一个花椰菜器官发育调控基因编码序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用的基因编码序列，及利用上述基因编码序列培养高生物量转基因植物的方法，它包括如下步骤：（1）花椰菜总RNA提取及第一链cDNA合成；（2）带酶切位点引物设计、合成；（3）过表达转化载体构建；（4）遗传转化；（5）转基因阳性苗筛选；（6）转基因植物生物学性状观察。对纯化后的转基因植株进行生物学性状观察，结果显示转基因植物叶片显著增多，数量显著增多，生物量约是野生型对照的200%。本发明公开的采用基因编码序列培养高生物量转基因植物的方法对于揭示花椰菜器官发育调控的分子基础及采用基因工程手段干预植物器官发育进程，培育符合育种目标的高产作物或经济植物具有重要价值。
【专利说明】—个花椰菜器官发育调控基因编码序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于现代分子生物转基因植物【技术领域】，涉及生物技术中一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用的基因编码序列及其在培育高生物量转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]自然界中不同植物物种间器官大小差异十分显著，而在同一物种内相同基因型的不同植物个体间器官大小差异则非常小，表明植物器官大小发育受到严格的遗传控制。器官大小是植物形态的一个重要特征，也是一个极具价值的农艺性状，如种子大小、果实大小等直接影响农作物或经济作物的产量和品质。因此揭示参与植物器官大小发育的调控因子及其作用机制对采用基因工程等手段提高作物产量和品质具有巨大的应用价值。
[0003]花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，是重要的蔬菜作物，当前我国是世界上花椰菜种植面积最大的国家。其区别于其他十字花科植物的一个最显著特征是在其生殖发育过程中会形成一个由大量增生的花序分生组织构成的特化器官——花球。花椰菜花球所表现出的这种生殖发育，特别是花发育特性使其成为研究十字花科植物器官发育特别是花器官发育的理想材料。
[0004]然而，目前对花椰菜器官发育分子调控机制认识十分有限。借助现代分子生物技术和手段，可以对调控花椰菜器官发育调控的基因进行鉴定、分离。相关基因的获得及功能阐释对于揭示花椰菜器官发育调控的分子基础及采用基因工程手段干预植物器官发育进程，培育符合育种目标的高产作物或经济植物具有重要价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是公开一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用的基因编码序列，并提供一种利用该 基因编码序列，采用基因工程手段获得高生物量转基因植物的方法和应用。为实现此述目的，本发明公开了如下的技术方案:
[0006]一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用的基因编码序列，它由序列5’ATGATTCGTGAAATCTCCGGTCTACAAAACGACATCGTAAACATTCAAGAACGCTCTTCAAGCAGCAACAACAAGATCATGGACATGAGAAGAGATATTCGCCGACCAGCTCAAGCTCCTATGATGAGTAAGCAAGAATATTTTCGGACATTGTCGTCTCAGAACAGTCCGAGGAGGCTAATCTCAGCGAGTCACTTCAGTTTGGAGTCAATGGTTGTTCTTGTTGGTCTCACAGCATCGCTCTTGATCCTTCCCTTGATTCTTCCACCGTTGCCTCCTCCTCCGTTCATGCTGCTTCTCATTCCTATTGGGATAATGGTTCTGCTTATGGTTCTTGCTTTAATGCCTTCTTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTAATGCCTTACATGTAACAAGAACTTATATGTAA3’ 组成(SEQ ID NO:1) ?
[0007]本发明进一步公开了一种利用上述基因编码序列培养高生物量转基因植物的方法，它包括如下步骤:
[0008](I)花椰菜总RNA提取及第一链cDNA合成；
[0009](2)带酶切位点引物设计、合成:利用生物学软件设计带XbaI和SacI酶切位点的引物:ARL-S:5? TCTAGAATGATTCGTGAAATCTCCG3，(下划线表示 XbaI 酶切位点);ARL_A:5’￡AGCTCTTACATATAAGTTCTTGTTACATGT3?(下划线表示SacI酶切位点)。引物序列由上海生物工程公司合成。
[0010](3)过表达转化载体构建:用SDS (十二烷基硫酸钠)碱裂解法分别提取PBI121质粒和含有上述基因编码序列的质粒；将上述基因编码序列的质粒和PBI121载体质粒同时采用XbaI和SacI双酶切，酶切体系如下:质粒1μ g、10XT buffer2y L、0.1 % BSA (牛血清白蛋白)2μ L、XbaI(15U / μ L)0.5 μ L、SacI (10U / μ L)0.5 μ L，无菌水补至 20 μ L。将上述混合液置于0.2mL的离心管中，37度孵育3h ;将带有相同酶切位点目的基因片段及pBI121质粒的回收并进行连接，连接体系如下:pBI121质粒4μ L、目的片段4.5 μ L、IOX ligase buffer (连接缓冲液)I μ L、Ligase (连接酶)0.5 μ L、无菌水补至10 μ L,将上述连接混合物置于0.2mL的离心管中轻轻混匀后，16°C水浴保温16h ;重组质粒的转化:加
