包含IL-33的基质结合囊泡(MBV)及其用途

包含il
‑
33的基质结合囊泡(mbv)及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2018年5月3日提交的美国临时申请62/666,624的优先权，其全部内容通过引用合并入本文。
3.政府支持声明
4.本发明在美国国立卫生研究院授予的编号ar073527和hl122489拨款的政府支持下完成。美国政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
5.本发明涉及包含白介素(il)
‑
33的膜结合纳米囊泡(mbv)在治疗a)器官或组织纤维化，b)实体器官移植排斥和c)心脏病中的用途。


背景技术：

6.心脏病或损伤导致纤维化，从而导致心肌僵硬、功能丧失和心力衰竭(hf)。由于受损的心肌细胞被成纤维细胞和相关的过量细胞外基质(ecm)所替代，因此在心肌缺血(mi)后出现替代性纤维化(travers et al.,circulation research 118,1021
‑
1040(2016))。反应性间质纤维化影响微血管周围的区域和局部心肌，并促成心脏移植(htx)后的慢性同种异体移植排斥(cr)。cr导致移植后11年内移植物丢失>50％(libby and pober,immunity 14,387
‑
397(2001))。过度的炎症与不良的心脏重塑和心衰进展有关。大量实验研究表明，mi或htx后炎症的及时缓解可能有助于防止免疫驱动的纤维化的发展和进展(frangogiannis,nature reviews cardiology 11,255(2014)；suthahar,current heart failure reports 14,235
‑
250(2017))。然而，目前尚无有效的治疗方法来预防或逆转由mi后心脏损伤或缺血
‑
再灌注损伤(iri)和htx后免疫介导的发作引起的纤维化。
7.由哺乳动物细胞外基质(ecm)组成的生物支架已被开发为外科网状材料、用于局部伤口护理的粉末和水凝胶。所有这些均已获批用于大量临床应用，包括主动脉瓣和二尖瓣置换(gerdisch et al.,j.of thoracic and cardiovascular surgery 148,1370
‑
1378(2014)；brown et al.,the annals of thoracic surgery 91,416
‑
423(2011))、重建先天性心脏缺陷(scholl et al.,world journal for pediatric and congenital heart surgery 1,132
‑
136(2010))和作为心脏补片以在法洛四联症(tof)的初步修复过程中增强天然肺动脉瓣(dharmapuram et al.,world journal for pediatric and congenital heart surgery 8,174
‑
181(2017))。已显示ecm水凝胶可直接促进心肌的内源性修复(ungerleider&christman；stem cells transl med 3,1090
‑
1099(2014)；hernandez&christman,jacc basic transl sci 2,212
‑
226(2017)；wassenaar et al.,j am coll cardiol 67,1074
‑
1086(2016))，目前正在i期临床试验中进行心脏内注射，以促进心肌梗塞后心脏组织的修复(clinicaltrials.gov标识符：nct02305602)。这些基于ecm的材料最常见是异种来源，并通过其他来源组织(诸如真皮、膀胱或小肠粘膜下层(sis))的去细胞化制备(keane et al.,methods 84,25
‑
34(2015))。异种ecm支架不会引发不良的先天或适应
性免疫应答，实际上其支持抗炎和修复性先天和适应性免疫应答(huleihel et al.,in seminars in immunology,39:2
‑
13(2017))。这些天然存在的生物材料的使用通常与功能性适合部位组织的至少部分恢复相关；被称为“建设性重塑”的过程(martinez et al.,f1000prime rep 6:13(2014))。可以说，下游功能重塑结局的主要决定因素是对ecm生物支架的早期先天免疫应答(brown,et al.,acta biomater,8:978
‑
987(2012))。已表明ecm生物支架或ecm生物支架的降解产物通过促进由促炎性m1样巨噬细胞和th1 t细胞表型向促重构的m2样巨噬细胞和2型(th2)t辅助细胞应答的转变来指导组织修复(huleihel,et al.seminars in immunology,29:2
‑
13(2017))。大量研究表明，为了促进组织重塑和伤口愈合过程，而不是许多解剖部位(包括骨骼肌(kuswanto et al.,immunity 44,355
‑
367(2016)；serrels et al.,sci.signal.10,508(2017))和心血管系统(oboki et al.,proceedings of the national academy of sciences 107,18581
‑
18586(2010)；townsend et al.,journal of experimental medicine 191,1069
‑
1076(2000)))形成疤痕组织，需要巨噬细胞活化状态的适时转变。这种转变不是免疫抑制，而是建设性形式的免疫调节，可促进局部巨噬细胞表型的表型改变(oliveira et al.,plos one 8,e66538(2013)；reing et al.,biomaterials 31,8626
‑
8633(2010))。但是，先前未知ecm的哪些组成具有此功能。


技术实现要素：

8.本发明公开了用于治疗或抑制患有病症或具有患病症风险的受试者的病症的方法。在一些实施方式中，所述病症是a)器官或组织纤维化；b)实体器官移植排斥；或c)非心肌梗塞或心肌缺血的心脏病。这些方法包括选择患有病症或具有患病症风险的受试者，和向该受试者施用治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
。
9.在另外的实施方式中，公开了增加成肌细胞分化的方法。这些方法包括将成肌细胞与有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡接触，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
。
10.在一些非限制性实例中，纳米囊泡维持受试者的巨噬细胞上cd68和cd
‑
11b的表达。
11.参照附图，根据以下几个实施方式的详细描述，前述以及其他特征和优点将变得更加显而易见。
附图说明
12.图1a
‑
1e：从ecm生物支架分离的mbv包含全长il
‑
33。a，细胞因子阵列。使用r&d system的小鼠xl细胞因子阵列试剂盒分析从去细胞的wt小鼠肠道(n＝3)或去细胞的il
‑
33
‑
/
‑
小鼠肠道(n＝3)中分离的mbv的细胞因子内容物。阵列包含重复点样的111种细胞因子。方框区显示了il
‑
33斑点的位置。b，从去细胞的wt或il33
‑
/
‑
小鼠肠道中分离的mbv中表达水平最高的15种细胞因子的定量图示。c，从去细胞的wt小鼠肠道分离的mbv的透射电子
显微镜成像。箭头指示mbv。d，从三个去细胞的wt或三个il33
‑
/
‑
小鼠肠道分离的mbv中il
‑
33表达水平的免疫印迹分析。e，从实验室产生的猪膀胱基质(ubm)、小肠粘膜下层(sis)、真皮和心肌ecm以及三种市售生物支架等同物：matristem
tm
(猪尿膀胱)、xenmatrix
tm
(猪真皮)和biodesign
tm
分离的mbv中il
‑
33表达水平的免疫印迹分析。
13.图2a
‑
2e：通过掺入mbv内腔使ecm中储存的全长il
‑
33受到保护免受蛋白水解降解。a，通过尺寸排阻色谱法(sec)分馏分离mbv，并通过280nm的uv吸光度连续监测洗脱馏分。收集三十份500μl馏分。在另一项实验中，mbv首先经x
‑
100裂解，然后通过sec分离。两个uv色谱图的重叠显示，完整的mbv在较重的馏分中被洗脱，而裂解的mbv的分子组分主要在较轻的馏分中被洗脱。b，将层析的完整mbv(上图)或裂解mbv(下图)的洗脱馏分按指示合并，并通过免疫印迹分析il
‑
33。c，层析的完整mbv的合并馏分6
‑
8通过透射电子显微镜成像。d)将完整mbv的合并馏分6
‑
8直接进行生物素化以标记mbv表面蛋白，或者首先经x
‑
100裂解，然后对mbv提取物进行生物素化以标记管腔和表面蛋白。通过免疫印迹分析链霉亲和素(sa)捕获(pull down)后分离的蛋白和代表未结合链霉亲和素磁珠的未结合部分(未结合)的il
‑
33的存在。箭头指示mbv。e，蛋白酶k保护测定。在不存在或存在x
‑
100的情况下，使用指定浓度的蛋白酶k处理层析的完整mbv的合并馏分6
‑
8。通过免疫印迹分析样品的il
‑
33。
14.图3a
‑
3d：包含管腔il
‑
33的mbv通过非经典的st2非依赖性通路活化促重塑巨噬细胞表型(f4/80
+
inos
‑
arg
+
)。a,b，从未处理(对照)或经以下供试品处理24小时的wt(a)或st2
‑
/
‑
小鼠(b)收获的骨髓源巨噬细胞(bmdm)：ifnγ+lps、il
‑
4、il
‑
33、从去细胞的wt小鼠肠(wt mbv)分离的mbv、从去细胞的il
‑
33
‑
/
‑
小鼠肠道(il
‑
33
‑
/
‑
mbv)分离的mbv、或从猪小肠黏膜下层(sis mbv)分离的mbv。用f4/80(巨噬细胞标志物)、inos(m1标志物)或arg1(m2标志物)对细胞进行免疫标记。c，inos免疫标记的定量显示，与wt和st2
‑
/
‑
bmdm中的阴性对照(il
