参考。该蛋白质spt5经由(swanson等人，1991)作特征鉴定，其整个内容并入本
发明内容供参考。[0031]如本发明文中所使用基因supt4h是指产生哺乳动物转录延伸因子supt4h的基因。该基因经由(hartzog等人，1996；chiang等人，1996)作特征鉴定，其整个内容并入本
发明内容供参考。该蛋白质supt4h经由(hartzog等人，1996；chiang等人，1996)作特征鉴定，其整个内容并入本
发明内容供参考。[0032]如本发明文中所使用，基因supt5h是指产生哺乳动物转录延伸因子supt5h的基因。该基因经由(stachora等人，1997；chiang等人，1998)作特征鉴定，其整个内容并入本
发明内容供参考。该蛋白质supt5h经由(stachora等人，1997；chiang等人，1998)作特征鉴定，其整个内容并入本
发明内容供参考。[0033]本文所用的名词“r-loops稳定化合物”描述了具有稳定或提升r-loops结构能力的任何化合物，例如：rnaseh、top1、sen1的抑制剂。[0034]本文所用的名词“生物活性”描述了藉由spt4或supt4h以及其结合配体spt5或supt5h协助rna聚合酶ii在dna模板上的转录作用功能。[0035]本文所用的名词“基因产物”描述了藉由该基因产生的rnas以及蛋白质。[0036]rna/dna杂合体(r-loops)在扩张的cag三核苷酸重复序列中可被检测到。[0037]r-loops也存在于各种重复的dna序列中。[0038]spt4缺失不会影响r-loops的形成，但会导致亚优化的rna聚合酶ii对r-loops的转录停滞效应敏感并降低其转录作用。[0039]提高r-loops增加了藉由supt4h失活来抑制突变htt的转录作用，表明共同降低supt4h和rnaseh功能具有治疗亨丁顿舞蹈症(hd)的潜力。[0040]在以酵母菌作为生物模式的实验中，我们发现在含有扩张的cag三核苷酸重复序列和其他重复核苷酸序列的片段附近可检测到r-loops。此外，我们发现核苷酸序列重复次数越多，r-loops形成的机会越大。我们进一步证实r-loops的形成与spt4的存在与否无关，但是，在spt4功能缺失细胞中r-loops会影响及调控cag核苷酸重复序列扩张基因的转录作用。更重要的是，在酵母菌实验中证实的机制也适用于小鼠纹状体神经元细胞中具有突变的htt基因以及亨丁顿氏舞蹈症(hd)的动物模式。[0041]本发明提供一种体外调控细胞中一基因表达的方法，其中所述基因含有核苷酸重复序列扩张，该方法包含:抑制spt4或supt4h的生物活性；及调控r-loops的形成。其中所述抑制步骤能有效减少含有核苷酸重复序列扩张基因的表达及调控步骤能增加抑制步骤的效果；其中所述抑制步骤和该调控步骤是透过增加rnapolymeraseⅱ自dna模版分离达到调控基因表达的目的。[0042]本发明一最佳实施例中该抑制步骤降低spt4或supt4h方法选自由提供一sirna,shrna,anti-senseoligonucleotide或使用crispr/cas9技术的方法所组成的群组，能降低spt4或supt4h表达或能阻止spt4/spt5复合体和supt4h/supt5h复合体的形成。[0043]本发明一最佳实施例中该基因包含一核苷酸重复序列扩张片段，该基因会促使r-loops形成。而该核苷酸重复序列扩张片段为三核苷酸重复序列。[0044]本发明提供一种r-loops调控化合物在用于制备抑制细胞中含有核苷酸重复序列扩张基因转录作用的医药组合物中的用途，其中所述医药组合物包含:一spt4或supt4h抑制剂；及一r-loops调控化合物。[0045]本发明一最佳实施例中该r-loops调控化合物为一种r-loops稳定剂，该r-loops稳定剂可促进r-loops形成或避免已经形成的r-loops解离和一种rnaseh抑制剂，该rnaseh抑制剂可抑制rnaseh酵素活性和避免已经形成的r-loops解离。[0046]本发明一最佳实施例中该spt4或supt4h抑制剂选自由抗体、化合物、胜肽(peptide，多肽或肽)或核苷酸所组成的群组，该抑制剂可降低spt4或supt4h表达或有效抑制spt4/spt5复合体的形成或有效抑制supt4h/supt5h复合体的形成。