本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及检测mrna分子标志。更具体地，本发明涉及用于诊断肾脏同种异体移植物接受者发生急性排斥反应和同种异体移植物丧失风险的方法。所述方法包括通过确定包含23种预选的mrna的mrna标志集的表达水平来分析肾脏同种异体移植物接受者的血液，以便在移植前和移植后鉴定和治疗此类患者。差异表达分析可以应用于所选基因的标准化表达读段计数(例如，来自下一代测序技术的基因的读段计数)值，以得出可以获得每一位患者的针对急性排斥反应和同种异体移植物丧失风险的加权累积风险评分。
背景技术：
肾脏移植是患有终末期肾病(esrd)的受试者的治疗选择。然而，尽管在过去十年中，1年移植物丧失显著改善，但在移植后的每一年中，约3％的肾脏同种异体移植物接受者恢复透析或需要重新移植。尽管最近的数据可表明自2006年以来中期移植物丧失的增加与更好的肾功能有关，但自1990年代以来晚期移植物失败的比率相对没有变化。
慢性同种异体移植物损伤或间质性纤维化和未知原因的肾小管萎缩占移植物丧失的大多数情况。这促进了旨在理解和对比造成这些晚期事件的机制的研究，这些机制包括同种抗体的形成和原发性疾病的复发。确实，尽管急性排斥反应明显减少，但仍缺乏长期改善，这挑战了急性排斥反应是长期移植物预后的主要决定因素的假设。然而，该假设与以下证据相吻合，即基于临床表现和亚临床表现的早期急性排斥反应(ear)，根据在移植后6个月之前获得的肾脏活检，炎症/肾小管炎评分为1以上，会对接受当前免疫抑制方案的患者中的长期移植物丧失造成负面影响。因此，ear仍代表移植后免疫抑制治疗的主要目标之一。
当前的免疫抑制方案的主要问题之一是它们不适合单个患者需求的事实。当前的临床实践取决于广泛的临床标准，包括抗hla抗体、种族、移植前和接受者年龄，以预测移植后的个体免疫学风险。这些指标表现不佳。结果，大多数患者接受了标准化的免疫抑制方案，导致一些个体受到过多或过少的免疫抑制，从而导致并发症。处于最高急性排斥反应风险的个体的早期鉴定可以允许旨在改善长期预后的靶向疗法。
有证据表明，肾脏移植之前患者的免疫系统的组成和功能影响移植后随后发生的急性排斥反应(ar)风险，但尚未鉴定出量化这种风险的生物标志物。需要的是可用于肾脏移植之前患者血液的转录本分析的基因标志集，以预测急性排斥反应发作。
技术实现要素：
本发明人已经在移植之前在同种异体移植接受者中鉴定并验证了基于血液的23种基因集，其预测ear的风险，并且与晚期ar和同种异体移植物丧失相关。该基因集的应用允许移植患者在移植前进行免疫分层(immunestratification)，从而实现免疫抑制疗法的个性化方法。
本文公开了由肾脏同种异体移植物接受者在移植前表达的基因谱，其确定移植后急性排斥反应(ar)风险。
在一方面，本发明提供一种用于鉴定处于发生急性排斥反应风险的肾脏同种异体移植物接受者的方法，所述方法包括以下步骤：(a)确定在从接受者中获得的血液样本中基因标志集中的基因的表达水平；(b)将基因标志集中的基因的表达水平与对照基因集中的基因标志集中的相同基因的表达水平进行比较，和(c)如果样本中的基因标志集中的一种以上的基因的表达水平与对照中的基因标志集中的相同的一种以上的基因的表达水平相比发生改变，则确定接受者将处于急性排斥反应和同种异体移植物丧失风险。
在另一方面，应用该测定的基因表达水平结果，概括为ear风险的加权累积评分(r)。用于风险评估的公式为r＝-(log10(p1)*g1+log10(p2)*g2+…+log10(pi)*gi+...+log10(p23)*g23)，其中pi是训练集中ear组与非ear组之间对于基因i(i＝1…23)的表达值的t检验的显著性p值，gi是基因i(i＝1...23)的逻辑数：1(如果基因i的表达值大于针对上调基因的训练集的ear组的中值表达值，或者如果基因i的表达值小于针对下调基因的训练集的非ear组的中值表达值)、或-1(如果基因i的表达值小于针对上调基因的训练集的非ear组的中值，或者如果基因i的表达值大于针对下调基因的训练集的非ear组的中值)、或0(如果基因i的表达值介于训练集的ear组的中值和非ear组的中值之间)。加权累积评分(r)可用作每个患者的急性排斥反应的风险评分。如果患者的风险评分高于训练数据集定义的三分位表达值截止值，则患者处于急性排斥反应风险。
在另一方面，本发明提供一种用于鉴定处于急性排斥反应风险的肾脏同种异体移植物接受者的试剂盒，该试剂盒在一个以上的单独的容器中包括用于基因标志集的引物对：gzmh、adgrg1、s1pr5、fgfbp2、nkg7、prf1、kiaa1671、lag3、tarp、fcrl6、faslg、tbx21、tox、znf831、cd8a、c1orf21、ccr5、ldoc1l、ccdc102a、hopx、prkch、slc25a34、f12、缓冲液、管家基因套组(housekeepinggenepanel)、管家基因套组引物、阴性对照和使用说明。