‑
4处理)相比，使用从il
‑
33
‑
/
‑
小鼠分离的ifny+lps或mbv处理后，inos表达显著增加(与阴性对照相比，**表示p<0.01；*表示p<0.05，误差线表示sem，n＝3)。d，精氨酸酶免疫标记的定量显示，与wt和st2
‑
/
‑
bmdm中的阴性对照(ifny+lps)相比，使用从wt小鼠分离的il
‑
4或mbv处理后，精氨酸酶表达显著增加(与阴性对照相比，**表示p<0.01，误差线表示sem，n＝3)。
15.图4a
‑
4b：含有il
‑
33的mbv非依赖stat6磷酸化而上调arg1表达。a,b，不处理从wt或st2
‑
/
‑
小鼠收获的骨髓源巨噬细胞(bmdm)(对照)，或用从去细胞的wt小鼠肠道(wt mbv)分离的il4、il
‑
33、mbv或从去细胞的il
‑
33
‑
/
‑
小鼠肠道(il
‑
33
‑
/
‑
mbv)分离的mbv刺激24hr(a)或30min(b)。通过免疫印迹对细胞裂解物的精氨酸酶
‑
1和st2表达(a)和stat6的磷酸化(b)进行分析。
16.图5a
‑
5b：wt mbv处理的巨噬细胞的分泌产物对于祖细胞是肌原性的。a,b将c2c
12
成肌细胞培养至融合并用增殖培养基、分化培养基或经极化和mbv处理的巨噬细胞调节的培养基处理。允许细胞分化并免疫标记肌节肌球蛋白。
17.图6a
‑
6d：移植物il
‑
33的完全缺失导致慢性排斥相关的纤维化和血管病变增加。a
‑
d，将il
‑
33
+
bm12(il33
+/+
bm12)或il
‑
33缺陷bm12(il33
‑
/
‑
bm12)移植物移植到c57bl/6(b6)il
‑
33表达(wt b6)或缺陷(il33
‑
/
‑
)b6接受体(n＝6/组)。在术后(pod)第90
‑
100天，在
h&e(a，b)、masson's trichrome(a，b)后收获并评估移植物。将空白il33
‑
/
‑
bm12心脏染色作为对照。通过nearcyte软件定量(c)血管闭塞和(d)纤维化区域的百分比。“*”表示相对il33
+/+
bm12与wt b6组有显著差异，并且通过单因素方差分析(anova)生成p值，*p<0.01，**p<0.005。
18.图7a
‑
7d：心脏移植后早期移植物il
‑
33的完全缺失增加局部炎性骨髓细胞。a
‑
d，将野生型(wt)il
‑
33+bm12和il
‑
33缺陷的敲除(ko)bm12移植物移植到wt b6接受体(n＝4
‑
5/组)。术后(pod)第3天，通过流式细胞术分析评估移植物浸润的白细胞。其中包括从原始bm12小鼠心脏中分离出的白细胞作为基线对照(对照组，n＝4)。a.每组的代表性点图绘制了在cd45
+
亲本门中发现的cd11b
+
cd11c
+
细胞的频率。b.cd11b
+ cd11c
+
门控细胞的代表性点图显示，增加的cd11c
+
细胞主要是mhcii
hi
单核细胞来源的树突状细胞(monodc)和cd11c
hi
炎性巨噬细胞。箭头指示门控细胞起源的亲本群。c
‑
d.cd11b
+
cd11c
lo
门控细胞的代表性点图显示，在il
‑
33缺失的情况下，心脏移植物的促炎性f4
‑
80
+
巨噬细胞(包括ly6c
hi mhcii
hi
子集)的频率增加。通过单因素方差分析(anova)生成p值，*p<0.05。
19.图8a
‑
8d：il33
+ mbv的施用限制了移植后早期促炎性浸润性骨髓细胞的生成。a
‑
d，将野生型(wt)il
‑
33
+
，单独il
‑
33缺陷的敲除(ko)bm12移植物，或经水凝胶中wt il
‑
33
+ mbv(il33(水凝胶))处理的il
‑
33缺陷的ko bm12移植物移植到wt b6接受体(wt；n＝4
‑
6/组)。术后(pod)第3天，通过流式细胞术分析评估移植物浸润的白细胞和脾细胞。来自原始bm12小鼠心脏和脾脏的白细胞也包括在内作为基线对照(对照组；n＝3
‑
9)。代表性点图绘制了cd45.2
+
谱系
‑
ly6g
‑
门(a)中单核细胞来源的树突状细胞(dc)和cd45.2
+
谱系ly6g cd11c
‑ cd11b
+
门(b)中的巨噬细胞亚群以及移植的浸润和接受体脾细胞(c
‑
d)的频率(％)。附图描述了巨噬细胞亚群(d)的dc(c)变化的汇总统计。所示数据的p值通过单因素方差分析(anova)产生，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001。
20.图9a
‑
9b：纤维化的治疗。来自ipf患者和年龄匹配的对照的移植肺的人肺成纤维细胞(n＝2)。(a)在治疗前，确定col1、col3和acta2的表达水平。(b)成纤维细胞经不同来源的基质结合的纳米囊泡(mbv)处理：猪去细胞尿膀胱基质(pubm ecm)、猪去细胞肺(plung)和人肺组织(hlung)；剂量不同：1
×
109和3
×
109颗粒/ml。处理48小时后，收集细胞并分离rna，用于通过qrt
‑
pcr分析衰老和纤维化标志物转录物表达。*p＜0.5，**p＜0.01，***p＜0.001。
21.序列表
22.随附的序列表中所列的核酸和氨基酸序列使用标准核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三个字母代码示出，如37c.f.r.1.822中所定义。每个核酸序列仅显示一条链，但是互补链应理解为包括任何参考显示链的内容。序列表以ascii文本文件[7123
‑
100723
‑
02sequencelisting.txt，2019年5月2日，4.0kb]提交，其通过引用结合入本文。在随附的序列表中：
[0023]
seq id no:1
‑
3是mirna序列。
具体实施方式
[0024]
ecm支架材料的降解和随后释放的具有生物活性组分的纳米囊泡(也称为“基质结合的纳米囊泡”或“mbv”)导致修复性和抗炎性m2巨噬细胞表型的活化。mbv是纳米尺寸的膜
状囊泡，嵌入在ecm的胶原蛋白网络中，可保护生物活性信号分子(microrna和蛋白)免于降解和变性。ecm生物支架及其驻留的mbv可以活化巨噬细胞，使其趋向于m2样的前重构(pro
‑
remodeling)表型。本文公开了这些mbv可以用于靶向实体器官移植后浸润受体骨髓细胞群和/或抑制同种异体移植性纤维化疾病。所公开的方法可以预防和/或治疗实体器官移植后同种异体移植纤维化疾病。
[0025]
本文公开了mbv是核外白介素33(il
‑
33)的丰富来源。il
‑
33是一种il
‑
1家族成员，通常存在于基质细胞核中，通常被认为是警报蛋白，或自组织分子，在组织损伤后释放，以通过il
‑
33受体st2活化免疫细胞(wainwright et al.,tissue engineering part c:methods 16,525
‑
532(2009))。il
‑
33通过刺激st2
+
调节性t细胞(treg)促进心脏移植后移植物存活(wainwright et al.,tissue engineering part c:methods 16,525
‑
532(2009)；et al.,journal of extracellular vesicles 3,23430(2014))。已提出细胞内il
‑
33蛋白通过由il
‑
33n末端与染色质或信号分子的相互作用来调节基因表达(jong et al.,journal of cellular and molecular medicine 20,342
‑
350(2016))。本文公开了稳定储存在ecm中并通过掺入mbv而免受蛋白水解切割的il
‑
33是通过未表征的、非经典的st2非依赖性通路的m2巨噬细胞活化的有效介体。
[0026]
从il33
+/+
小鼠组织ecm分离mbv，而非从il33
+/+
分离的mbv，将st2
‑
/
‑
巨噬细胞活化引向修复性、重塑的m2活化状态。il33
+ mbv的这种能力不同于特征明确的il
‑
4/il
‑
13介导的m2巨噬细胞分化通路，因为il33
+ mbv产生的m2类巨噬细胞非依赖于stat6磷酸化。此外，在小鼠心脏移植模型中，il
‑
33缺陷的移植物通过促炎性骨髓细胞(包括m1样巨噬细胞和单核细胞来源的dc)显示出早期移植物浸润显著增加。il
‑
33缺陷的心脏移植物移植后施用il
‑
33
+ mbv可以大大降低移植物中促炎性骨髓细胞的频率。因此，在诸如但不限于心脏移植的实体器官移植后，il33
+ mbv的递送可以抑制和/或防止排斥期间诸如急性或慢性移植排斥的髓样活化。
[0027]
此外，mbv可用于控制局部炎症，并在损伤后或与同种异体实体器官移植相关的手术程序中支持软组织修复。mbv的使用使il
‑
33能够诱导st2非依赖性基因在髓样细胞中表达。结果，该疗法可以通过将创伤或缺血损伤部位的髓样区室从典型的促炎且有害亚群(m1巨噬细胞、炎性单核细胞和炎性单核细胞来源的树突状细胞)转移到有益的修复或调节性亚群(即m2巨噬细胞和ly6clo单核细胞)中来限制随后的纤维化疾病。该技术还通过局部髓样细胞的类似修饰来支持缺陷部位的软组织和肌肉修复。
[0028]
基质结合的纳米囊泡(mbv)嵌入在ecm的纤维状网络中。这些纳米颗粒可防止其内容物在ecm支架生产过程中降解和变性。外泌体是微囊，先前几乎仅在体液和细胞培养上清液中被发现。已经证明mbv和外泌体不同。mbv与其他微囊不同，例如，它们对去污剂和/或酶消化具有抗性，包含一簇不同的microrna，并且富含mir
‑
145。mbv没有在其他微囊(如外泌体)中发现的特征性表面蛋白。如本文所公开，mbv影响细胞存活并调节愈合应答以保持或恢复神经功能。本文公开了mbv差异地调节rgc存活、轴突生长和组织重塑。
[0029]
术语
[0030]
提供术语和方法的以下解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实施本公开。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”是指一个或多个。例如，术语“包括细胞”包括单个或多个细胞，并且被认为等同于短语“包括