[0047]本发明一最佳实施例中该r-loops调控化合物选自由抗体、化合物、胜肽或核苷酸试剂所组成的群组。[0048]本发明一最佳实施例中该基因包含一核苷酸重复序列扩张片段，该基因会促使r-loops形成，其中所述核苷酸重复序列扩张片段为三核苷酸重复序列。[0049]本发明提供一种治疗核苷酸重复序列扩张疾病的医药组合物，包含:一r-loops调控化合物和一spt4或supt4h抑制剂。且该r-loops调控化合物系选自由一r-loops稳定剂和一rnaseh抑制剂。[0050]本发明一最佳实施例中该r-loops稳定剂为拓扑异构酶(topoisomerase)抑制剂。[0051]本发明一最佳实施例中该rnaseh抑制剂为tropolone。[0052]本发明一最佳实施例中该spt4或supt4h抑制剂系选自由抗体、化合物、胜肽(peptide，多肽或肽)或核苷酸所组成的群组。[0053]本发明一最佳实施例中该r-loops调控化合物选自由抗体、化合物、胜肽或核苷酸所组成的群组。[0054]本发明提供一种r-loops调控化合物在用中的用途，其中所述医药组合物包含:一r-loops调控化合物；以及一治疗核苷酸重复序列扩张疾病的药物。该核苷酸重复序列扩张疾病药物包含spt4或supt4h抑制剂。[0055]本发明一最佳实施例中该r-loops调控化合物选自由抗体、化合物、胜肽或核苷酸所组成的群组。[0056]本发明一最佳实施例中该核苷酸重复序列扩张疾病包含第一型、第二型、第三型、第七型或第十七型小脑脊髓干运动失调症候群(spinocerebellarataxiatypel、2、3、7或17)、齿状红核苍白球肌萎缩症(dentatorubral-pallidoluysianatrophy，简称drpla)、脊髓延髓肌肉萎缩症(spinalandbulbarmuscularatrophy)、第一型、第二型肌强直性萎缩症(myotonicatrophytype1、2)、c9orf72肌萎缩侧索硬化症(c9orf72amyotrophiclateralsclerosis)、第八型、第十型、第十二型、第三十一型、第三十六型小脑脊髓干运动失调症候群(spinocerebellarataxiatype8、10、12、31、36)或亨丁顿氏舞蹈症(huntington’sdisease)。[0057]在图式和以下描述中阐述了一个或多个实施例的细节，根据说明书、图式以及权利要求，实施例的其他特征、目的和优点将显而易见。附图说明[0058]图1显示基因中含有一段短的或长的核苷酸重复序列其转录延伸过程，。[0059]图2a显示藉由引子组b和引子组amp在(cag)n-ade2质体上的扩增子；图2b显示藉由rna/dna杂交沉淀(dip)法分析转录作用中(cag)n-ade2上的r-loops信号；图2c为检查spt4缺失对r-loops形成的影响；图2d藉由北方点墨法评估在野生型(wt)和spt4δ(δs)细胞中(cag)n-ade2mrna的表达。[0060]图3a显示在野生型(wt)、rnh1δ(δ1)、spt4δ(δs)和rnh1δspt4δ双缺失(δ1δs)细胞中r-loops的信号；图3b显示在wt，δ1，δs和δ1δs细胞中使用北方点墨法(northernblotting)测量(cag)n-ade2mrna表达量；图3c为藉由引子组a和引子组b所形成的扩增子示意图；图3d藉由反转录和实时定量聚合酶连锁反应分析具有cag重复序列下游与上游的转录产物。[0061]图4a显示99cag和97cag/caa之间核苷酸组合差异的示意图；图4b显示在表达(cag)99-ade2和(cag/caa)97-ade2的wt细胞中，使用dip分析重复序列中r-loops信号；图4c显示在野生型(wt)和spt4δ(δs)细胞中，使用北方点墨法(northernblotting)评估(cag)99-ade2和(cag/caa)97-ade2表达量；图4d显示在具有异位(ectopic)表达sen1的spt4δ细胞中，使用北方点墨法测量(cag)n-ade2mrna表达量；图4e显示在具有异位(ectopic)表达top1的spt4δ细胞中，使用北方点墨法测量(cag)n-ade2mrna表达量。