在另一方面，本发明提供一种在移植前鉴定处于异体移植物急性排斥反应风险的肾脏同种异体移植物接受者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从肾脏同种异体移植物接受者的血液样本中分离mrna；(b)从mrna合成cdna；(c)确定所述接受者血液中23个成员基因标志集的表达水平；(d)如果从23个成员基因集的表达水平中计算得出的加权累积风险评分(r)高于三分位截止值，则将同种异体移植物接受者诊断为处于急性排斥反应和同种异体移植物丧失风险；(e)采用诱导疗法或施用例如更高的钙调神经磷酸酶抑制剂的靶标剂量等更高的维持免疫抑制来治疗鉴定为处于急性排斥反应或同种异体移植物丧失风险的接受者。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗处于急性排斥反应和/或移植物丧失的低风险的患者的方法，该方法包括施用较低风险的维持免疫抑制如雷帕霉素或贝拉西普，从而降低感染和恶性肿瘤的风险。
在又一个方面，本发明提供一种在移植前选择肾脏同种异体移植物患者用于诱导疗法以降低肾脏急性排斥反应或同种异体移植物丧失风险的方法，该方法包括比较从患者中获得的23个成员基因标志集的表达水平与从未遭受急性排斥反应的同种异体移植物接受者中获得的对照样品中的基因标志集的表达水平，如果来自患者的基因标志集中的一种以上的基因的表达水平与对照中的基因标志集中的相同的一种以上的基因的表达水平相比发生改变，则采用诱导疗法治疗患者。
根据本说明书和所附权利要求书，本发明的这些和其他方面对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
具体实施方式
定义：
如本文所用，与处于“低风险”的受试者相比，处于同种异体移植物的急性排斥反应和同种异体移植物丧失的“高风险”的同种异体移植物接受者在没有干预的情况下显著更有可能排斥同种异体移植物。
根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、重组dna、免疫学、细胞生物学和其他相关技术。参见，例如，sambrook等人,(2001)molecularcloning:alaboratorymanual.第3版.coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,n.y.；sambrook等人,(1989)molecularcloning:alaboratorymanual.第2版.coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,n.y.；ausubel等人,编辑.(2005)currentprotocolsinmolecularbiology.johnwiley和sons,inc.:hoboken,n.j.；bonifacino等人,编辑.(2005)currentprotocolsincellbiology.johnwiley和sons,inc.:hoboken,n.j.；coligan等人,编辑.(2005)currentprotocolsinimmunology,johnwiley和sons,inc.:hoboken,n.j.；coico等人,编辑.(2005)currentprotocols于microbiology,johnwiley和sons,inc.:hoboken,n.j.；coligan等人,编辑.(2005)currentprotocolsinproteinscience,johnwiley和sons,inc.:hoboken,n.j.；enna等人,编辑.(2005)currentprotocolsinpharmacologyjohnwiley和sons,inc.:hoboken,n.j.；hames等人,编辑.(1999)proteinexpression:apracticalapproach.oxforduniversitypress:oxford；freshney(2000)cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique.第4版.wiley-liss；等。上面列出的当前方案每年更新几次。
如本文所用，本文公开的mrna的“表达水平”是指样品中标志物的mrna表达水平或标志物的可测定水平，其可以通过本领域已知的任何合适方法来确定，例如，但不限于northern印迹，聚合酶链反应(pcr)例如定量实时pcr“qrt-pcr”，rna-seq，treex(miseq)，nanostring分析等。如本文所用，术语“约”或“大约”通常是指对于值的类型和测定方法而言在可接受的误差范围内。例如，它可以指在给定值或范围的20％之内、更优选在10％之内、仍最优选在5％之内。可选地，特别是在生物系统中，术语“约”是指在约对数(即，一个数量级)内，优选在给定值的二分之一以内。