至少一个细胞”。除非上下文另外明确指出，否则术语“或”是指所述替代元素的单个元素或两个或更多个元素的组合。如本文所用，“包括(comprises)”是指“包括(includes)”。因此，“包括a或b”是指“包括a、b或a和b”，而不排除其他元素。本文所指的登录号的日期为至少早在2015年9月16日可用的序列。本文引用的所有参考文献、专利申请和出版物以及登录号通过引用结合入本文。为了便于回顾本公开的各种实施方式，提供了对特定术语的以下解释：
[0031]
动物：活的多细胞脊椎动物，包括，例如，哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽医受试者。
[0032]
生物相容性：当植入哺乳动物受试者中时，不会在受试者中引起不良反应的任何材料。将生物相容性材料引入个体后，能够执行其预期的功能，并且对该个体没有毒性或伤害，也不会诱导该物质在受试者体内的免疫排斥。
[0033]
心脏病或病症：对心血管系统产生消极影响的疾病或病症。该术语还旨在表示心血管事件，诸如急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、心肌缺血、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、中风、短暂性脑缺血发作、跛行和血管闭塞。因此，心脏病和病症可以包括急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、心肌缺血、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、缺血
‑
再灌注损伤、跛行、血管闭塞、动脉硬化、心力衰竭、慢性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化、主动脉瓣疾病、主动脉或二尖瓣狭窄、心肌病、房颤、心律不齐和心包疾病。
[0034]
心脏功能障碍：心脏泵血功能的任何损害。例如，这包括收缩力受损、放松能力受损(有时称为舒张功能障碍)、心脏瓣膜功能异常或不正常、心肌疾病(有时称为心肌病)、诸如心绞痛和心肌梗塞等疾病，其特征是心肌供血不足、浸润性疾病(诸如淀粉样变性病和血色素沉着病)、整体性或区域性肥大(诸如可能发生在某些心肌病或系统性高血压中)以及心脏各腔室之间的异常通讯(例如，房间隔缺损)。有关进一步的讨论，见braunwald,heart disease:a textbook of cardiovascular medicine,5th edition 1997,wb saunders company,philadelphia pa(以下称braunwald)。
[0035]
心肌病：心肌(心脏肌肉)的任何疾病或功能障碍。这些可能是炎性的、代谢的、毒性的、浸润的、成纤维的、血液学的、遗传的或起源未知的。通常主要根据临床和病理特征将它们分为三类：
[0036]
(1)扩张型心肌病，以心脏扩大和一个或两个心室的收缩功能受损为特征的综合征；
[0037]
(2)肥厚型心肌病，在本文中定义为(a)心室壁或室间隔的厚度整体或局部增加，或(b)对心室壁或室间隔的厚度整体或局部增加的敏感性增加，诸如可能在遗传疾病、高血压或心脏瓣膜功能不全中发生；或
[0038]
(3)限制性和浸润性心肌病，一组通常以心脏放松能力受损为主要临床特征的疾病(舒张功能障碍)，并且通常以异物(诸如淀粉样蛋白纤维、铁或糖脂)浸润心肌为特征。
[0039]
见wynne and braunwald,the cardiomyopathies and myocarditises,chapter 41 in braunwald。
[0040]
富集：与富集过程之前相比，在富集过程之后，混合物中目标组分(诸如纳米囊泡)与该混合物中该组分的量与其他非预期组分的量之比增加的方法。
[0041]
细胞外基质(ecm)：结构和功能性生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于围绕并支持组织内细胞的结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，除非另有说明，是无细胞的。ecm制剂可以被认为是“去细胞的”或“无细胞的”，这表示已通过本文所述和本领域已知的方法从来源组织中去除细胞。“ecm来源的材料”，诸如“ecm来源的纳米囊泡”、“基质结合的纳米囊泡”、“mbv”或“源自ecm的纳米囊泡”，其是由天然ecm或由体外来源制备的纳米囊泡，其中ecm由培养的细胞产生。ecm来源的纳米囊泡定义如下。
[0042]
纤维化相关疾病或纤维化疾病：以纤维化为主要病理基础、结果或症状的疾病或病症。纤维化或瘢痕形成定义为炎症或受损组织中和周围过度蓄积的纤维结缔组织(细胞外基质(ecm)的组分，诸如胶原蛋白和纤连蛋白)造成的，这可能导致永久性瘢痕形成、器官功能衰竭，并最终导致死亡。如果组织损伤是严重或重复性的，或者如果伤口愈合反应本身变得失调，则正常组织修复可能演变为不可逆的纤维化反应。纤维化相关疾病包括，例如，皮肤病理性瘢痕，诸如瘢痕疙瘩和肥大性瘢痕；肝硬化，诸如肝或胆囊的硬化；心脏纤维化；肝纤维化；肾纤维化；肺纤维化；骨髓纤维化；风湿性心脏病；硬化性腹膜炎；肾小球硬化、硬皮病、纵隔纤维化、腹膜后纤维化以及肌腱和软骨纤维化。纤维化可能是多种因素导致的。仅举几例，实例包括先天性遗传病症；持续感染；反复暴露于毒素、刺激物或烟；慢性自身免疫性炎症；移植物中人白细胞抗原轻度失配；心肌梗塞；血清胆固醇高；肥胖；以及糖尿病和高血压控制不佳。纤维化还可能由组织损伤引起。然而，无论引发事件如何，所有纤维化疾病的共同特征是产生ecm的成纤维细胞的活化，这是纤维化组织重塑的关键介质。如本文所用，“组织损伤”是指对组织施加的任何损害或劳损，使得在组织中发生变化或造成组织变化。组织损伤包括心脏组织损伤或肺组织损伤。本领域普通技术人员将容易认识到心脏组织损伤可以由心脏劳损或心脏超负荷引起。因此，通常，需要本文提供的方法和组合物的受试者包括其中心脏劳损增加，从而罹患心脏病或病症或纤维化相关疾病(诸如心脏纤维化)的风险增加的那些。可能导致心脏纤维化的病状包括但不限于肥厚型心肌病、结节病、心肌炎、慢性肾功能不全、中毒性心肌病、手术介导的缺血
‑
再灌注损伤、急性和慢性器官排斥、衰老、慢性高血压、非缺血性扩张型心肌病性心律失常、动脉粥样硬化、hiv相关的心血管疾病、肺动脉高压。可能导致肺纤维化的病状包括但不限于自身免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎和sjogren综合征)、胃食管反流病(gerd)、结节病、吸烟、石棉或二氧化硅暴露、暴露于岩石和金属粉尘、病毒感染、暴露于辐射和某些药物。
[0043]
移植物抗宿主病(gvhd)：骨髓或其他组织移植的常见和严重并发症，其中供给的具有免疫功能的淋巴细胞对移植接受体自身组织有反应。gvhd是使用或包含来自相关或不相关供体的干细胞的任何移植的可能并发症。
[0044]
有两种gvhd，急性的和慢性的。急性gvhd出现在移植后的前三个月内。急性gvhd的体征包括手和足出现微红皮疹，该皮疹可能扩散并变得更严重，伴皮肤剥落或起泡。急性gvhd还影响胃和肠，在这种情况下出现痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛发黄(黄疸)表示急性gvhd影响了肝脏。慢性gvhd根据其严重程度进行分级：1阶段/级为轻度；4阶段/级为重度。慢性gvhd在移植后三个月或之后发生。慢性gvhd的症状与急性gvhd的症状相似，但此外，慢性gvhd可能还影响眼睛的粘液腺、口腔的唾液腺以及润滑胃壁和肠道的腺体。
[0045]
心脏：循环血液的动物的肌肉器官。在哺乳动物中，心脏由四个腔室组成：右心房、右心室、左心房、左心室。右心房和左心房通过心房间隔彼此分隔，并且右心室和左心室通
过心室间隔彼此分隔。右心房和右心室通过三尖瓣彼此分隔。左心房和左心室通过二尖瓣彼此分隔。
[0046]
心脏的四个腔室的壁由工作肌肉或心肌以及结缔组织组成。心肌由心肌细胞组成，其在本文中也可以称为心脏细胞、心脏肌细胞、心肌样细胞和/或心肌纤维。心肌细胞可以从受试者分离并在体外生长。最靠近腔的心肌内层称为心内膜，心肌外层称为心外膜。左心室腔室部分被室间隔和左心室自由壁所限制。左心室游离壁有时分为几个区域，诸如前壁、后壁和侧壁，或先端(左心室尖端，距心房最远)和根部(左心室中最靠近心房的部分)。顶端和基部是形容词，指的是心脏的相应区域。
[0047]
在手术中，心脏的主要作用是泵出足够的含氧血液，以满足受试者组织和细胞的代谢需求。心脏以有节奏的、高度协调的收缩和舒张周期完成此任务，称为心动周期。为简单起见，心动周期可分为两大类：心室收缩期，心室收缩的心动周期阶段；和心室舒张期，即心室舒张的心动周期阶段。有关详细讨论，见braunwald的opie，第12章。除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的术语收缩期和舒张期是指心室收缩期和舒张期。
[0048]
在健康期间的正常循环中，右心房通过静脉从人体吸收大量脱氧的血液。在心脏舒张期，右心房收缩，血液通过三尖瓣流入右心室。右心室充满血液，然后收缩(收缩期)。收缩力关闭三尖瓣，迫使血液通过肺动脉瓣进入肺动脉。血液然后进入肺部，在那里释放出二氧化碳并吸收氧气。含氧的血液通过肺静脉返回心脏，并进入左心房。在心脏舒张期，左心房收缩，血液通过二尖瓣流入左心室。左心室充满血液然后收缩，基本上与右心室收缩同时发生。收缩力关闭二尖瓣并迫使血液通过主动脉瓣进入主动脉。含氧的血液从主动脉循环到身体的所有组织，然后将氧气输送到细胞。脱氧的血液然后通过静脉回到右心房。
[0049]
在左心室腔中，有两个大的、基本上呈圆锥形的心室心肌延伸，称为前乳头肌和后乳头肌。它们通过称为腱索或腱索的线状延伸连接到二尖瓣的心室表面。乳头肌和腱索的重要作用是确保二尖瓣在心室收缩期间保持关闭状态。另一个重要作用是增加心脏收缩的力量。同样，右心室有乳头肌和腱索，它们束缚三尖瓣并增加收缩力。