[0062]图5a显示以dip分析法侦测，在wt细胞中，ade2报导基因的r-loops信号；图5b显示以北方点墨法分析野生型(wt)和spt4δ细胞中(ca)n-ade2的表达量图5c显示以北方点墨法分析野生型(wt)和spt4δ细胞中(caa)n-ade2的表达量；图5d显示以北方点墨法分析野生型(wt)和spt4δ细胞中(caac)n-ade2的表达量；图5e显示以北方点墨法分析野生型(wt)和spt4δ细胞中(caacca)n-ade2的表达量。[0063]图6a显示gfp和amp引子在(cag)n-gfp质体上的位置示意图；图6b显示在st14a细胞中表达q7-gfp或q81-gfp并且使用dip分析r-loops；图6c显示用supt4hsirna(4hsi)基因抑制结合托酚酮(tro)处理st14a细胞并且分析(cag)n-gfpmrna的表达量；图6d显示使用supt4hsirna(4hsi)基因抑制加托酚酮(tro)处理后，分析st14a细胞中的q81-gfp蛋白质聚集物。[0064]图7a显示在tropolone(tro)处理后，分析hdhq7/7和hdhq111/111细胞中r-loops的变化；图7b显示分别单独或共同使用supt4hsirna(4hsi)和托酚酮(tro)处理hdhq7/7和hdhq111/111细胞，并分析细胞中httmrna的表达；图7c显示用supt4hsirna(4hsi)单独或与托酚酮(tro)一起处理之hdhq7/7和hdhq111/111细胞中htt蛋白质的表达量；图7d显示单独用supt4hsirna(4hsi)或合并托普迪肯topotecan(topo)处理hdhq7/7和hdhq111/111细胞，并分析细胞中htt蛋白质的表达量。[0065]图8a显示hd-果蝇rougheye(粗糙眼)表型的分析结果，rougheye表型是由于表达htt97q突变基因所造成；图8b显示hd-果蝇中mhtt蛋白质表达的状况。具体实施方式[0066]基因中含有一段短的或长的核苷酸重复序列其转录延伸过程示意图(图1)。因转录作用rna/dna杂合体(r-loops)会发生在具有核苷酸重复序列扩张的dna模板上，导致转录作用中rnapolymeraseⅱ(rnapii)的停滞，当酵母菌细胞缺乏spt4或哺乳动物细胞缺乏supt4h时，rnapii的持续延伸作用能力是次优的，并且由于r-loops所衍生的停滞效应，转录作用中的rnapii较易从dna模板上脱离；spt4/supt4h不影响r-loops在具有核苷酸重复序列dna模板上的形成，然而，在supt4h缺失细胞中，转录模板上r-loops的增强可以强化抑制核苷酸重复序列扩张基因的转录延伸作用，蓝色椭圆代表rnapolymeraseii(rnapii)，红色线段代表核苷酸重复序列。[0067]实施例1.实验材料和方法：[0068]a.酵母菌株和质体[0069]藉由基因置换法(one-stepgenereplacementmethod)来产生具有基因缺失的酵母菌株，并用pcr做确认(liu等，2012)，分别藉由kanmx和natmx取代w303-1a细胞中spt4和rnh1的orf来取得spt4δ(spt4基因剃除(geneknock-out，基因敲除))或rnh1δ(rnh1基因剃除)菌株。[0070]藉由(liu等人，2012)揭露的技术方法，制备具有不同长度及核苷酸序列的质体，其包括重复序列ca、caa、cag、caac和caacca。使用酵母菌染色体dna作为模板，藉由pcr扩增全长top1基因编码序列和sen1的n端部分(编码胺基酸残基1至1017)，将top1的扩增产物(藉由smai-top1f和top1-notir引子)和sen1的扩增产物(藉由smai-sen1f和sen1-notir引子)接到基因表达载体prs423-cup1-3ha中以分别产生prs423-cup1-top1和prs423-cup1-sen1。[0071]b.抗体[0072]s9.6是一种能辨识rna/dna杂合结构的单株抗体，由stephenh.leppla博士(美国国家卫生研究院)提供；侦测抗体，微管蛋白质(来源：dm1a，sigma)、ha-抗原表位(来源：3f10，roche)、supt4h(来源：64828，cellsignalingtechnology)、huntingtin(来源：mab2166，chemicon)和tata-结合蛋白质(来源：58c6，sigma)购自厂商。