术语“减少”、“减少的”、“降低的”、“降低”或“下调”在本文中通常全部用来指减少统计学上显著的量。但是，为避免疑问，“降低的”、“降低”、“下调”、“减少的”或“减少”是指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的减少(即与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何减少，或至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍减少，或与参考水平相比在1.0倍至10倍或更高之间的任何减少。
术语“增加的”、“增加”或“上调”在本文中通常全部用来指增加统计学上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加的”或“增加”是指与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的增加、或与参考水平相比在10-100％之间的任何增加，或至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或与参考水平相比在1.0倍至10倍或更高之间的任何增加。
如本文所用，“确定表达的水平”、“确定表达水平”或“检测表达的水平”，例如在“确定基因的表达水平”中，是指量化存在于样品中的mrna的量。可以使用本文所述的本领域已知的任何方法来实现检测特异性mrna的表达。通常，mrna检测方法涉及序列特异性检测，例如通过rt-pcr。可以使用本领域已知的核酸序列设计mrna特异性引物和探针。
如本文所用，与参考水平或对照水平相比，mrna表达的“改变”水平是mrna表达水平的至少0.5倍(例如，至少：1倍；2倍；3倍；4倍；5倍；6倍；7倍；8倍；9倍；10倍；15倍；20倍；30倍；40倍；50倍；75倍；100倍；200倍；500倍；1,000倍；2000倍；5,000倍；或10,000倍)的改变。应理解，该改变可以是增加或减少。可选地，改变的表达水平被定义为使用从训练患者组建立的逻辑回归模型中的参数，将概率评分与从训练集得出的截止值进行比较，风险概率评分的增加。
如本文所用，“组合疗法”是指用某种组合物或药物治疗需要治疗的受试者，其中针对疾病，结合第一疗法和/或结合一种以上的其他疗法，例如如免疫抑制疗法或其他抗排斥疗法，治疗所述受试者或给予所述受试者一种以上的其他组合物或药物。这样的组合疗法可以是序贯疗法，其中首先用一种治疗方式(例如，药物或疗法)治疗患者，然后使用另一种治疗方式(例如，药物或疗法)等，或者可以同时施用所有药物和/或疗法。无论哪种情况，这些药物和/或疗法都被称为“共同施用”。应理解，“共同施用”并不一定意指药物和/或疗法以组合形式施用(即，它们可以分别施用或在相同或不同时间一起施用至相同或不同部位)。
如本文所用，术语“药学上可接受的衍生物”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，例如酯，其在施用于接受者后能够提供(直接或间接)本发明的化合物、或其活性代谢物或残基。这样的衍生物是本领域技术人员可识别的，无需过多的实验。尽管如此，仍参考burger的medicinalchemistryanddrugdiscovery,第5版,第1卷:principlesandpractice的教导，在教导此类衍生物的范围内通过引用并入本文。药学上可接受的衍生物包括盐、溶剂化物、酯、氨基甲酸酯和/或磷酸酯。
如本文所用，术语“治疗有效”和“有效量”可互换使用，以一定剂量或量施用，是指足以对有此需要的受试者施用后产生所需活性的组合物、化合物或药物制剂的量。在本发明的上下文中，术语“治疗有效”是指当施用活性成分的组合时，足以减轻或消除本文所述疾病或病况的至少一种症状，例如急性排斥反应和/或同种异体移植物排斥的组合物、化合物或药物制剂的量。组合的有效量可包括也可不包括如果单独施用也有效的每种成分的量。治疗制剂的剂量将根据疾病或病况的性质、患者的病史、施用频率、施用方式、和从宿主体内清除药剂等而变化。初始剂量可以更大，然后是较小的维持剂量。可以例如每周、每两周、每天、每半周等施用该剂量以维持有效剂量水平。
“对照”定义为从接受同种异体移植物且未遭受急性排斥反应的患者中获得的样品。
“诱导疗法”在本文中定义为在移植前或优选在移植当天开始向处于急性排斥反应高风险的患者施用免疫抑制剂。所述试剂是生物试剂，如下所述是淋巴细胞消耗试剂或白介素2-受体拮抗剂(il2-ra)。诱导疗法的目的是消除或调节移植时处于急性排斥反应高风险的患者的t细胞应答，并降低急性排斥反应风险。
如本文所用，早期急性排斥反应(ear)定义为在移植后6个月之前发生的排斥反应。