[0050]
由于先天性或后天病程和/或正常衰老，心肌可能发展为收缩压或舒张功能障碍，或两者兼有。收缩功能障碍称为收缩的功能障碍。舒张功能障碍称为舒张的功能障碍。有关详细讨论，见opie第12章，和braunwald中colucci等，第13章。
[0051]
由于先天性或后天病程和/或正常衰老，一个或多个心脏瓣膜可能出现功能障碍。瓣膜功能障碍通常分为两大类：狭窄，在本文中定义为在正常工作的瓣膜基本上打开时在心动周期期间瓣膜不完全打开；和不充分，在本文中定义为在正常操作的瓣膜基本上关闭时在心动周期期间瓣膜的不完全关闭。瓣膜功能不全还包括称为二尖瓣脱垂的病状，其中二尖瓣小叶在心室收缩期间向后脱出进入左心房。该病状可能与二尖瓣的轻度、中度或严重供血不足有关。
[0052]
瓣膜狭窄的典型特征是当瓣膜打开时瓣膜两端的压力梯度。瓣膜关闭时，瓣膜功能不全的典型特征是逆行(“向后”)流动。例如，二尖瓣狭窄的特征是在心室舒张末期附近穿过二尖瓣的压力梯度(作为中度二尖瓣狭窄的典型示例，左心室舒张压为5mm hg，左心房舒张压为20mm hg，压力梯度为15mm hg)。作为另一实例，二尖瓣关闭不全的特征在于在心室收缩期间血液从左心室“向后”流动到左心房。
[0053]
心力衰竭：心脏无法提供足够的含氧血液来满足受试者组织和细胞的代谢需求。
这可能伴有循环性充血，诸如肺或全身静脉充血。如本文中所用，术语心力衰竭包括任何原因的心力衰竭，并且在本文中旨在涵盖诸如“充血性心力衰竭”、“向前心力衰竭”、“向后心力衰竭”、“高输出心力衰竭”、“低输出性心力衰竭”等。有关详细讨论，见braunwald中第13
‑
17章。
[0054]
抑制：减少，诸如疾病或病症。对疾病或病症的抑制可以减少该疾病或病症的一种或多种体征或症状。
[0055]
白介素(il)
‑
33：属于细胞因子il
‑
1超家族的成员，部分基于分子β
‑
三叶结构确定，一种在其他il
‑
1细胞因子中描述的保守结构类型(包括il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
1ra和il
‑
18)。在这种结构中，β
‑
三叶草的12条β链排列在四个β链单元的三个假重复中，其中第一个和最后一个β链是六链β桶中的反平行桶板(antiparallel staves)，而每个重复序列的第二个和第三个β链形成一个位于β桶顶部的β发夹。il
‑
33与高亲和力受体家族成员st2结合。il
‑
33诱导辅助性t细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞产生2型细胞因子。人il
‑
33的示例性氨基酸序列在登录号np_001186569.1、np_001186570.1、np_001300973.1、np_001300974.1和np_001300975.1中提供，所有文献均通过引用结合入本文，可于2018年4月5日获得。
[0056]
分离的：“分离的”生物成分(诸如核酸、蛋白细胞或纳米囊泡)已与生物体或ecm的自然存在的细胞中的其他生物组分基本分离或纯化。已“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。从ecm的纤维材料中去除已分离的纳米囊泡。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸。
[0057]
赖氨酰氧化酶(lox)：一种铜依赖性酶，催化胶原和弹性蛋白前体中赖氨酸残基形成醛。这些醛具有高反应性，并与其他赖氨酰氧化酶衍生的醛残基或未修饰的赖氨酸残基发生自发化学反应。在体内，这导致胶原蛋白和弹性蛋白的交联，在稳定胶原蛋白原纤维以及成熟弹性蛋白的完整性和弹性中起作用。复杂的交联在结构不同的胶原蛋白(源自三个赖氨酸残基的吡啶啉)和弹性蛋白(源自四个赖氨酸残基的锁链素)中形成。已经从多种生物体中克隆了编码lox酶的基因(hamalainen et al.,genomics 11:508,1991；trackman et al.,biochemistry 29:4863,1990；其通过引用结合入本文)。已显示人赖氨酰氧化酶序列的残基153
‑
417和残基201
‑
417对催化功能很重要。有四个类似lox的同种型，分别称为loxl1、loxl2、loxl3和loxl4。
[0058]
巨噬细胞：一种白血细胞，可吞噬并降解细胞碎片、异物、微生物和癌细胞。这些细胞除了在吞噬作用中发挥作用外，还在发育、组织维持和修复以及先天和适应性免疫中起重要作用，因为它们募集并影响其他细胞，包括免疫细胞，诸如淋巴细胞。巨噬细胞可以以许多表型存在，包括已经被称为m1和m2的表型。主要执行促炎功能的巨噬细胞称为m1巨噬细胞(cd86+/cd68+)，而减少炎症并促进和调节组织修复的巨噬细胞称为m2巨噬细胞(cd206+/cd68+)。识别巨噬细胞各种表型的标志物在种属之间有所不同。应当注意，巨噬细胞表型由在m1和m2的极限之间范围的光谱表示。f4/80(由粘附g蛋白偶联受体e1(adgre)基因编码)是巨噬细胞标志物，见2018年4月6日的登录号np_001243181.1和2018年3月5日的np_001965，二者均通过引用结合入本文。本文公开了纳米囊泡维持受试者的巨噬细胞上cd68和cd
‑
11b的表达。
[0059]
microrna：一种小非编码rna，长度约为17至约25个核苷酸碱基，可通过通常抑制
靶mrna的翻译来转录后调节基因表达。mirna可以充当负调节子，因此更多的特定mirna与较低水平的靶基因表达相关。mirna分为三种形式：初始mirna(pri
‑
mirna)，成熟前mirna(pre
‑
mirna)和成熟mirna。初始mirna(pri
‑
mirna)表达为约数百个碱基至超过1kb的茎环结构的转录本。pri
‑
mirna转录本在细胞核中被称为drosha的rnase ii内切核酸酶切割，该酶在茎环基部附近切割茎的两条链。drosha用交错的切口切割rna双链体，在3'末端留下5'磷酸和2个核苷酸突出端。裂解产物，成熟前mirna(pre
‑
mirna)长约60至约110个核苷酸，具有以折返方式形成的发夹结构。pre
‑
mirna通过ran
‑
gtp和exportin
‑
5从细胞核转运到细胞质。pre
‑
mirna被另一种称为dicer的rnase ii核酸内切酶在细胞质中进一步加工。dicer识别5'磷酸和3'突出端，并在茎环连接处切割环，形成mirna双链体。mirna双链体与rna诱导的沉默复合物(risc)结合，其中反义链优先降解，而有义链成熟的mirna将risc导向其靶位点。成熟的mirna是mirna的生物学活性形式，其长度为约17至约25个核苷酸。
[0060]
成肌细胞：未与其他成肌细胞融合形成肌原纤维且尚未与现有肌原纤维融合的肌肉细胞。
[0061]
纳米囊泡：一种细胞外囊泡，是直径约10至约1,000nm的纳米颗粒。纳米囊泡是脂质膜结合的颗粒，其在其他分子中携带生物活性信号分子(例如，microrna、蛋白)。通常，纳米囊泡受限于脂质双层，并且生物分子被封闭和/或可以嵌入双层中。因此，纳米囊泡包括被质膜包围的内腔。可以基于直径、亚细胞来源、密度、形状，沉降速率、脂质组成、蛋白标志物、核酸含量和来源(诸如来自细胞外基质或分泌的来源)区分不同类型的囊泡。纳米囊泡可以通过其来源(诸如来自ecm的基质结合的纳米囊泡(见上文))、蛋白含量和/或mir含量识别。
[0062]“外泌体”是细胞分泌的膜状囊泡，直径范围为10至150nm。通常，晚期内体或多囊泡体包含腔内囊泡，其是通过将囊泡从有限的内体膜向内萌芽和切开形成这些封闭的囊泡而形成的。然后在与质膜融合的胞吐作用期间，这些腔内囊泡从多囊体腔释放到细胞外环境，通常释放到体液中，诸如血液、脑脊髓液或唾液。当一段膜侵入并被胞吞时，在细胞内产生外泌体。被破碎成较小囊泡并最终从细胞中排出的内在区段包含蛋白和rna分子，诸如mrna和mirna。血浆来源的外泌体在很大程度上缺乏核糖体rna。细胞外基质来源的外泌体包括特定的mirna和蛋白组分，并已显示出几乎存在于每种体液中，诸如血液、尿液、唾液、精液和脑脊液。外泌体可以表达cd11c和cd63，因此可以是cd11c
+
和cd63
+
。外泌体表面没有高水平的赖氨酰氧化酶。
[0063]“源自ecm的纳米囊泡”、“基质结合的纳米囊泡”、“mbv”或“ecm来源的纳米囊泡”均指存在于细胞外基质中的相同的膜结合颗粒，大小在10nm
‑
1000nm之间，包含具有生物活性的信号分子，诸如影响细胞行为的蛋白、脂质、核酸、生长因子和细胞因子。术语可互换使用，并且指相同的囊泡。这些mbv嵌入并结合ecm，而不仅仅是附着在表面上。这些mbv具有抗性的苛刻分离条件，诸如冻融和使用蛋白酶(诸如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶k和胶原酶)消化，以及用去污剂消化。通常，这些mbv富含mir
‑
145以及可选的mir
‑
181、mir
‑
143和mir
‑
125等。这些mbv不表达cd63或cd81，或以几乎检测不到的水平表达这些标志物(cd63
lo
cd81
lo
)。mbv在其表面含有赖氨酰氧化酶(lox)。ecm可以是来自组织的ecm，可以从培养的细胞中产生，还可以从商业来源购买。mbv与外泌体不同。
[0064]
器官排斥或移植排斥：由于受体表达的主动免疫应答而导致的器官功能和结构恶
化，与器官功能障碍的非免疫原因无关。
[0065]
可药用载体：用于本发明的可药用载体是常规的。remington’s pharmaceutical sciences,by e.w.martin,mack publishing co.,easton,pa,15th edition(1975)描述了适用于药物递送本文公开的融合蛋白的组合物和制剂。
[0066]
