氨基杆菌h1及在氧化锰离子中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株氨基杆菌H1（Aminobacter?sp.H1）及在氧化锰离子中的应用，所述应用为：将氨基杆菌H1经种子培养后的菌悬液以体积比1%的接种量接种至含铁PYCM培养液中，并向所述含铁PYCM培养液中加入MnCl2，所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计0.25～50mmol/L，于25～35℃、160r/min振荡箱中培养5～7d，从而将锰离子氧化为氧化锰；本发明Aminobacter?sp.H1取自成熟锰砂，是除锰滤池中常见的优势菌种，能适应复杂的环境条件，因而该菌株在水体和固体基质中氧化除Mn2+的应用前景广阔。
【专利说明】氨基杆菌H1及在氧化锰离子中的应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一株具有猛氧化能力的新菌株-氨基杆菌(Aminobacter sp.)H1及其应用。
(二)【背景技术】
[0002]随着我国近些年经济的飞速发展，工业用水量快速增加，使得目前国内各大地表水系和地下水均遭到不同程度污染，其中锰便是主要污染元素之一。不仅是我国，在世界其他国家，地下水中铁、锰含量超标现象也很普遍，如美国、法国、意大利、瑞典、同本、德国、芬兰等许多国家和地区。锰(Mn)是地壳中仅次于铁(Fe)的第二大过渡金属，广泛存在于淡水、海水、沉积物和各种矿物中，是所有生物体必需的微量元素，是某些金属酶如过氧化物岐化酶、精氨酸酶和磷酸盐转移酶的成分。但锰摄入过量则可造成中毒，引起多种神经功能紊乱等症状，如嗜睡、头痛、乏力、记忆力减退，甚至出现末梢神经损害，四肢僵直等症状。此外，在人类生产生活中过量的锰也可导致一系列不利影响，如增加水的浊度和色度、使工业品着色等，不仅严重影响水的使用价值，而且还降低了某些工业产品的质量。因此研究水体中锰的净化技术便显得十分迫切和重要。
[0003]生物净化技术具有去除效率高、处理费用低、二次污染小等特点，逐渐被广泛应用于有毒污染物的降解和净化。采用生物技术氧化去除锰的关键之一便是获得具有高效氧化降解Mn2+能力的菌株。目前，国内外学者已对锰的生物去除进行了大量研究，迄今分离获得的猛细菌主要包括生盘纤发菌(Leptothrix discophora)、芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)等。大量研究表明，从环境中分离筛选的高效锰氧化菌，仍然是消除环境中锰污染的重要方法之一。
[0004]本发明中的氨基杆菌(Amino`bacter sp.)是一种常见的短杆菌,经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用该菌种氧化去除水体中Mn2+的报道。该菌株的发现对于工业废水中锰等重金属的高效净化具有重要意义，同时也丰富了微生物锰氧化的理论研究。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一株高效、耐受能力强的具有Mn2+氧化能力的氨基杆菌及其应用。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]本发明涉及一株氨基杆菌Hl (Aminobacter sp.Hl),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M2012296，保藏日期2012年7月19日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编:430072。
[0008]所述氨基杆菌(Aminobacter sp.)H1来源于沈阳某开发区水厂运行稳定的生物除锰滤池中成熟锰砂，经驯化、分离、纯化得到。菌株为革兰氏染色阴性菌，好氧，氧化酶阳性，生长在含铁PYCM固体培养基呈白色、边缘整齐、表面光滑的圆形菌落。透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，有鞭毛。Aminobacter sp.Hl的GenBank登录号为JX457318,其16SrDNA序列为SEQ.1D.NOl所示。
[0009]本发明还涉及一种所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，所述应用为:将氨基杆菌Hl经种子培养后的菌悬液以体积比1%的接种量接种至含铁PYCM培养液中，并向所述含铁PYCM培养液中加入MnCl2,所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计0.25~50mmol/L (不高于50mmol/L均可，MnCl2加入量的计量中不包括菌悬液的体积，防止MnCl2在高温灭菌时被氧化，待已灭菌的培养基冷却至室温后通过0.22 μ m微孔膜过滤除菌后加入培养基中)，于25~35°C、160r/min振荡箱中培养5~7d,从而将猛离子氧化为氧化锰；所述含铁PYCM培养液的终浓度组成为:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L，K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.1g/L，(NH4)2CO30.05~0.15g/L和柠檬酸铁铵0.5~2g/L，溶剂为去离子水，ρΗ6.8~7.2。