[0073]c.rna/dna免疫沉淀(dip)分析[0074]在含2％半乳糖的培养基中培养12小时后收集酵母细胞，然后在300μl萃取缓冲液(10mmtris-hclph8.0，10mmedta，200mmnacl，1％sds，2％tritonx-100，25unitsrnase抑制剂)中用玻璃珠研磨酵母细胞，将核酸混合物进行音波振动处理(bioruptorucd-200)并用苯酚(ph8.0)萃取，分别使用或不用rnaseh处理90分钟，将染色质dna和rna的混合液与proteing琼脂糖珠结合的单株抗体s9.6进行免疫沉淀。用四种不同的缓冲液洗涤该沉淀物两次(缓冲液1：50mmhepes-kohph7.5，50mmnacl，1mmedta，1％tritonx-100，0.2％sds；缓冲液2：50mmhepes-kohph7.5，500mmnacl，1mmedta，1％tritonx-100，0.1％sodiumdeoxycholate；缓冲液3：10mmtris-hclph8.0，250mmlicl，1mmedta，0.5％np-40，0.5％sodiumdeoxycholate和缓冲液4：tebuffer)，然后再用苯酚萃取。通过qpcr和quantitative-comparativect(△△ct)分析rna/dna杂合体(即r-loops)信号，在酵母菌实验中，使用一对引子(引物：primer-bf和primer-br)来定量cag重复序列附近的r-loops信号，并将引子组amp作为对照组；或者，使用primer-b’f和primer-br检测cag和非cag重复序列的r-loops。在st14a中，引子组st14aegfp用于检测r-loops信号和引子组amp作为对照组；在hdhq7/7和hdhq111/111,，使用小鼠httdip引子组来定量cag重复区的r-loops信号，并且用tuba1adip引子组作为对照组。[0075]d.北方墨点法[0076]使用热酸酚法(hotacidphenolmethod)从酵母细胞中萃取totalrna(总rna)(liu等人，2012)，以等量的rna在含有1％甲醛的mops缓冲液所配置的1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，然后转移到尼龙膜(perkinelmer)上，之后将该尼龙膜与ade2探针杂交以检测不含或含有不同核苷酸重复序列长度的基因转录产物，并使用scr1作为校正组(loadingcontrol)，ade2和scr1探针以ade2-f和ade2-r引子以及scr1-f和scr1-r引子来合成(dignorthernstarterkit，roche)。[0077]e.哺乳动物细胞培养和转染[0078]将st14a、hdhq7/7和hdhq111/111培养在含有15％胎牛血清的dmem(hyclone)，在33℃和5％二氧化碳浓度下进行培养，st14atet是一基因改造细胞株(stableline)，其将ptet-off嵌入到st14a细胞的染色体中，可以在没有四环素存在的情况下诱导ptre2-(cag)n-egfp质体的表达。lipofectamine2000(invitrogen)转染试剂用于将sirna、ptre2-(cag)n-egfp单独或一起递送到细胞中，使用100nmsupt4hsirna(dharmacon公司，on-targetplussmartpool，l-048866-01)和(dharmacon公司，j-086342-10，5’-uggccuacaaaucgagagauu-3’(seqidno:1)and5’-ucucucgauuuguaggccauu-3’(seqidno:2))分别在小鼠和大鼠细胞中减弱supt4h的表达。[0079]f.显微镜[0080]用ptre2-(cag)n-egfp质体和sirna共同转染st14atet细胞，转染后6小时，将生长培养液更换为dmem，进行12小时的细胞培养，细胞培养后，再加入或不加入60μm托酚酮(t89702，sigma)培养细胞12小时，然后使用nikonts100荧光显微镜观察gfp信号，并通过nikond5200照相机拍摄图像。