通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含注射液，其包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为溶媒。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可以包含少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0067]
药剂：当适当地施用于受试者或细胞时能够诱导预期治疗或预防作用的化学化合物或组合物。“孵育”包括药物与细胞相互作用的足够时间。“接触”包括将固体或液体形式的试剂，诸如外泌体、mirna或编码mirna的核酸与细胞一起孵育。
[0068]
多核苷酸：任何长度的核酸序列(诸如线性序列)。因此，多核苷酸包括寡核苷酸，以及在染色体中发现的基因序列。“寡核苷酸”是通过天然磷酸二酯键连接的多个连接核苷酸。寡核苷酸是长度为6
‑
300个核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指部分功能类似于寡核苷酸，但具有非天然存在的部分。例如，寡核苷酸类似物可以包含非天然存在的部分，诸如改变的糖部分或糖间键，诸如硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。天然多核苷酸的功能类似物可与rna或dna结合，并包括肽核酸(pna)分子。
[0069]
纯化的：术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的核酸分子制剂是其中所提及的核酸比其在细胞内自然环境中的核酸更纯的制剂。例如，纯化核酸制剂，使得该核酸代表该制剂中总蛋白含量的至少50％。类似地，纯化的外泌体制剂是其中外泌体比在包括微囊泡和外泌体的细胞环境中更纯的外泌体制剂。纯化的核酸或外泌体群大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度或游离的其他核酸酸或细胞组分。
[0070]
预防或治疗疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的发展，例如，在已知患有某种疾病(诸如青光眼)的人中。已知易感人的实例是具有家族病史的人，或者已经暴露于使受试者易患病的因素的人。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后减轻其症状或体征的治疗性干预措施。
[0071]
st2：白介素1受体家族的成员。st2也称为ilr1rl1，基于其细胞内tir结构域的功能，它也是toll样受体超家族的成员，但其细胞外区域由免疫球蛋白结构域组成。
[0072]
st2蛋白具有两种同工型，并直接参与心脏病的发展：可溶形式(称为可溶性st2或sst2)和膜结合受体形式(称为st2受体或st2l)。当心肌被拉伸时，st2基因被上调，从而增加了循环可溶性st2的浓度。st2的配体是il
‑
33。
[0073]
对心脏病或损伤(诸如局部缺血事件)应答的il
‑
33与st2受体的结合引起心脏保护作用，从而保持心脏功能。心脏保护性il
‑
33信号被可溶性st2的水平平衡，可溶性st2结合il
‑
33，使其无法用于心脏保护性信号传导的st2受体。结果，在高水平的可溶性st2存在下，心脏承受更大应力。
[0074]
受试者：人和非人动物，包括所有脊椎动物，诸如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非
人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所描述的方法的许多实施方式中，受试者是人。
[0075]
治疗有效量：足以在接受治疗的受试者中获得预期效果的特定物质(诸如mbv)的量。当施用于受试者时，通常将使用达到目标组织浓度(例如，在骨骼中)的剂量，该目标组织浓度已显示实现预期的体外效果。
[0076]
移植：组织、细胞或器官或其一部分从一个受试者转移到另一受试者，从一个受试者转移到同一受试者的另一部位或从一个受试者转移到同一受试者的相同部位。在一个实施方式中，实体器官(诸如心脏、肾脏、皮肤、胰腺或肺)移植涉及从一个受试者中去除该实体器官，并将该实体器官引入另一受试者中。
[0077]
同种异体移植或异源移植是从一个个体到另一个个体的移植，其中个体在一个或多个基因座处具有在两个个体中序列不相同的基因。同种异体移植可以发生在遗传上不同的同一种属的两个个体之间，也可以发生在两个不同种属的个体之间。自体移植是将组织、细胞或其一部分从同一个体的一个位置移植到另一位置，或将组织或其部分从一个个体移植到另一个体，其中两个个体具有遗传同一性。
[0078]“移植”是将生物相容性基质置于有需要的受试者中。
[0079]
治疗(treating)、治疗(treatment)和疗法：减轻或改善损伤、病理或病状的任何成功或成功的标志，包括任何客观或主观参数，诸如减轻、缓解、症状减轻或使患者更可忍受病状、减慢变性或衰退的速度、使变性的最终点减少衰弱、改善受试者的身心健康或改善视力。可以通过客观或主观参数评估治疗；包括体格检查、神经系统检查或精神病学评估的结果。
[0080]
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数受试者。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。因此，“包括a或b”是指包括a或b，或a和b。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似值，仅供说明。尽管类似于或等同于本文描述的方法和材料可以用于本公开的实践或检测中，但是以下描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文结合入本文。除非另有说明，否则“约”在5％之内。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并不旨在限制。
[0081]
源自细胞外基质(ecm)的纳米囊泡
[0082]
源自ecm的纳米囊泡(也称为基质结合的纳米囊泡，mbv)在pct公开号wo2017/151862中公开，其通过引用结合入本文。公开了纳米囊泡被嵌入细胞外基质中。这些mbv可以被分离并具有生物学活性。因此，这些mbv可以单独使用或与其他ecm联合使用用于治疗目的。这些mbv可以单独使用或与其他ecm联合使用用于生物支架中。本文公开了mbv包含il
‑
33，并用于治疗心脏病和病症以及纤维化疾病和病症。在一些非限制性实例中，纳米囊泡维持受试者的巨噬细胞上cd68和cd
‑
11b的表达。
[0083]
细胞外基质是结构和功能性生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于围绕并支持哺乳动物组织内细胞的结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，除非另有说明，否则其是无细胞的。通常，所公开的mbv被嵌入任何类型的细胞外基质
(ecm)中，并且可以与该位置分离。因此，mbv在ecm的表面上不是可分离地存在，也不是外泌体。
[0084]
细胞外基质公开于，例如但不限于，美国专利号4,902,508；美国专利号4,956,178；美国专利号5,281,422；美国专利号5,352,463；美国专利号5,372,821；美国专利号5,554,389；美国专利号5,573,784；美国专利号5,645,860；美国专利号5,771,969；美国专利号5,753,267；美国专利号5,762,966；美国专利号5,866,414；美国专利号6,099,567；美国专利号6,485,723；美国专利号6,576,265；美国专利号6,579,538；美国专利号6,696,270；美国专利号6,783,776；美国专利号6,793,939；美国专利号6,849,273；美国专利号6,852,339；美国专利号6,861,074；美国专利号6,887,495；美国专利号6,890,562；美国专利号6,890,563；美国专利号6,890,564；和美国专利号6,893,666；其各自通过引用以其全文结合入本文。然而，ecm可以从任何组织产生，或从任何体外来源产生，其中ecm由培养的细胞产生，并且包含天然ecm的一种或多种聚合物组分(组成)。ecm制剂可被认为是“去细胞的”或“无细胞的”，这表示细胞已从来源组织或培养物中取出。
[0085]
在一些实施方式中，ecm从脊椎动物分离，例如，从哺乳动物脊椎动物分离，包括但不限于人、猴、猪、牛、绵羊等。ecm可以源自任何器官或组织，包括但不限于膀胱、肠、肝、心脏、食道、脾、胃和真皮。在特定的非限制性实例中，细胞外基质分离自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。ecm可以包括获自器官的任何部分或组织，包括例如但不限于粘膜下层、上皮基底膜、固有膜等。在一个非限制性实施方式中，ecm从膀胱分离。ecm可以由肿瘤组织产生。
[0086]
ecm可以包括也可以不包括基底膜。在另一个非限制性实施方式中，ecm包括基膜的至少一部分。ecm材料可以保留也可以不保留包括原始组织的一些细胞成分，诸如毛细血管内皮细胞或纤维细胞。在一些实施方式中，ecm包含基膜表面和非基膜表面。
[0087]
在一个非限制性实施方式中，从猪膀胱(也称为膀胱基质或ubm)中收获ecm。简而言之，通过从哺乳动物(诸如猪)取出膀胱组织并修剪包括脂肪组织的残余外部结缔组织来制备ecm。通过用自来水反复洗涤，可去除所有残留的尿液。通过首先将组织浸泡在例如但不限于高渗盐水(例如，1.0n生理盐水)的深层透析溶液中10分钟至4小时的时间来使组织分层。暴露于高渗盐溶液中从下层基底膜中去除上皮细胞。任选地，可以将钙螯合剂添加到生理盐溶液中。在初始分层过程之后剩余的组织包括上皮基底膜和位于上皮基底膜的腔外组织层。相对脆弱的上皮基膜总是被腔表面的任何机械磨损所破坏和去除。接下来，对该组织进行进一步处理，以去除大部分来自管腔的组织，但维持上皮基底膜和固有膜。通过机械磨擦或通过酶促处理(例如，使用胰蛋白酶或胶原酶)联合水合和磨擦，将外浆膜、外膜、肌膜粘膜、粘膜下膜和大部分肌膜粘膜从剩余的上皮化组织中去除。通过使用例如但不限于adson