根据本发明，对接受肾脏移植评估的患者进行本发明的测定，作为其移植前评估的一部分。使用试剂和引物进行外周血抽取、mrna提取、并进行trex(miseq)，用于靶向扩增和测序文库生成。该测定对特定的23种基因和管家基因套组进行靶向测序。确定这23种基因的表达水平，并采用风险算法确定移植后处于急性排斥反应风险的患者的风险评估评分。如果患者的评分高于32，则将其归为高风险患者，在这种情况下，患者将接受诱导疗法和维持免疫抑制，将以与高风险患者相同的方式进行管理，例如，例如钙调神经磷酸酶抑制剂(cni's)等免疫抑制药物的锥度降低(slowertaper)、避免类固醇戒断、避免使用mtor抑制剂(例如西罗莫司(sirolimus)/替西罗莫司(temsirolimus)或依维莫司(everolimus))或贝拉西普(belatacept)。如果分数低于-23，则认为该患者发生ar的风险低，在这种情况下，该患者将不需要诱导疗法，或者他们可能是类固醇戒断、mtor抑制剂或贝拉西普的候选者。确切的截止值基于trex(miseq)分析，并且会基于其他技术，例如nanostring和qpcr，而有所不同。值得注意的是，在为患者计划免疫抑制方案时，应在其他临床因素的背景下进行该测定，所述其他临床因素会将候选者预定义为高风险，例如hla匹配和抗hla抗体的存在。
本发明基于鉴定由肾脏同种异体移植物接受者在移植前表达的基因表达谱，所述基因表达谱确定移植后急性排斥反应的风险。基因表达谱预测移植后的亚临床以及临床急性排斥反应。这使临床医生能够在移植时给出个性化免疫抑制方案的方法，从而使高风险人群的免疫抑制最大化，而低风险人群的免疫抑制降低。具体而言，对处于免疫排斥反应高风险的患者施用使用例如甲状腺球蛋白/抗胸腺细胞球蛋白(atg)或抗il-2r阻断剂或坎帕斯-1h(campath-1h)(阿仑单抗(alemtuzmab)，或针对t淋巴细胞表面存在的抗原的抗cd52单克隆抗体)的诱导疗法，而急性排斥反应低风险的患者应避免使用。诱导疗法在移植当天开始。对于维持免疫抑制，根据其他免疫学因素，可以用例如雷帕霉素(rapamycin)或贝拉西普等较弱的免疫抑制剂治疗低风险个体。这些被本领域普通技术人员认为效力较低，因为它们与高急性排斥率相关。“更强”的免疫抑制剂包括cni’s，例如他克莫司(tacrolimus)(
另外，可以指导关于捐赠者/接受者组合的决定，以最小化其他可控的免疫学因素。例如，可以基于捐赠者/接受者组合避免移植，其中接受者具有针对捐赠者hla的抗体。在该实施方案中，如果患者需要脱敏，即对捐赠者特异性抗体进行血浆置换和静脉内免疫球蛋白(ivig)施用，则可以避免移植。但是，这主要适用于活体捐赠者同种异体移植物。在该实施方案中，避免捐赠者/接受者误配可带来显著的成本节省。
另外，如果基因表达谱鉴定出个体处于急性排斥反应风险，则可以对患者进行临床实验室结果或基因表达谱的更深入的监测，以诊断亚临床急性排斥反应。
本发明提供在移植前鉴定处于急性排斥反应和移植物丧失风险的肾脏同种异体移植物接受者的方法，该方法包括以下步骤：在移植前提供肾脏同种异体移植物接受者的血液样本，从血液样本中分离mrna，从mrna合成cdna，并测定血液样本中存在的23个成员基因标志集的表达水平。测定表达水平的方法的非限制性实例包括rna-seq、靶向rna表达(trex)测序系统(illumina,inc.sandiegocalifornia)、nanostring(
已经鉴定出使用包含23种预选基因的基因标志集的外周血标志。这些预选的基因标志集可用于准确鉴定在移植手术前处于急性排斥反应和随后的移植物排斥反应风险的肾脏同种异体移植物接受者。
用于实施本公开的方法的23个成员基因标志集包含以下基因：gzmh、adgrg1、s1pr5、fgfbp2、nkg7、prf1、kiaa1671、lag3、tarp、fcrl6、faslg、tbx21、tox、znf831、cd8a、c1orf21、ccr5、ldoc1l、ccdc102a、hopx、prkch、slc25a34和f12。
在这种情况下，已经发现，如果同种异体移植物接受者的急性排斥反应风险低，但他们有5或6个hla错配，则他们会成为处于急性排斥反应高风险。hla分型可以通过流式细胞仪、rt-pcr和rna-seq进行(参考:methods.2012apr；56(4):471-6.doi:10.1016/j.ymeth.2012.03.025.epub2012年3月28日.hlatechniques:typingandantibodydetectioninthelaboratoryofimmunogenetics.bontadinia.)。