[0081]g.反转录(rt)和定量pcr(qpcr)[0082]按照厂商说明书(invitrogen)以trizol试剂取得哺乳动物细胞totalrna，使用superscriptiii反转录酶(invitrogen)和oligodt、snrnau6rt引子将2μgtotalrna反转录成cdna，藉由steponeplus实时qpcr系统(appliedbiosystems)定量cdna，并使用quantitative-comparativect(△△ct)软件进行分析，使用表3中所示的寡核苷酸引子组测量大鼠supt4h、egfp、小鼠supt4h和小鼠htt，并以snrnau6作为校正组(loadingcontrol)。[0083]表3：本申请中使用的寡核苷酸引子(引物)[0084][0085][0086]对于酵母细胞，利用一组特异性引子将5μgtotalrna转化为cdna，该特异性引子包括5'endcagrt、3'endcagrt和scr1rt引子，藉由引子组(5'cagf和5'cagr)测量含有cag重复序列上游的cdna，而藉由3'cagf和3'cagr引子检测具有cag重复序列下游的cdna，以scr1做为校正组(loadingcontrol)。[0087]h.小鼠纹状体神经细胞株的药物处置[0088]用控制组sirna或专一性的supt4hsirna转染hdhq7/7andhdhq111/111神经细胞株，转染后，将细胞与30μm托酚酮(tropolone)(t89702，sigma)培育12小时或与0.3μm托泊替康(topotecan)(t2705，sigma)培育24小时。托酚酮(tropolone)是一化学药物，可抑制人类rnasesh的酵素活性，其ic50在5.7μm(budihas等，2005)，而托泊替康(topotecan)是一种抑制拓扑异构酶(topoisomerases)的抗癌药物(balietal.2018)。[0089]i.西方墨点法[0090]在ripa缓冲液(50mmtris-hclph7.5，150mmnacl，1％np-40，0.1％sds和1％脱氧胆酸钠)外加1mmna3vo4、1mmdtt、1mmpmsf和蛋白酶抑制剂(sigma)将hdhq7/7andhdhq111/111神经细胞溶解，于高速离心后收集上清液作为蛋白质溶解物。[0091]在样品缓冲液(60mmtris-hclph6.8，25％甘油，4％sds，14.4mmβ-巯基乙醇和0.1％溴酚蓝)中加入等量的蛋白质溶解物并加热处理，以sds-polyacrylamidegel进行电泳分离，然后转移到硝酸纤维素(nc)膜上；使用tris-acetatepolyacrylamidegels(liu等，2012)来分析具有不同polyq长度的htt蛋白质。用含有5％脱脂乳的tbst(1xtbs，0.05％tween20)来前处理膜，然后用抗体作用1小时，以tbst洗涤三次，每次各10分钟，再与二级抗体作用1小时，接着用tbst洗涤三次后，使用westernlighting(perkinelmerlifesciences)来检测信号。[0092]对于果蝇样品，在每次药物处理后收集15只雄性和15只雌性hd果蝇的头，并用1×缓冲液(50mmtris-hclph7.5，150mmnacl，1％np-40，0.1％sodiumdodecylsulfate(sds)，1％sodiumdeoxycholate和bluedye)均质化，再收集蛋白质溶解物。使用12％sds-polyacrylamidegel电泳分离等量的蛋白质溶解物，然后转移至nc膜(gehealthcarelifescience)，接着如上所述进行htt和α-tubulin蛋白质的检测。[0093]j.果蝇品系(flystock)[0094]gmr-gal4-uas-htt97q/cyo品系由师范大学苏铭灿老师提供，该品系能在果蝇复眼中表达htt97q。果蝇在25℃以及使用标准cornmealyeastagar培养。[0095]k.hd果蝇的药物处置[0096]在每个药物实验中，将15个gmr-gal4-uas-htt97q/cyo雄性果蝇与15个gmr-gal4-uas-htt-97q/cyo雌性果蝇培育在含有10ml培养基以及测试药物(最终浓度为10μm6-氯嘌呤核苷(6cr)(sigma)或/和100μm托酚酮(tropolone)(sigma)的小瓶中杂交。