‑
brown镊子和metzenbaum剪刀去除肠系膜组织并用手术刀手柄或包裹在湿纱布中的其他刚性物体进行纵向擦拭运动来擦拭肌膜和粘膜下粘膜，从而机械去除这些组织。还考虑了涉及切割刀片、激光和其他组织分离方法的自动化机器人程序。除去这些组织后，所得的ecm主要由上皮基底膜和固有的固有膜组成。
[0088]
在另一个实施方式中，使用手术刀柄和湿纱布进行纵向擦拭运动，通过研磨猪膀胱组织以去除包括浆膜和肌膜的外层，以制备ecm。在组织节段外翻之后，通过相同的擦拭动作，使内膜粘膜的腔部分与下面的组织脱层。注意防止粘膜下层穿孔。在除去这些组织之
后，所得的ecm主要由粘膜下层组成(见美国专利号9,277,999的图2，其通过引用结合入本文)。
[0089]
ecm还可以制成粉末。可以根据gilbert et al.,biomaterials 26(2005)1431
‑
1435的方法制备这种粉末，该文献通过引用以其全文结合入本文。例如，可以将ubm片冻干，然后切成小片以浸入液氮中。然后可以将速冻物料粉碎，使颗粒小到足以放入旋转刀磨机中，在此处将ecm制成粉末。类似地，通过在ecm组织中沉淀nacl，材料将破裂成均匀大小的颗粒，可以将其速冻、冻干和粉化。
[0090]
在一个非限制性实施方式中，ecm源自小肠粘膜下层或sis。市售制剂包括但不限于，surgisis
tm
、surgisis
‑
es
tm
、stratasis
tm
和stratasis
‑
es
tm
(cook urological inc.；indianapolis,ind.)以及graftpatch
tm
(organogenesis inc.；canton mass.)。在另一个非限制性实施方式中，ecm源自真皮。市售制剂包括但不限于pelvicol
tm
(在欧洲以permacol
tm
出售；bard,covington,ga.)、repliform
tm
(microvasive；boston,mass.)和alloderm
tm
(lifecell；branchburg,n.j.)。在另一个实施方式中，ecm源自膀胱。市售制剂包括但不限于ubm(acell corporation；jessup,md.)。
[0091]
可以使用以下公开的方法从细胞外基质获得(释放)mbv。在一些实施方式中，ecm使用酶(诸如胃蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶或蛋白酶k)消化，并分离mbv。在其他实施方式中，通过使用溶液(诸如甘氨酸hcl、柠檬酸、氢氧化铵)改变ph，通过使用螯合剂(诸如但不限于edta、egta)、通过使用盐(诸如但不限于氯化钾(kcl)、氯化钠、氯化镁、碘化钠、硫氰酸钠)产生离子强度和离液效应，或通过将ecm暴露于变性条件(如盐酸胍或尿素)，从ecm释放和分离mbv。
[0092]
在具体实例中，在使用酶(诸如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶k、盐溶液或胶原酶)消化ecm后制备mbv。ecm可以冻融，或经受机械降解。
[0093]
公开的mbv包含il
‑
33。在一些实施方式中，不能在mbv上检测到cd63和/或cd81的表达。因此，mbv不表达cd63和/或cd81。在一个特定实例中，在纳米囊泡上不能同时检测到cd63和cd81。在其他实施方式中，mbv具有几乎不可检测的cd63和cd81水平，诸如通过western印迹可检测的水平。这些mbv是cd63
lo
cd81
lo
。本领域技术人员可以使用例如特异性结合cd63和cd81的抗体容易地鉴定cd63
lo
cd81
lo
的mbv。可以使用诸如荧光活化细胞分选(facs)和荧光标记抗体的程序来确定这些标志物的低水平，以确定cd63和cd81的低和高阈值。所公开的mbv不同于纳米囊泡，诸如由于其在生物流体中的存在而可以瞬时附着于ecm表面的外泌体。
[0094]
mbv包括溶酶氧化酶(lox)。通常，源自ecm的纳米囊泡具有比外泌体更高的lox含量。lox在mbv的表面表达。nano
‑
lc ms/ms蛋白组学分析可用于检测lox蛋白。lox的定量可以如前所述进行(hill rc,et al.,mol cell proteomics.2015；14(4):961
‑
73)。
[0095]
在某些实施方式中，mbv包括一种或多种mirna。在特定的非限制性实例中，mbv包括mir
‑
143、mir
‑
145和mir
‑
181中的一种、两种或全部三种。mir
‑
143、mir
‑
145和mir
‑
181是本领域已知的。
[0096]
mir
‑
145核酸序列在mirbase登录号mi0000461中提供，其通过引用结合入本文。mir
‑
145核酸序列是
[0097]
caccuuguccucacgguccaguuuucccaggaaucccuuagaugcuaagauggggauuccuggaaaua
cuguucuugaggucaugguu(seq id no:1)。mir
‑
181核酸序列在mirbase登录号mi0000269中提供，其通过引用结合入本文。mir
‑
181核酸序列是：
[0098]
agaagggcuaucaggccagccuucagaggacuccaaggaacauucaacgcugucggugaguuugggauuugaaaaaaccacugaccguugacuguaccuugggguccuua(seq id no:2)。mir
‑
143核酸序列在2018年3月30日的ncbi登录号nr_029684.1中提供，其通过引用结合入本文。mir
‑
143核酸序列是：
[0099]
gcgcagcgcc cugucuccca gccugaggug cagugcugca ucucugguca guugggaguc ugagaugaag cacuguagcu caggaagaga gaaguuguuc ugcagc(seq id no:3)。
[0100]
在一些实施方式中，在施用后，mbv维持受试者的巨噬细胞上cd68和cd
‑
11b的表达。在公开的实验研究中，纳米囊泡处理的巨噬细胞主要是f4/80+fizz1+，指示m2表型。因此，在一些实施方式中，巨噬细胞维持m2表型。
[0101]
可将本文公开的mbv配制成用于药物递送的组合物，并用于生物支架和装置中。mbv在pct公开号wo 2017/151862中公开，其通过引用结合入本文。
[0102]
从ecm分离mbv
[0103]
为了产生mbv，ecm可以由任何目标细胞产生，或者可以从商业来源利用，参见上文。mbv可以由与所治疗的受试者相同或不同的物种产生。在一些实施方式中，这些方法包括用酶消化ecm以产生消化的ecm。在特定的实施方式中，用胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶、金属蛋白酶和/或蛋白酶k中的一种或多种消化ecm。在特定的非限制性实例中，仅用弹性蛋白酶和/或金属蛋白酶消化ecm。在另一个非限制性实例中，ecm不被胶原酶和/或胰蛋白酶和/或蛋白酶k消化。在其他实施方式中，ecm用去污剂处理。在进一步的实施方式中，该方法不包括使用酶。在特定的非限制性实例中，该方法利用离液剂或离子强度来分离mbv，诸如盐，诸如氯化钾。在另外的实施方式中，在分离mbv前，可以操纵ecm以增加mbv含量。
[0104]
在一些实施方式中，用酶消化ecm。ecm可以用该酶消化约12至约48小时，诸如约12至约36小时。ecm可以用该酶消化约12、约24、约36或约48小时。在一个特定的非限制性实例中，在室温下用酶消化ecm。但是，消化可以在约4℃下，或约4℃至25℃之间的任何温度下进行。通常，用酶消化ecm足以去除胶原纤维的任何时间长度和温度。消化过程可以根据组织来源而变化。任选地，在用酶消化之前或之后，通过冻融处理ecm。ecm可以用去污剂处理，包括离子和/或非离子去污剂。
[0105]
然后处理消化的ecm，诸如通过离心，以分离无原纤维的上清液。在一些实施方式中，将消化的ecm，例如，以约300至约1000g离心进行第一步骤。因此，消化的ecm可以约400g至约750g，诸如约400g、约450g、约500g或约600g离心。该离心可发生约10至约15分钟，诸如约10至约12分钟，诸如约10、约11、约12、约14、约14或约15分钟。收集包括消化的ecm的上清液。
[0106]
mbv包括lox。在一些实施方式中，用于分离此类mbv的方法包括使用弹性蛋白酶和/或金属蛋白酶消化细胞外基质以产生消化的细胞外基质，将消化的细胞外基质离心以除去胶原原纤维残余物并因此产生无纤维的上清液，离心分离无纤维的上清液以分离固体物质，并将固体物质悬浮在载体中。
[0107]
在一些实施方式中，也可以将消化的ecm以约2000g至约3000g离心进行第二步骤。
因此，可以将消化的ecm以约2,500g至约3,000g，诸如以约2,000g、2,500g、2,750g或3,000g离心。该离心可以进行约20至约30分钟，诸如约20至约25分钟，诸如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30分钟。收集包括消化的ecm的上清液。
[0108]
在另外的实施方式中，可以将消化的ecm以约10,000至约15,000g离心进行第三步骤。因此，可以将消化的ecm以约10,000g至约12,500g，诸如约10,000g、11,000g或12,000g离心。该离心可以进行约25至约40分钟，诸如约25至约30分钟，例如约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40分钟。收集包括消化的ecm的上清液。
[0109]