在本公开的一些方法中，期望检测和定量样品中存在的mrna。rna表达的检测和定量可以通过本领域众所周知的多种方法中的任何一种来实现。使用rna家族成员的已知序列，可以适当地设计特异性探针和引物以用于下文所述的检测方法。nanostring、rnaseq、或定量聚合酶链反应(qpcr)例如实时聚合酶链反应(rt-pcr)、或靶向rna测序(trex)等中的任何一种，均可用于本文公开的方法。在某些情况下，rna表达的检测和定量需要从例如细胞或组织等样品中分离出核酸。可以使用本领域已知的任何合适的技术分离核酸，包括rna，特别是mrna。例如，基于酚的提取是分离rna的常用方法。基于酚的试剂包含变性剂和rnaase抑制剂的组合，用于破坏细胞和组织，并随后从杂质中分离rna。另外，诸如那些使用trizoltm或trireagenttm等的提取方法纯化所有大和小的rna，并且是从含有mrna的生物样品中分离总rna的有效方法。还考虑了诸如那些使用qiagen-all制备试剂盒等的提取方法。
在一些实施方案中，期望使用定量rt-pcr。定量rt-pcr是聚合酶链反应方法的一种改进，用于快速测定核酸的量。qrt-pcr通常用于确定样品中是否存在遗传序列，以及如果存在，确定样品中拷贝数的目的。可以确定包括mrna的核酸分子的表达的任何pcr方法都在本发明的范围内。qrt-pcr方法有多种变化，这些变化是本领域普通技术人员众所周知的。在一些实施方案中，mrna表达谱可以使用
在另一个实施方案中，本发明提供用于确定接受肾脏同种异体移植物的患者是否处于同种异体移植物的急性排斥反应风险的试剂盒，所述试剂盒在一个以上的容器中包括23种基因标志集的引物对、阳性和阴性对照、缓冲液和印刷的使用说明。试剂盒还可以包括管家基因套组，以测试针对管家基因的测定和引物的质量。管家基因套组在下面的实施例6中描述。
在典型的实施方案中，临床实验室将使用患者的血样获得表达值，并将其发送给患者的医生。然后，医生将此值传达给他的基于web的服务提供商。服务提供商在生物信息学系统中输入该值，该系统已经具有p值加权参数和针对预选基因标志集的各基因的ear组和非ear组的中值表达值、以及从训练集中定义的三分位截止值。生物信息学系统使用此信息来计算患者的风险评分。计算出的风险评分反映患者的ar状态。
在可替换的实施方案中，测定在一个实验室中集中进行，并且将结果直接发送给医生，即没有基于网络的应用程序。
下面使用23种基因标志集描述使用基因标志集预测ar风险的非限制性实例。
1)选择训练组：仔细选择具有已知早期急性排斥反应(ear，移植后6个月前炎症/小管炎评分为1以上)的组和非ear对照(移植后6个月前炎症/肾小管炎评分为0，基于病理学诊断；总数n＝～100)。训练组具有特征明确的人口统计学、临床数据、和病理结果，至少由两名病理学家对此进行审查。训练集的基因表达水平用于得出p值和ear或非ear组的中值表达值，以计算各基因的风险评分。
2)测定基因的表达：使用几种众所周知的技术中的任何一种，优选通过使用trex、rt-pcr或nanostring技术，来测定训练组中每个患者移植前血样中23种基因的表达水平。在下面的实施例2、3和4中描述了trex、nanostring或qpcr技术的使用。表达水平基于所应用的技术而有所不同。trex使用映射到基因的序列读段计数。qpcr使用ct(循环时间)值，nanostring使用转录本计数。
3)建立累积风险评分和截止值：进行差异表达分析，以计算上述训练集中各基因的ear与非ear组之间的表达值差异的p值，为每个患者确定加权累积评分。用于风险评估的公式为r＝-(log10(p1)*g1+log10(p2)*g2+…+log10(pi)*gi+...+log10(p23)*g23)，其中pi是训练集中ear组与非ear组之间对于基因i(i＝1...23)的表达值的t检验的显著性p值，gi是基因i(i＝1...23)的逻辑数：1(如果基因i的表达值大于针对上调基因的训练集的ear组的中值表达值，或者如果基因i的表达值小于针对下调基因的训练集的ear组的中值表达值)、或-1(如果基因i的表达值小于针对上调基因的训练集的非ear组的中值，或者如果基因i的表达值大于针对下调基因的训练集的非ear组的中值)、或0(如果基因i的表达值介于训练集的ear组的中值和非ear组的中值之间)。
基于风险评分，获得诸如各种阈值设置下的真阳性率与假阳性率的roc(受试者工作特征)曲线的预测auc(曲线下面积)等预测统计量。roc分析可用于确定截止值或最佳模型，并通过计算曲线下面积、敏感性/特异性、阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)来测定总体预测准确性。在给定的特异性(90％)下，建立风险评分截止值，其最佳检测急性排斥反应的存在。预期在两组中存在明确的截止值，因为如果患者位于最高组，则他们极有可能具有急性排斥反应，并且测试被确定为阳性，但是如果患者位于最低组，则他们具有急性排斥反应的可能性非常低，并且测试被确定为阴性。
可选地，基于如上确定的他们的概率评分，将患者分为三分位。在这种情况下，如果患者位于(1)最高的三分位中，则他们极有可能具有急性排斥反应，并且测试被确定为阳性；(2)第二个三分位或中间组中，他们的风险无法准确确定；(3)最低三分位，他们具有急性排斥反应的可能性非常低(因此是成功移植的良好候选者)，并且测试被确定为阴性。