5μ L连接产物于50 μ L大肠杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min ;42°C热激30s，立即置于冰上2min ;加500 μ L平衡至室温的LB，180rpm37°C孵育Ih ；4000rpm离心Imin后，弃掉部分上清，剩余150 μ L重悬菌体，涂于LB平板(含IOOmg / L Kan) ;37°C培养过夜。挑取白色克隆于ImL LB培养基(含IOOmg / L Kan) 37°C，180rpm培养8h。取I μ L菌液作为模板进行PCR鉴定，筛选获得阳性重组质粒；重组质粒转化农杆菌LBA4404:取I μ g重组质粒加入100 μ L农杆菌感受态中，轻轻混勻；冰浴30min ;液氮速冻5min ;37°C热击5min ；加入800 μ L YEB液体培养基(不含抗生素)，28°C 180rpm复苏4h ；4000rpm离心Imin后，弃掉部分上清，剩余150 μ L重悬菌体，涂于YEB平板(含50mg / L Rif、IOOmg / L Str和IOOmg / L Kan) ;28°C倒置培养2_3d。挑取白色克隆于ImL YEB培养基(含50mg / L Rif、IOOmg / L Str 和 IOOmg / L Kan) ,28°C, 220rpm 培养 I -2d。取 I μ L 菌液作为模板进行PCR鉴定；同时提取农杆菌阳性质粒进行双酶切鉴定；取经鉴定的阳性菌株菌液500 μ L加入500 μ L40%甘油YEB培养基，正当混匀后于_20°C保存备用；
[0011](4)遗传转化: 将-20°C保存的含有目的基因重组质粒的农杆菌菌液接种于IOmLYEB 液体培养基(含 5Omg / L RifUOOmg / L Str 和 IOOmg / L Kan)中，28°C，22Orpm 活化I-2d ;按I:100比例取2.5mL菌液接种于250mL YEB液体培养基(含50mg / L Rif、IOOmg / L Str 和 IOOmg / L Kan)中，28°C 220rpm过夜培养至 OD6tltl 为 1.2 -1.6 ;5，OOOrpm离心IOmin收集菌体，将菌体重悬于500mL5%蔗糖溶液中，加入100 μ L silwet L_77(终浓度为0.05% )，混匀后转入转化杯中作为转化液待用；待转化的拟南芥前一天浇透水，去掉已结荚，将拟南芥倒置于转化杯中，轻轻摇动转化液，浸染15s后将植株移出，抖去多余转化液，用保鲜膜包好，侧置于托盘中，避光ld，然后直立培养，5d后按照同样方式进行第二次转化；
[0012](5)转基因阳性苗筛选:将种子均匀播种于MS固体培养基(含50mg / L Kan)中，吸去多余水分；4°C黑暗条件下春化3-4d后置于22°C光照培养箱(16h光照，8h黑暗)培养；7-14d后转基因阳性苗子叶浓绿并且根系发达，非转基因苗则只有两片子叶，最后逐渐白化死亡。待阳性苗长至4叶期后转至营养土中，，一盆一苗，人工培养室培养，覆膜2d后揭膜继续培养；
[0013](6)转基因植物生物学性状观察,对纯化后的转基因植株进行生物学性状观察,实验的结果发现:
[0014](I)转基因植物植株叶片显著增大、叶片数量显著增多；[0015](2)转基因植物植株根系，特别是侧根更加发达；
[0016](3)转基因植物植株在营养生长阶段的生物量约是对照的200%。
[0017]本发明重点解决了在作物或能源植物新品种育种中对获得高生物量作物或能源植物新品种的需求。
[0018]本发明所述的YEB培养基指的是含50mg / L Rif (利福平)、IOOmg / L Str (链霉素)和IOOmg / L Kan (卡那霉素)的培养基。
[0019]本发明同时也公开了基因编码序列(SEQ ID NO:1)在干预花椰菜及其他植物器官发育中的应用。
[0020]本发明公开的利用该基因编码序列，采用基因工程手段获得高生物量转基因植物的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
[0021](I)操作过程更加简单，对操作环境的要求更低，即使在一般的只具备简单分子生物学设备、仪器的实验室也能开展；
[0022](2)费用低廉，广谱性高，可在绝大多数双子叶植物中开展；
[0023](3)转化效率高，可以实现短时间内获得大量具有高生物量的转基因植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为显示本案花椰菜器官发育调控基因编码序列转基因拟南芥植株抗性筛选(a、b)及分子鉴定(c、d、e)；
[0025]图2为显示本案 花椰菜器官发育调控基因转化拟南芥后转基因拟南芥及野生型各个发育期的比较(左边显示野生型拟南芥生长发育状况，右边显示转基因拟南芥生长发育状况)。
【具体实施方式】
[0026]下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件。本发明所有生化试剂、酶、载体、菌株均可在各种生化试剂公司中购买，引物序列由上海生物工程公司合成。
[0027]本发明所需生化试剂及酶等来源见下表:
【权利要求】
1.