这些离心步骤中的一个、两个或全部三个可以单独使用。在一些实施方式中，使用全部三个离心步骤。可以重复离心步骤，诸如2、3、4或5次。在一个实施方式中，所有三个离心步骤均重复三次。
[0110]
在一些实施方式中，将消化的ecm以约500g离心约10分钟、以约2,500g离心约20分钟和/或以约10,000g离心约30分钟。这些步骤(诸如所有三个步骤)重复2、3、4或5次，诸如3次。因此，在一个非限制性实例中，将消化的ecm以约500g离心约10分钟、以约2,500g离心约20分钟和以约10,000g离心约30分钟。将这三个步骤重复三次。因此，产生无纤维的上清液。
[0111]
然后将无纤维的上清液离心以分离mbv。在一些实施方式中，将无纤维的上清液以约100,000g至约150,000g离心。因此，将无纤维的上清液以约100,000g至约125,000g，诸如约100,000g、约105,000g、约110,000g、约115,000g或约120,000g离心。该离心可进行约60至约90分钟，诸如约70至约80分钟，诸如约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90分钟。在一个非限制性实例中，将无纤维的上清液以约100,000g离心约70分钟。收集固体物质，即mbv。然后，这些mbv可以重悬于任何目标载体中，诸如但不限于缓冲液。
[0112]
在进一步的实施方式中，ecm不被酶消化。在这些方法中，ecm悬浮在等渗盐溶液中，诸如磷酸盐缓冲液。然后将盐添加到悬浮液中，以使盐的最终浓度大于约0.1m。浓度可以是，例如，至多约3m，例如，约0.1m盐至约3m，或约0.1m至约2m。盐可以是，例如，约0.1m、0.15m、0.2m、0.3m、0.4m、0.7m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。在一些非限制性实例中，盐是氯化钾、氯化钠或氯化镁。在其他实施方式中，盐是氯化钠、氯化镁、碘化钠、硫氰酸钠、钠盐、锂盐、铯盐或钙盐。
[0113]
在一些实施方式中，将ecm悬浮在盐溶液中约10分钟至约2小时，诸如约15分钟至约1小时、约30分钟至约1小时或约45分钟至约1小时。ecm可以悬浮在盐溶液中约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110，115或120分钟。ecm可以在4℃至约50℃的温度(诸如但不限于约4℃至约25℃或约4℃至约37℃)下悬浮在盐溶液中。在特定的非限制性实例中，ecm在约4℃下悬浮在盐溶液中。在其他特定的非限制性实例中，ecm在约22℃或约25℃(室温)下悬浮在盐溶液中。在另外的非限制性实例中，ecm在约37℃下悬浮在盐溶液中。
[0114]
在一些实施方式中，该方法包括以大于约0.4m的盐浓度孵育细胞外基质；或将其以大于约0.4m的盐浓度孵育。离心消化的细胞外基质以去除胶原原纤维残余物，并分离上清液；离心上清液以分离固体物质；将固体物质悬浮在载体中，从而从细胞外基质中分离mbv。
[0115]
在盐溶液中孵育后，将ecm离心去除胶原蛋白原纤维。在一些实施方式中，还可以
将消化的ecm以约2000g至约5000g离心。因此，消化的ecm可以以约2,500g至约4,500g，诸如约2,500g、约3,000g、3,500g、约4,000g或约4,500g离心。在一个特定的非限制性实例中，离心速度为约3,500g。该离心可以进行约20至约40分钟，诸如约25至约35分钟，诸如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34或约35分钟。然后收集上清液。
[0116]
在另外的实施方式中，然后可以将上清液以约100,000至约150,000g离心进行第三步骤。因此，可以将消化的ecm以约100,000g至约125,000g，诸如约100,000g、110,000g或120,000g离心。该离心可以进行约30分钟至约2.5小时，诸如约1小时至约3小时，诸如约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟(2小时)。收集固体物质并将其悬浮在溶液中，例如缓冲盐水中，从而分离mbv。
[0117]
在其他实施方式中，ecm悬浮在等渗缓冲盐溶液中，诸如但不限于磷酸盐缓冲液。可以使用离心或其他方法去除大颗粒(见下文)。然后利用超滤从ecm中分离mbv，即约10nm至约10,000nm之间，诸如约10nm至约1,000nm之间，诸如约10nm至约300nm之间的颗粒。
[0118]
在特定的非限制性实例中，等渗缓冲盐溶液的总盐浓度为约0.164mm，并且ph为约7.2至约7.4。在一些实施方式中，等渗缓冲盐溶液包括0.002m kcl至约0.164m kcl，诸如约0.0027m kcl(磷酸盐缓冲液中的kcl浓度)。然后通过超速离心处理该悬浮液。
[0119]
在等渗缓冲盐溶液中孵育后，将ecm离心去除胶原蛋白原纤维。在一些实施方式中，还可以将消化的ecm以约2000g至约5000g离心。因此，消化的ecm可以以约2,500g至约4,500g，诸如约2,500g、约3,000g、3,500g、约4,000g或约4,500g离心。在一个特定的非限制性实例中，离心速度为约3,500g。该离心可以进行约20至约40分钟，诸如约25至约35分钟，诸如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30分钟、约31、约32、约33、约34或约35分钟。
[0120]
可以使用微滤和离心并结合以从悬浮液中除去大分子量物质。在一个实施方式中，使用微滤除去大分子材料，诸如大于200nm。在另一个实施方式中，通过使用离心除去大尺寸的材料。在第三个实施方式中，微过滤和超离心均用于去除大分子量材料。从悬浮的ecm中除去大分子量的材料，诸如大于约10,000nm、大于约1,000nm，大于约500nm或大于约300nm的材料。
[0121]
然后将用于微滤的流出物或上清液进行超滤。因此，收集并利用包括小于约10,000nm、小于约1,000nm、小于约500nm或小于约300nm的颗粒的流出物。然后用截留分子量为3,000至100,000的膜对该流出物进行超滤。在实例中使用100,000mwco。
[0122]
治疗受试者的方法
[0123]
目前公开的方法包括向受试者施用治疗有效量的含il
‑
33的mbv，从而治疗受试者，并抑制受试者的疾病或病症。在一些实施方式中，所述方法对疾病或病症进行预防。
[0124]
在一个非限制性实施方式中，所述疾病或病症是器官或组织纤维化。例如，纤维化是肝硬化、肺纤维化、心脏纤维化、纵隔纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、肾源性系统性纤维化、瘢痕纤维化、硬皮病纤维化、肾纤维化、淋巴组织纤维化、动脉纤维化、毛细血管纤维化、血管性纤维化或胰腺纤维化。在一个实施方式中，纤维化是肺纤维化。纤维化可以包括特发性肺纤维化、疾病或暴露于环境毒素导致的肺纤维化、或辐射诱发的肺纤维化。在另一个实施方式中，纤维化是心脏纤维化。心脏纤维化可以包括反应性间质纤维化、置换性纤维
化、浸润性纤维化或心肌内膜纤维化。在一个实施方式中，纤维化与急性或慢性器官排斥有关。例如，在一个实施方式中，纤维化是与移植心脏的急性或慢性排斥相关的心脏纤维化。
[0125]
在另一个非限制性实施方式中，所述疾病或病症是心脏病或病症。在一个实施方式中，所述疾病或病症是非心肌梗塞的心脏病或病症。在另一个实施方式中，心脏病或病症是非心肌缺血的心脏病或病症。在又一个实施方式中，心脏病或病症是非心肌梗塞或心肌缺血的心脏病或病症。在一个实施方式中，所述疾病或病症是心肌梗塞或心肌缺血。在一个实施方式中，心脏病或病症选自心肌梗塞、心肌缺血、急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性缺血发作、缺血
‑
再灌注损伤、跛行、血管阻塞、动脉硬化、心力衰竭、慢性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心脏肥大、主动脉瓣疾病、主动脉或二尖瓣狭窄、心肌病、房颤、心律不齐和心包疾病。在一个实施方式中，心脏病或病症选自急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、缺血
‑
再灌注损伤、跛行、血管阻塞、动脉硬化、心力衰竭、慢性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心脏肥大、主动脉瓣疾病、主动脉或二尖瓣狭窄、心肌病、房颤、心律不齐和心包疾病。在又一个实施方式中，所述疾病是急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、跛行、血管阻塞、动脉硬化、心力衰竭、心脏肥大和心肌病。在又一个实施方式中，所述疾病是心肌梗塞、心肌缺血、急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、跛行、血管闭塞、动脉硬化、心力衰竭、心脏肥大和心肌病。
[0126]
在另一个非限制性实施方式中，所述疾病或病症是实体器官移植排斥。在一实施方式中，移植的实体器官是肝、肾、心脏、皮肤、肺、胰腺或肠。在一个实施方式中，移植的实体器官是肺。在另一个实施方式中，移植的实体器官是心脏。在一个实施方式中，移植排斥是慢性器官移植排斥。在另一个实施方式中，移植排斥是急性器官移植排斥。
[0127]
在又一个非限制性实施方式中，所述疾病或病症是移植组织排斥，例如，心脏瓣膜、血管、骨骼、角膜或同种异体移植的复合组织，包括面部、手或手指。
[0128]
患有或具有患疾病或病症(诸如心脏病或病症、实体器官移植排斥或器官或组织纤维化)风险的受试者可以通过膜结合st2增强il
‑
33信号传导进行治疗，见公开的美国专利申请号2008/0003199a1，其通过引用结合入本文。本文公开了mbv包括il
‑
33，因此可以用于这些受试者。包含膜包裹的il