6-氯嘌呤核苷(6cr)是藉由阻止supt4h/supt5h复合体的形成来抑制supt4h活性的化学试剂(专利号：us2018/0064744a1)。7天后，移除父母亲果蝇，接着收集带有一个gmr-gal4-uas-htt97q等位基因的4日龄后代并检查眼睛形态特征，使用leicadmr直立显微镜(coolsnap5.0，photometrics)取得复眼图像，以及使用heliconfocus(heliconsoft)增加景深并加强图像效果。每个药物处理组，共分析10只果蝇并与控制组果蝇进行比较，控制组果蝇在含有dmso(sigma)的培养基中培养，每组实验会独立进行三次。[0097]实施例2：转录作用中r-loops的形成受到cag重复序列数量的影响，但不受酵母细胞中spt4的影响。[0098]图2a显示藉由引子组b和引子组amp在(cag)n-ade2质体上的扩增子。(cag)n-ade2包含ade2报导基因与10、25、49或99个cag的重复序列融合。融合基因在gal1启动子(pgal1)控制之下，透过在含有2％半乳糖的培养基中培养细胞，以诱导(cag)n-ade2表达。引子组b将dna最后3个cag重复序列扩增到重复单元200bps的位置上。引子组amp扩增ampr基因作为对照组，引子组amp不产生r-loops。；图2b显示藉由rna/dna杂交沉淀(dip)法分析转录作用中(cag)n-ade2上的r-loops信号。用(cag)10-ade2、(cag)25-ade2或(cag)49-ade2送入野生型(wt)细胞在含有半乳糖的培养基中生长，然后藉由dip分析。以输入dna作为标准化基准，将amp-rnaseh+样品的信号设定为1，误差值表示平均值±标准偏差(n＝3；*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001，student’sttest)。图2c为检查spt4缺失对r-loops形成的影响，用(cag)10-ade2、(cag)25-ade2或(cag)49-ade2送入野生型(wt)和spt4基因剃除(δs)细胞，并如图2b中所述进行分析。图2d藉由北方点墨法评估在野生型(wt)和spt4δ(δs)细胞中(cag)n-ade2mrna的表达，收集如图2c中所描述的细胞并进行分析，藉由ade2探针检测(cag)n-ade2mrna，并且用scr1作为内部的校正组，校正后，将野生型(wt)细胞中(cag)10-ade2mrna的表达量设定为100％。[0099]在这项研究中，藉由rnaseh前处理，移除rna/dna杂交体中的rna部分来减少r-loops信号(cerritelli和crouch，2009)，此结果证实了dip分析对r-loops检测的有效性。实验结果显示在转录作用中，49或99个cag重复序列的模板上可检测到r-loops，但r-loops讯号并不存在10或25个cag重复序列的转录模板上。此外，99个cag重复序列的r-loops信号大于49个cag重复序列的r-loops信号。此实验结果显示r-loops的形成取决于cag重复单元的数量；但是cag重复序列中r-loops的程度不受spt4的影响。spt4缺失细胞中，含有cag重复序列基因转录作用减少仅发生在具有r-loops信号的dna模板中。[0100]实施例3:在spt4缺失细胞中，提升r-loops的形成降低了cag重复序列的转录作用。[0101]图3a显示在野生型(wt)、rnh1δ(δ1)、spt4δ(δs)和rnh1δspt4δ双缺失(δ1δs)细胞中r-loops的信号，将这些细胞送入(cag)99-ade2，在含有半乳糖的培养基中生长，然后藉由dip分析r-loops信号。实验数据进行标准化后与amp-rnaseh+样品作比较，如图2b所述(n＝3；*代表p<0.05；**代表p<0.01，student’sttest)。图3b显示在wt，δ1，δs和δ1δs细胞中使用北方点墨法(northernblotting)测量(cag)n-ade2mrna表达量。