2.一种利用权利要求1所述基因编码序列培养高生物量转基因植物的方法，其特征在于它按如下的步骤进行: (1)花椰菜总RNA提取及第一链cDNA合成； (2)带酶切位点引物设计、合成:利用生物学软件设计带油al和fec1酶切位点的引物:ARL-S: 5 ’ TCTAGAATGATTCGTGAAATCTCCG3 ’ (下划线表示 Xba 1 酶切位点);ARL-A: 5 ’ GAGCT酶切位点)，引物序列由上海生物工程公司合成； (3)过表达转化载体构建:用SDS碱裂解法分别提取PB1121质粒和含有上述基因编码序列的质粒；将上述基因编码序列的质粒和PB1121载体质粒同时采用油a/和Se1c1双酶切，酶切体系如下:质粒1 μ g、10XT buffer 2μ L,0.1%BSA 2μ LU5U/y L的油al0.5μ LUOU/μ L的Saci 0.5 μ L，无菌水补至20 μ L，将上述混合液置于0.2mL的离心管中，37度孵育3h ;将带有相同酶切位点目的基因片段及PB1121质粒的回收并进行连接，连接体系如下:pB1121 质粒 4μ L、目的片段 4.5μ L、10Xl1gase buffer 1 μ L、L1gase0.5 μ L、无菌水补至10 μ L，将上述连接混合物置于0.2mL的离心管中轻轻混匀后，16°C水浴保温16 h ;重组质粒的转化:加5 μ L连接产物于50 μ L大肠杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 m1n;42°C热激30 S，立即置于冰上2 m1n ;加500 μ L平衡至室温的LB培养基，180rpm 37°C孵育1h ;4000rpm离心1m1n后，弃掉部分上清，剩余150 μ L重悬菌体，涂于含100 mg/L Kan LB固体培养基平板；37°C培养过夜；挑取白色克隆于1mL含100 mg/L Kan LB培养基中，370C，180rpm培养8 h，取1 μ L菌液作为模板进行PCR鉴定，筛选获得阳性重组质粒；重组质粒转化农杆菌LBA4404:取1 μ g重组质粒加入100 μ L农杆菌感受态中，轻轻混匀；冰浴30 m1n ;液氮速冻5 m1n ;37°C热击5 m1n ;加入800 μ L不含抗生素的YEB液体培养基，28°C 180 rpm复苏4 h ；4000 rpm离心1m1n后,弃掉部分上清,剩余150 yL重悬菌体，涂于YEB培养基平板；28°C倒置培养2-3 d ;挑取白色克隆于1 mL含50mg/L R1f、100mg/L Str 和 100 mg/L Kan 的 YEB 培养基，28°C，220 rpm 培养 1~2d，取 1 μ L 菌液作为模板进行PCR鉴定；同时提取农杆菌阳性质粒进行双酶切鉴定，取经鉴定的阳性菌株菌液500 μ L加入500 μ L 40%甘油YEB培养基，正当混匀后于-20°C保存备用； (4)遗传转化:将-20°C保存的含有目的基因重组质粒的农杆菌菌液接种于10mL YEB液体培养基中，28°C，220 rpm活化1~2 d ;按1:100比例取2.5 mL菌液接种于250mL YEB液体培养基中，28°C 220 rpm过夜培养至0D_为1.2~1.6 ;5，000 rpm离心10 m1n收集菌体，将菌体重悬于500 mL 5%蔗糖溶液中，加入100 μ L终浓度为0.05%的s1lwet L-77，混匀后转入转化杯中作为转化液待用；待转化的拟南芥前一天浇透水，去掉已结荚，将拟南芥倒置于转化杯中，轻轻摇动转化液，浸染15s后将植株移出，抖去多余转化液，用保鲜膜包好，侧置于托盘中，避光Id,然后直立培养，5d后按照同样方式进行第二次转化； (5)转基因阳性苗筛选:将种子均匀播种于含50mg/L Kan的MS固体培养基中，吸去多余水分；4°C黑暗条件下春化3-4d后置于22°C，16h光照，8h黑暗光照培养箱中培养；7-14 d后转基因阳性苗子叶浓绿并且根系发达，非转基因苗则只有两片子叶，最后逐渐白化死亡；待阳性苗长至4叶期后转至营养土中，一盆一苗，人工培养室培养，覆膜2d后揭膜继续培养； (6)转基因植物生物学性状观察,对纯化后的转基因植株进行生物学性状观察。
3.权利要求2所述的培养高生物量转基因植物的方法，其中所述的YEB培养基指的是含 50mg/L RifU00mg/L Str 和 100 mg/L Kan 的培养基。
4.权利要求1所 述基因编码序列在干预花椰菜及其他植物器官发育中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK103451190SQ201310397370
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】王春国, 李慧, 陈成彬, 宋文芹 申请人:南开大学