输入各基因的p值、ear组和非ear组的中位表达值以及从训练组中得出的风险评分截止值，并将其存储到基于网络的生物信息计算机系统中，该系统可以通过互联网从临床实验室/或医生办公室登录。
4)诊断：通过临床实验室中的训练集所使用的相同技术来测定具有未知诊断的新患者的基因标志集的表达水平。通过使用基于web的生物信息学系统，通过将从训练集中得出的logp值乘以与23种基因的ear组的中值和非ear组的中值相比较的逻辑数(1、0或-1)并加合来计算风险评分。将风险评分与截止值进行比较，以确定ar状态。患者的风险评分相对于对照中的风险评分而增加，表明患者的急性排斥反应风险增加。临床实验室会将检测结果发送给医生。
表达水平和/或参考表达水平可以存储在合适的数据存储介质(例如，数据库)中，因此也可用于将来的诊断。这也使得有效地诊断疾病的流行，因为一旦确认(将来)获得相应参考样品的受试者确实经历了急性排斥反应，就可以在数据库中鉴定出合适的参考结果。
如本文所用，“数据库”包括在合适的存储介质上收集的数据(例如，分析物和/或参考水平信息和/或患者信息)。此外，数据库可以进一步包括数据库管理系统。数据库管理系统优选地是基于网络的、分层的或面向对象的数据库管理系统。更优选地，数据库将被实现为分布式(联邦)系统，例如，作为客户端服务器系统。更优选地，数据库被构造成允许搜索算法以比较测试数据集与数据收集所包括的数据集。具体而言，通过使用这种算法，可以在数据库中搜索指示肾脏同种异体移植物排斥风险的相似或相同数据集。因此，如果可以在数据收集中鉴定出相同或相似的数据集，则测试数据集与肾脏同种异体移植物排斥风险相关。因此，从数据收集中获得的信息可用于诊断同种异体移植物接受者的同种异体移植物丧失风险，或基于从受试者获得的测试数据集。更优选地，数据收集包括上述任一组所包含的所有分析物的特征值。
本发明还提供例如向技术人员、医师或患者传达测定结果或诊断或两者。在某些实施方案中，使用计算机将测定结果或诊断或两者传达给感兴趣的各方，例如医师及其患者。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括修改接受者的临床记录，以鉴定接受者处于发生急性排斥反应和/或同种异体移植物丧失风险。临床记录可以存储在任何合适的数据存储介质(例如，计算机可读介质)中。
在本发明的一些实施方案中，基于本文提供的方法的诊断在获得诊断后尽快传达给同种异体移植物接受者。可以由接受者的主治医师将诊断传达给接受者。可选地，可以通过电子邮件将诊断发送给接受者，或者通过电话将诊断传达给受试者。该诊断可以以报告的形式发送给接受者。可以使用计算机通过电子邮件或电话传达诊断信息。在某些实施方案中，包含诊断测试结果的消息可以使用电信技术人员熟悉的计算机硬件和软件的组合来自动生成并传递给接收者。
本发明的方面包括用于鉴定尚未接受肾脏同种异体移植物并且处于急性排斥反应风险的受试者的计算机程序产品，其中当将计算机程序产品加载到计算机上时，其被配置为采用源自受试者的样品的基因表达结果，以确定接受肾脏同种异体移植物的受试者是否处于急性排斥反应风险，其中基因表达结果包括至少一种基因标志集的表达数据。
还提供为以下之一的表型的参考表达谱：(a)急性排斥反应低风险；或(b)急性排斥反应高风险；其中表达谱例如以用户可读格式记录在用户可访问的计算机可读介质上。在某些实施方案中，表达谱是低风险表型谱。在某些实施方案中，表达谱是高风险表型谱。
表达谱及其数据库可以在多种介质中提供以促进其使用。“介质”是指包含本发明的表达谱信息的制品。本发明的数据库可以记录在例如用户使用计算机直接读取和访问的任何介质等计算机可读介质上。此类介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，例如cd-rom；电存储介质，例如ram和rom；这些类别的混合体，例如磁/光存储介质。本领域普通技术人员可以容易理解可以如何使用任何当前已知的计算机可读介质来创建包括当前数据库信息的记录的制品。
“记录”是指使用本领域中已知的任何这种方法在计算机可读介质上存储信息的过程。基于用于访问所存储的信息的手段，可以选择任何方便的数据存储结构。各种数据处理器程序和格式可用于存储，例如文字处理文本文件、数据库格式等。因此，用户可访问受试者表达谱数据库，即数据库文件以用户可读格式(例如，计算机可读格式，其中用户控制计算机)保存。
如本文所用，“基于计算机的系统”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。本发明的基于计算机的系统的最小硬件包括中央处理单元(cpu)、输入装置、输出装置和数据存储装置。本领域技术人员可以容易理解，任何一种当前可用的基于计算机的系统都适用于本发明。数据存储装置可以包括如上所述的当前信息的记录的任何制品，或可以访问这种制品的存储器访问装置。