[0010]进一步，本发明所述的应用，优选所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计
0.25 ~30mmol/L。
[0011]进一步，所述含铁PYCM培养液中柠檬酸铁铵的终浓度优选为I~2g/L。
[0012]进一步，所述菌悬液中细胞光密度(OD6J为1.0。
[0013]进一步，优选所述培养温度为35°C，培养时间为5天，所述含铁PYCM培养液中柠檬酸铁铵终浓度为lg/L，所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计为lmmol/L，培养液pH值为7。
[0014]进一步，所述菌悬液按如下方法制备:
[0015](I)斜面培养:将氨基杆菌Hl接种至斜面培养基，并向斜面培养基内加入以斜面培养基体积计0.25~10mmol/L的MnCl2,在25~35°C下培养48~72h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L，K2HPO40.05~
0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.lg/L 和(NH4)2CO30.05~0.15g/L，琼脂质量终浓度1.5~2.0%、溶剂为去离子水，pH6.8~7.2 ;
[0016](2)种子培养:从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C下培养60~72h，获得种子液，即菌悬液；所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉 0.1 ~0.2g/L, K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L，CaCl20.05 ~0.lg/L, (NH4)2CO30.05 ~0.15g/L 和柠檬酸铁铵 0.5 ~2g/L，溶剂为去离子水，pH6.8 ~7.2。
[0017]本发明的有益技术效果主要体现在:
[0018]本发明提供一株新菌株一氨基杆菌(Aminobacter sp.)H1,以体积比1%的接种量将氨基杆菌Hl菌悬液接种至含铁PYCM培养基中，并在培养基中加入Mn2+，当培养基中存在lg/L柠檬酸铁铵时，在30°C，160r/min，pH值为7.0的条件下，培养3d内可以将IOmmol/L的Mn2+完全去除，5d内可将60%左右的lmmol/L Mn2+氧化生成高价态不溶性的生物氧化锰；在Mn2+初始浓度高达50mmol/L的含铁PYCM培养基中，菌株能保持生长活性，并在Mn2+初始浓度高达40mmol/L含铁PYCM培养基中有Mn2+氧化活性，最佳温度为35°C，最佳pH值为7.0 ;本发明Aminobacter sp.Hl取自成熟猛砂,是除猛滤池中常见的优势菌种，能适应复杂的环境条件，因而该菌株在水体和固体基质中氧化除Mn2+的应用前景广阔。
(四)【专利附图】
【附图说明】[0019]图1为Aminobacter sp.Hl的革兰氏染色照片；
[0020]图2为Aminobacter sp.Hl的透射电镜照片；
[0021]图3为Aminobacter sp.Hl的系统发育树图；
[0022]图 4 为 Aminobacter sp.Hl 的 Biolog 鉴定图；
[0023]图5为Aminobacter sp.Hl的不同生长阶段对Mn2+的氧化去除曲线；
[0024]图6 为 Aminobacter sp.Hl 对猛抗性；
[0025]图7为Aminobacter sp.Hl对高浓度Mn2+的去除率；
[0026]图8为Aminobacter sp.Hl对低浓度Mn2+的氧化率。
(五)【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0028]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，其中所用的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
[0029]实施例1.氨基杆菌(Aminobacter sp.) Hl的分离、纯化及其鉴定
[0030]I > Aminobacter sp.Hl 的分离及纯化
[0031]Aminobacter s`p.Hl是从沈阳经济开发区某水厂运行稳定的成熟活性锰砂中驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌，具体步骤如下:
[0032]取水厂运行稳定的成熟活性锰砂，自来水淘洗3~5次后，空曝48h，尽量去除残留的有机物。配制含铁PYCM培养液(pH=7)，向含铁PYCM培养液中加入添加MnCl2对活性污泥(即空曝48h后的锰砂)进行定向驯化，所述MnCl2的加入量以培养液体积计lOmmol/L，每3d更换新鲜培养液一次，每天测定培养液的pH。
[0033]配制MnCl2初始浓度为10mmol/L (即MnCl2的加入量以含铁PYCM培养基体积计为10mmol/L)的含铁PYCM培养基方法如下:蛋白胨0.Sg，酵母粉0.2g，MnCl2.4H202g，K2HPO40.lg，MgSO4.7H200.2g，NaNO30.2g，CaCl20.lg，(NH4)2CO30.lg，柠檬酸铁铵 2.0g，去离子水1L，pH7.0，分装于250mL的锥型瓶(IOOmL/个)中，121°C湿热灭菌20min后使用。防止MnCl2在高温灭菌时被氧化，待已灭菌的培养基冷却至室温后通过0.22 μ m微孔膜过滤除囷后加入培养基中。
[0034]将驯化的污泥按体积分数为5%的量加入到上述含铁PYCM培养基(MnCl2初始浓度为lmmol/L,柠檬酸铁浓度为1.0g/L)中，于30°C, 160rpm的摇床振荡培养3d左右至对数生长期，随后以体积浓度10%的量转接到新鲜灭菌后的含铁PYCM培养基(MnCl2初始浓度为lmmol/L,柠檬酸铁浓度为1.0g/L)中，30°C, 160rpm摇床振荡培养。取少量培养液于含铁PYCM琼脂培养基平板上进行稀释涂布及划线分离，挑取单菌落接入含铁PYCM培养基(MnCl2初始浓度为lmmol/L，柠檬酸铁浓度为1.0g/L)中，30°C、160rpm摇床继续振荡培养，直到获得在上述培养基中生长快、菌落规则和性状稳定的可氧化Mn2+的单菌株，记为菌株Hl0
[0035]菌株Hl生长稳定期的革兰氏染色如图1所示，透射电镜如图2所示。结果表明，该菌株Hl是革兰氏阴性菌，好氧，30°C下在含铁PYCM琼脂固体培养基生长5天后呈白色、边缘整齐、表面光滑的圆形菌落；透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，有鞭毛。[0036]2、菌株Hl的鉴定
[0037]通过16S rDNA序列分析、生理生化实验及Biolog等方法鉴定,确定菌株Hl为氨基杆菌Hl (Aminobacter sp.)。具体步骤如下:
[0038]采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和纯化菌株Hl的DNA，4°C保存。选用细菌的通用引物BSF27/20和BSR1492/20对纯化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为:
[0039]BSF27/20:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
[0040]BSR1492/20:5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
[0041]PCR反应程序设定为:94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，循环30个周期；然后72°C延伸5min ;最后4°C保持lOmin。将PCR产物进行测序(上海英潍捷基)，菌株Hl的16S rDNA序列为SEQ.1D.NOl所示。
[0042]将菌株Hl的16S rDNA序列上传到Genbank,获得Genbank的登录号JX457318,同时与Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其从属于Aminobacter属，与Aminobacter sp.CL-9.08 (HQ113207)同源性最高，达到99%。图3为该菌株的系统发育树。
[0043]菌株Hl生理生化鉴定参照《微生物学实验》(沈萍等，2007)方法进行，结果如表1所示。
[0044]菌株Hl的Biolog鉴定具体步骤:将待测菌接种至含铁PYCM琼脂(MnCl2终浓度lmmol/L，柠檬酸铁铵终浓度lg/L)平板培养基上活化，随后挑取单菌落接入新鲜的BUG+B培养基，30°C培养过夜。用无菌棉签挑取已经培养好的菌落，在无菌超净台中缓慢接种到浊度管(选用IF-A接种液)中 ，调整浊度至98%，用排枪小心地接种到Biolog碳源板(选用GN-1II)上，置于30°C恒温培养箱中培养。分别在培养4~6h、16~24h后用Biolog鉴定仪通过计算机读取相应的数据，得到菌株鉴定的结果，如图4所示。结果表明，菌株Hl为氨基杆菌(Aminobacter aminovorans),与16S rDNA及生理生化结果一致，因此将菌株Hl命名为氛基杆菌(Aminobacter sp.)Hl。