将(cag)25-ade2或(cag)99-ade2转染(transformed)至细胞中，然后取得rna进行量化分析。如第2d图所述，校正后，wt细胞中的(cag)99-ade2mrna的表达量设定为100％(n＝3)。图3c为藉由引子组a和引子组b所形成的扩增子示意图，引子组a检测重复序列上游50bp的区域至前三个cag重复单元，引子组b检测cag重复序列下游的dna区段，如图2a所示。图3d藉由反转录和实时定量聚合酶连锁反应分析具有cag重复序列下游与上游的转录产物。从表达(cag)99-ade2的细胞中分离totalrna，并通过反转录(rt)引子转化成cdna，如图3c中所述，用引子组a和引子组b通过实时定量聚合酶连锁反应分析cdna，b/a比值标注在下图中。[0102]评估r-loops对于核苷酸重复序列转录作用的影响，将wt和spt4δ细胞进行rnh1基因剃除，rnh1蛋白质能分解rna/dna杂合体中rna的部分(cerritelli和crouch，2009)。如实验预期，当rnh1基因剃除时，99个cag重复序列的r-loops信号显著增加，并且在wt和spt4δ细胞中r-loops增加的程度相似。实验结果显示，相较于spt4δ细胞，rnh1δspt4δ细胞中(cag)99-ade2mrna的表达量会进一步降低；转录机制实验，结果也显示在spt4缺失细胞中，转录作用通过99cag重复序列的能力会因r-loops的增加而下降。然而，在具有spt4的细胞中，(cag)99-ade2的转录作用仅受r-loops轻微影响。[0103]实施例4：在spt4缺失细胞中，降低r-loops的形成提升了cag重复序列基因的转录产物。[0104]图4a显示99cag和97cag/caa之间核苷酸组合差异的示意图。图4b显示在表达(cag)99-ade2和(cag/caa)97-ade2的wt细胞中，使用dip分析重复序列中r-loops信号，如图2b图所述。图4c显示在野生型(wt)和spt4δ(δs)细胞中，使用北方点墨法(northernblotting)评估(cag)99-ade2和(cag/caa)97-ade2表达量。使用ade2探针检测(cag)99-ade2和(cag/caa)97-ade2mrna，以scr1作为内部校正组。校正后，将wt细胞的转录表达量设定为100％。图4d显示在具有异位(ectopic)表达sen1(d)或top1(e)的spt4δ细胞中，使用北方点墨法测量(cag)n-ade2mrna表达量。sen1/senataxin和top1是r-loops的负调节因子(kim等，1999；drolet等，2006)。将细胞培养在含有cuso4(cu2+)情况下，使用西方点墨法(westernblot)确认ha-taggedsen1和top1的表达(左图)；使用ade2探针检测(cag)n-ade2mrna，并且用scr1作为内部校正组。校正后，不具有cu2+情况下的(cag)25-ade2mrna表达量设定为100％(数值表示为平均值±标准偏差)。[0105]为了进一步评估r-loops对于扩张的核苷酸重复序列在转录作用的影响，在wt和spt4δ细胞中送入低r-loops信号的dna模板，实验结果显示，相较于具有高r-loops信号的dna模板，因spt4缺失所造成的转录作用下降会显著改善。此外，透过r-loops负调节因子的异位表达，也发现在spt4δ细胞中，含有扩张cag重复序列基因的转录作用显著提升。综合图3和图4所示，实验结果揭露了，在spt4缺失的细胞中，r-loops可影响和调控含有扩张的核苷酸重复序列基因的转录作用；但在spt4功能正常的细胞中则不会。[0106]实施例5：r-loops在多种核苷酸重复序列的转录作用中被侦测及其对spt4缺失细胞中基因表达的影响。[0107]图5a显示以dip分析法侦测，在wt细胞中，ade2报导基因的r-loops信号，报导基因包含none、70ca、54caa或41caac重复序列。样品的制备和分析如图2b所述，标准化后，将amp-rnaseh+样品的信号设定为1(n＝3，表示为平均值±标准偏差)。图5b显示以北方点墨法分析野生型(wt)和spt4δ细胞中(ca)n-ade2的表达量。使用ade2探针检测(ca)n-ade2mrna，scr1作为校正组。