试剂盒
在某些实施方案中，提供用于确定肾脏同种异体移植物接受者急性排斥反应和同种异体移植物丧失风险的试剂盒。
试剂盒包括用于23个成员基因标志集的引物、用于trex和nanostring测定的管家基因套组(实施例6)、用于qpcr测定的包括β肌动蛋白(actb)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)在内的管家基因的引物、以及对照探针、18s核糖体rna。
试剂盒可进一步包括一种以上的mrna提取试剂和/或用于cdna合成的试剂。在其他实施方案中，试剂盒可以包括一个以上的放置生物试剂的容器，并且优选适当地等分。试剂盒还可以包括使用试剂盒材料的印刷说明。
试剂盒的组分可以在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒还可包括一种以上的药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体的非限制性实例包括无rnaase的水、蒸馏水、缓冲水、生理盐水、pbs、林格氏液、右旋糖溶液、反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液、和杂交缓冲液。
本发明的试剂盒可以采取多种形式。通常，试剂盒包括适于确定样品中基因集表达水平(例如，本文公开的那些)的试剂。任选地，试剂盒可以包括一种以上的对照样品。另外，在某些情况下，试剂盒包括提供参考(例如，预定值)的书面信息(标记)，其中受试者和参考(预定值)中的基因表达水平之间的比较指示临床状态。
总之，已鉴定出23种基因，其在基线全血中的表达能够准确预测肾脏移植接受者的早期和晚期ar和移植物丧失，优于基线人口统计学/临床特征。在两个独立组中验证的该集在预测作为移植患者的大多数(60-70％)的与捐赠者具有≤4个hla错配的患者中发生这些事件方面特别准确。因此，该基因集最佳预测急性排斥反应的风险，从而使腹侧医师可以在移植时对患者进行分层并相应地调整免疫抑制。
以下在实施例中进一步描述本发明，这些实施例旨在进一步描述本发明而不限制其范围。
实施例1：rna测序测定：23种基因集的鉴定及其在预测acr中的应用。
rna测序测定试剂盒包括：
1)illuminatruseqmrna文库制备试剂盒
2)truseqrna单索引集
3)qiagen
rna测序和数据处理方法：
在移植(基线)前，使用qiagen
结论
a)患者组描述：这项研究包括总共235例接受rna测序的具有良好质量基线血液rna的患者。其中有155例可获得有关移植前后连续进行采集的监测活检的信息，而80例仅有有关移植后6至24个月之间采集的监测活检的信息。在155例早期监测活检患者中，随机选择81例作为发现集，以鉴定预测早期急性排斥反应(ear)的基因标志集。基于移植后6个月前获得的肾脏活检的炎症或肾小管炎评分(1分以上)诊断患者。将具有特征明确的ear和非ear诊断的发现集用于鉴定基因集，并得出p值和ear组和非ear组的中值表达值，以计算风险评分。其余74例患者用作第一验证组(v1)。将80例后期监测活检的患者用作第二验证组(v2)。
(b)23种基因集的鉴定：对81位患者的发现集进行rna测序。在一系列读段质量控制之后，对原始序列读段进行映射和标准化步骤(4)。将获得的标准化读段计数用作基因的表达值。用众所周知的limma(5)测试比较发现集的ear组和非ear组的表达值(n＝81)。鉴定688个上调和653个下调的差异表达基因(deg)。使用基于ear或非ear组的中值的基因表达的比较的风险评分，从发现集中经过100次迭代步的deg中鉴定出具有最佳预测值的23种基因集(n＝81,auc＝0.80)。上面描述了用于风险评分r的公式。
(c)评估预测准确性：定义两个基因风险评分的三分位截止值(32或-23)，并证明在发现集中用于预测ear的阳性预测值(ppv)>0.70和阴性预测值(npv)>0.88。
(d)将23种基因集应用于两个验证集，以进行早期和晚期急性排斥反应或移植物丧失预测：在同种异体移植物接受者中更好的进行使用v1数据集验证通过23种基因集对早期急性排斥反应的预测(n＝74,auc＝0.74,ppv＝0.70,npv＝0.88)，在发现集定义的三分位截止值(32和-23)处)，具有少于4个hla错配(auc＝0.89,ppv＝0.75和npv＝1)。在两个验证集中，源自基因集的风险评分与移植后6个月后的ar和长期移植物丧失也显著相关(n＝154(v1+v2)，对于急性排斥反应，p＝0.041，对于移植物丧失，p＝0.034)，特别是在≤4个hla错配的同种异体移植物的接受者中(对于ar，p＝0.005；对于移植物丧失，p＝1.57e-4)。