[0045]BUG+B培养基配置如下:取250mL锥形瓶一个，加入95mL超纯水，5.7g BUG琼脂培养基(Cabot Blvd, Hayward, CA984545, USA)，煮沸溶解(冷却后 pH—般为 7.3±0.1)，包好，121°C灭菌15min，冷却至45~50°C后，加5mL新鲜的脱纤羊血，倒平板。
[0046]菌株Aminobacter sp.Hl已于2012年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2012296，保藏地址中国武汉武汉大学，邮编:430072。
[0047]表1菌株Hl生理生化结果
[0048]
--项目
|?.—
爱粉水解试验
吲哚试验-_
甲基红试验-_
V-P试验_-_
氧化酶试验
明胶液化试验-_
过氧化氢酶试验I+
【权利要求】
1.一株氨基杆菌Hl (Aminobacter sp.HI),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M2012296，保藏日期2012年7月19日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编:430072。
2.—种权利要求1所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，其特征在于所述应用为:将氨基杆菌Hl经种子培养后的菌悬液以体积比1%的接种量接种至含铁PYCM培养液中，并向所述含铁PYCM培养液中加入MnCl2,所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计0.25~50mmol/L,于25~35°C、160r/min振荡箱中培养5~7d,从而将猛离子氧化为氧化锰；所述含铁PYCM培养液的终浓度组成为:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L，K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.1g/L，(NH4)2CO30.05~0.15g/L和柠檬酸铁铵0.5~2g/L，溶剂为去离子水，ρΗ6.8~7.2。
3.如权利要求2所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，其特征在于所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计0.25~30mmol/L。
4.如权利要求2所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，其特征在于所述含铁PYCM培养液中柠檬酸铁铵的终浓度为I~2g/L。
5.如权利要求2所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，其特征在于所述菌悬液中细胞 OD6tltl 为 1.0。
6.如权利要求2所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，其特征在于所述培养温度为350C，培养时间为5天，所述含铁PYCM培养液中柠檬酸铁铵终浓度为lg/L，所述MnCl2的加入量以含铁PYCM培养液体积计lmmol/L，培养液pH值为7。
7.如权利要求 2所述氨基杆菌Hl在氧化锰离子中的应用，其特征在于所述菌悬液按如下方法制备:
(1)斜面培养:将氨基杆菌Hl接种至斜面培养基，并向斜面培养基内加入以斜面培养基体积计0.25~10mmol/L的MnCl2,在25~35°C下培养48~72h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L, K2HPO40.05~0.15g/LjMgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.lg/L 和(NH4)2CO30.05 ~，0.15g/L，琼脂质量终浓度1.5~2.0%，溶剂为去离子水，pH6.8~7.2 ; (2)种子培养:从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C下培养60~，72h，获得种子液，即菌悬液；所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉，0.1 ~0.2g/L, K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L,CaCl20.05~0.lg/L, (NH4)2CO30.05~0.15g/L和柠檬酸铁铵0.5~2g/L，溶剂为去离子水，pH6.8 ~7.2。
【文档编号】C12R1/01GK103484401SQ201310397231
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】姜理英, 陈建孟, 何智敏, 晏平 申请人:浙江工业大学