校正后，个别(ca)n-ade2转录产物在spt4δ与wt细胞中的定量比值，显示在下图中。同样地，分别在(c)，(d)和(e)中分析(caa)n-ade2，(caac)n-ade2和(caacca)n-ade2。[0108]实验结果显示r-loops也存在于其他不同类型的核苷酸重复序列。此外，因spt4缺失所造成的转录作用减少会随着重复核苷酸序列单元数量的增加而逐渐明显。[0109]实施例6：在supt4h基因抑制细胞中，r-loops增加导致具有扩张cag重复序列基因的转录减少。[0110]图6a显示gfp和amp引子在(cag)n-gfp质体上的位置示意图。(cag)n-gfp包含gfp序列与7或81个cag重复序列融合，融合基因在tet-r启动子的控制下。引子组gfp扩增cag重复序列的dna片段，引子组amp扩增ampr基因作为对照组。图6b显示在st14a细胞中表达q7-gfp或q81-gfp并且使用dip分析r-loops。将ptre2-(cag)7-egfp或ptre2-(cag)81-egfp送入st14atet，然后用托酚酮(60μm)处理12小时。托酚酮是一种抑制rnaseh酵素活性的化学试剂(budihas等，2005)。如图2b所述，将amp-rnaseh+样品的信号设定为1(n＝3；ns代表无统计学意义；*代表p<0.05，student’sttest)。虽然在(cag)7-egfp中检测到相对高的r-loops信号，但是托酚酮不会增加该r-loops信号；另一方面，经托酚酮处理后，(cag)81-egfp的r-loops信号显著增加。图6c显示用supt4hsirna(4hsi)基因抑制结合托酚酮(tro)处uas-htt-97q/cyo雌性果蝇培育在培养基含有6-氯嘌呤核苷(6cr)或/和托酚酮(tro)的小瓶中杂交。6-氯嘌呤核苷(6cr)是一个抑制supt4h活性的化合物，可以阻止supt4h/supt5h复合体的形成(专利号：us2018/0064744a1)。在除去亲代果蝇后，收集具有一个gmr-gal4-uas-htt97q等位基因的4日龄后代并分析其眼睛表型形态，每组检查10只果蝇，控制组rougheye的表型设定为100％。控制组在含有dmso的培养基中生长。图8b显示hd-果蝇中mhtt蛋白质表达的状况。收集如上所述的4日龄后代，并使用西方点墨法分析突变htt蛋白质的表达。α-微管蛋白质作为定量校正，校正后，未经药物处理的hd-果蝇中的突变htt表达量设定为100％。[0116]hd-果蝇模式已被广泛认可并且运用在评估化学试剂对hd的治疗效果(marsh等，2003)。在本发明实验中，基因转殖果蝇(drosophilamelanogaster)，gmr-htt97q，表达具有97个cag核苷酸重复序列的人类htt外显子1(exon1)，用以模拟hd疾病中的突变htt。htt97q主要在果蝇复眼的神经元细胞中表达，导致感光神经元细胞的严重退化和rougheye表型特征。由神经元病变所引起的这些表型缺陷类似于hd患者脑中突变htt所引起的神经元损失。实验结果证实supt4h抑制剂6-氯嘌呤核苷(6cr)对rougheye的表型具有治疗效果，并且透过给予托酚酮(tro)的共同处理可以得到进一步地改善；实验结果同时也发现突变htt的表达量会相对地降低。因此，本发明证实要加强抑制动物细胞中突变基因(具有扩张的重复核苷酸序列)的转录作用，可以透过同时抑制supt4h和抑制移除r-loops的化学药物。[0117]其他实施例[0118]本说明书中揭露的所有技术特征可以做任何的组合呈现。本说明书中揭露的每个特征可以均等于具有相同功效的置换技术手段，包含等同或类似目的的取代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的例子。[0119]由上述的描述中，本领域技术人员可以容易地确定所描述的实施例的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对实施例进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也包含在本发明专利权利要求内。当前第1页1 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