总体而言，风险评分准确地预测了任何时间的移植物丧失(auc＝0.804～0.904)，并且对于具有≤4个hla错配的患者，该预测达到auc>0.80。当仅考虑移植后2年内的移植物丧失时，对于具有≤4个hla错配的患者，auc为0.904，而对于5年之前移植物丧失，auc为0.820。
实施例2：使用累积风险评分公式计算给定患者的风险评分：
1)从发现集或训练集中计算p值和各基因的ear组和非ear组的中值(请参阅附表中的“ear_med”，“非ear_med”和“p值”列)
2)对于具有23种基因的表达数据的患者(“患者”列)，计算逻辑数g(“g”列)
3)计算各基因的log10(p)*g(“-log10(p)*g列)
4)将23种基因的log10(p)*g相加，得出的风险评分为65.94，高于32的截止值。
实施例3：靶向rna表达(trex)测定
1)定制测定试剂盒(23种基因套组和管家基因套组的引物集(实施例6)和试剂)
2)
3)truseqrna单索引集
4)qiagen
靶向表达trex实验：
使用qiagen
trex数据处理：
使用以下程序处理由miseq测序仪产生的原始rnaseq数据：首先使用bwa1比对算法将良好质量的读段与多个人类参考数据库进行比对，所述人类参考数据库包括hg19人类基因组、外显子、剪接连接和包括核糖体和线粒体rna序列的污染数据库。过滤映射到污染数据库的读段后，接着将与所需扩增子(即配对引物的pcr产物)区域最多有2个错配的唯一对齐的读段计为相应基因的表达水平，进一步基于管家基因的表达进行标准化。
实施例4：nanostring测定
1)定制的codeset(用于23种基因套组、管家基因套组(实施例6)的条形码探针集和阴性对照，由nanostring提供)。
2)
3)qiagen
nanostring实验：
按照制造商的方案，使用qiagen
mrna转录组数据分析
使用以下过程处理来自nanostring分析仪的原始计数数据：首先将原始计数数据标准化为管家基因的计数，过滤掉低于阴性对照计数的中值加上3标准差的计数的mrna。由于使用不同试剂批次而产生的数据差异，每个不同试剂批次中每mrna的计数通过乘以不同试剂批次上样品平均计数的比例的因子进行校准。使用combat软件包进行进一步调整来自不同实验批次的校准计数。
实施例5：qpcr测定
1)引物容器(26个试管，每个试管对23种基因中的每种基因进行一个qpcr测定，其中包括23种基因套组和2种管家基因(actb和gapdh)和对照探针(18s核糖体rna)。可以从lifetech获得测定。
2)
3)
4)agilentaffinityscriptqpcrcdna合成试剂盒：用于将rna转换为cdna的最高效率，并针对实时定量pcr(qpcr)应用进行全面优化。
使用all制备试剂盒(qiagen-all制备试剂盒,valencia,causa)从同种异体移植物活检样品中提取总rna。使用具有oligodt引物的affinityscriptrt试剂盒(agilentinc.santaclara，ca)合成cdna。用于23种基因标志集、2种管家基因(actb、gapdh)和18s核糖体rna测定的taqmanqpcr购自abilifetechnology(grandisland,ny)。使用taqman通用混合物对cdna进行qpcr实验，并使用abi7900ht系统监测和采集pcr反应。样品一式三份进行测定。生成用于预测基因集以及2种管家基因的循环时间(ct)值。每基因的δct值将通过从每基因的ct值中减去管家基因的平均ct值来计算。
实施例6：用于本发明的管家基因套组：
下面呈现的是13种管家基因候选物，它们可以用作基因套组以监测本发明的测定的质量。每个套组10种基因用于监测反应的质量。该试剂盒还包括用于管家基因的引物。10种管家基因选自由以下组成的组：chtop、ykt6、rer1、pi4kb、zdhhc5、tmem248、c6orf89、smu1、shc1、dlst、ube2q1、fbxo18和slc35e1。
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5.ritchieme,phipsonb,wud,huy,lawcw,shiwandsmythgk(2015).“limmapowersdifferentialexpressionanalysesforrna-sequencingandmicroarraystudies.”nucleicacidsresearch,43(7),pp.e47.
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以做出各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。
还应理解，所有值均为近似值，并提供用于描述。在整个本申请中引用的专利、专利申请、出版物、产品描述、和方案，出于所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文。