‑
33的mbv的使用可防止il
‑
33与st2受体结合，并减轻促炎性激酶级联反应的诱导。在一些非限制性实例中，纳米囊泡维持受试者的巨噬细胞上cd68和cd
‑
11b的表达。
[0129]
il
‑
33稳定存在于mbv内腔中。在mbv被细胞摄取后，封装在mbv中的il
‑
33绕过经典的st2受体信号通路，从而指导免疫细胞的分化和/或功能。
[0130]
在一些实施方式中，可以使用所公开的方法治疗受试者，其中该受试者患有心脏病或病症或具有发展为心脏病或病症的风险，包括已诊断(使用本文提供的方法和/或本领域已知的方法)患有心脏病或病症的受试者，以及被视为将来具有患心脏病或病症风险的受试者。后一组受试者包括具有患心血管事件风险的受试者。在更多的实施方式中，心脏病不是心肌梗塞或心肌缺血。在其他实施方式中，所述病症是心脏纤维化和/或心力衰竭。在一个实施方式中，所述疾病是心力衰竭。
[0131]
所述方法和组合物可用于任何心脏病或病症的急性、慢性和预防性治疗。如本文
所用，急性治疗是指当前患有特定疾病或病症(诸如缺血事件)的受试者的治疗。预防性治疗是指对具有患疾病或病症风险，但目前尚无或没有疾病或病症症状的受试者的治疗。如果需要治疗的受试者患有特定的心脏病或病症，则治疗心脏病或病症是指改善、少或消除该疾病或病症或由该疾病或病症引起的一种或多种症状。如果需要治疗的受试者是具有发展为心脏病或病症的风险的人，则治疗该受试者是指降低该受试者发展为该疾病或疾病的风险。
[0132]
本文公开了用于预防或治疗移植物抗宿主病(gvhd)的方法。因此，可以选择患有gvhd或具有gvhd风险的治疗受试者。gvhd可以是急性或慢性的。
[0133]
在一些实施方式中，治疗的受试者是移植的器官(诸如实体器官)移植的接受体。器官移植的实例包括实体器官移植，包括肾脏、皮肤、肝脏、复合组织同种异体移植物(cta；包括面部、手、四肢、阴茎)或心脏。肾脏移植约占实体器官移植的60％，其次是肝脏移植占21％、心脏移植占8％、肺移植占4％，其余7％则代表其他器官移植，诸如胰腺和肠(optn/srtr年度报告2004)。器官的类型没有特别限制，并且包括实质器官，诸如心脏、肝脏、肾脏、胰腺、肺和小肠。然而，所公开的方法还适用于心脏瓣膜、血管、皮肤、骨骼和角膜的移植。因此，可以选择已接受任何类型的器官移植的治疗受试者。移植物可以是实体器官移植物。实体器官可以是心脏。mbv可以在移植时或移植程序后(诸如移植的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天)施用。在一些非限制性实例中，可以将mbv直接施用于移植物。
[0134]
公开了抑制排斥的方法，诸如实体器官移植的急性或慢性排斥。由本发明的抑制剂抑制的排斥的类型没有特别限制，但是可以是在实际的移植医学中成为问题的急性排斥。这些排斥是一种病理状态，在这种状态下，同种异体移植物由于决定组织相容性的主要组织相容性复合体(mhc)的差异而被识别为外来抗原，因此会通过活化受体的细胞毒性t细胞和辅助性t细胞而受到攻击。急性排斥通常在移植后三个月内发展。但是，排斥也可以被认为是移植后三个月或更长时间进入同种异体移植组织的细胞浸润。所公开的方法在移植后的任何时间均可以使用，包括在移植后三个月内或在移植后三个月后。在一些实施方式中，所述方法通过抑制损伤来改善移植器官的活力。
[0135]
在另一个实施方式中，所述受试者患有纤维化相关疾病或具有患纤维化相关疾病的风险。还提供了使用治疗有效量的mbv减少纤维化的方法。这样的方法可以在体外或体内进行。如本文所用，“接触”是指放置诸如mbv之类的试剂，以使其直接与一个或多个细胞相互作用，或间接地以使得该一个或多个细胞以某种方式受到影响。当在体内实施该方法时，以有效减少纤维化的量向受试者施用mbv。在进一步的实施方式中，公开的方法增加了出现纤维化的组织或器官天然的解剖学合适的细胞。
[0136]
在心脏纤维化的情况下，以减少纤维化和/或增加心肌细胞有效的量向受试者施用mbv。评估天然细胞生长或纤维化减少的方法对于本领域普通技术人员将是显而易见的。因此，患有或具有发展为纤维化相关疾病风险的受试者也可以通过施用mbv进行治疗。在特定的非限制性实施方式中，提供了治疗纤维化的方法。这些包括但不限于肝硬化、肺纤维化、心脏纤维化、纵隔纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、肾源性全身纤维化、瘢痕纤维化、硬皮病纤维化、肾纤维化、淋巴组织纤维化、动脉纤维化、毛细血管纤维化、血管纤维化或胰腺纤维化。在特定的非限制性实例中，所述疾病是肺纤维化，诸如间质性肺纤维化或由职业暴露引起的纤维化。
[0137]
在一些实施方式中，为了治疗肺，可以使用吸入制剂来施用包含mbv的组合物。这些吸入制剂可以包括气雾剂、微粒等。通常，为了使药物到达肺的肺泡区域进行吸收，吸入颗粒的目标大小约为1μm或更小。但是，可以改进粒径以调节肺中的沉积区域。因此，可以利用较大的颗粒(诸如直径约1至约5μm)来实现在呼吸细支气管和空气空间中的沉积。
[0138]
为了通过吸入给药，可以使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，以气雾剂形式从加压包装或喷雾器中方便地递送组合物。在使用加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量进行确定。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒，其中含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0139]
在另一个实施方式中，将治疗有效量的另外的试剂，诸如抗炎剂、支气管扩张剂、酶、祛痰剂、白三烯拮抗剂、白三烯形成抑制剂或肥大细胞稳定剂与mbv联合施用。这些可以同时施用，诸如以单一制剂施用，或序贯施用。
[0140]
可以通过本领域技术人员已知的方法通过监测肺功能来测量治疗的有效性。例如，可以在治疗之前、期间或之后研究肺功能的各种可测量参数。肺功能可以通过测试肺部几种物理可测量的操作中的任何一种进行监测，包括但不限于吸气流速、呼气流速和肺容积。如通过数学公式和统计方法所确定，这些参数中的一个或多个的统计上显著增加表明治疗的有效性。
[0141]
临床实践中最常用的测量肺功能的方法包括定时测量吸气和呼气动作以测量特定参数。例如，fvc会根据患者深深的最初吸气力来衡量患者呼出的总体积(以升为单位)。结合fev1进行评价时，此参数允许对支气管收缩进行定量评价。如通过本领域技术人员熟知的数学公式所确定，fvc或fev1的统计学上显著的增加反映了支气管收缩的减少，并表明治疗具有有效性。
[0142]
确定强制肺活量的一个问题是强制肺活量的动作(即，从最大吸气到最大呼气的强制呼气)在很大程度上取决于技术。换句话说，给定的受试者可能会在一系列连续的fvc操作期间产生不同的fvc值。fef 25
‑
75或在强制呼气操作的中部确定的强制呼气流量往往比fvc对技术的依赖性较小。同样，fev1与fvc相比，对技术的依赖性较低。因此，如通过本领域技术人员众所周知的数学公式所确定的，fef 25
‑
75或fev1的统计学上显著的增加反映了支气管收缩的降低，并表明治疗具有有效性。
[0143]
除了测量呼出空气量作为肺功能指标外，在呼气周期的不同部分测量的每分钟升流量也可以用于确定患者的肺功能状态。尤其是，最大呼气量(在强制最大呼气期间以升/分钟为单位的最高气流速率)与哮喘和其他呼吸系统疾病患者的整体肺功能密切相关。因此，如通过本领域技术人员数值的数学公式所确定，施用后的呼气峰流量在统计学上显著增加表明该疗法具有有效性。
[0144]
在一些实施方式中，选择已诊断并正在接受另一种治疗剂用于治疗心脏病或病症或纤维化相关疾病或移植排斥的受试者。治疗剂可以是化学或生物剂，但也可以是非药物治疗，诸如饮食和/或运动。在一些实施方式中，治疗剂(用于心脏病或病症)包括降低c
‑
反应蛋白(crp)水平的治疗剂的用途。在其他实施方式中，治疗剂(用于心脏病或病症)包括他汀类药物的用途。在其他实施方式中，选择具有高于1mg/l的crp水平的治疗受试者。当治疗移植排斥时，治疗剂例如可以是免疫抑制剂。例如，用于纤维化相关疾病的疗法可以是使用
抗炎药或免疫抑制剂。
[0145]
在一些实施方式中，对受试者进行选择，用所公开的方法进行治疗，该受试者患有原发性(首次)心血管事件，诸如，例如，心肌梗塞或已进行血管成形术。患有原发性心血管事件的受试者发生继发性(第二次)心血管事件的风险较高。在一些实施方式中，受试者没有发生原发性心血管事件，但是由于受试者具有一种或多种风险因素而具有发生心血管事件的风险升高。原发性心血管事件的风险因素实例包括：高脂血症、肥胖、糖尿病、高血压、高血压前期、全身性炎症标志物水平升高、年龄、心血管事件和吸烟的家族史。心血管事件的风险程度取决于受试者的风险因素的种类和严重程度或量级。风险图表和预测算法可以用于根据风险因素的存在和严重程度评估受试者发生心血管事件的风险。这样的一个实例是framingham心脏研究风险预测评分。如果受试者的10年framingham心脏研究风险评分计算值大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更高，则该受试者发生心血管事件的风险较高。评估受试者发生心血管事件的风险的另一种方法是总体风险评分，该评分将对全身炎症指标(诸如crp)水平的测量结果纳入framingham心脏研究风险预测评分。评估受试者中心血管事件的风险的其他方法包括冠状动脉钙扫描、心脏磁共振成像和/或磁共振血管造影。在一些实施方式中，选择用于接受所公开的方法治疗的受试者患有原发性心血管事件并具有一种或多种其他风险因素。在另一个实施方式中，该受试者正在接受他汀类药物疗法以降低脂质水平。在另一个实施方式中，该受试者具有健康的脂质水平(即，该受试者未患有高脂血症)。因此，在一个实施方式中，根据本发明的方法向患者施用mbv，以预防或降低患者发展出心脏病或病症的风险。换句话说，将mbv作为预防心脏病或疾病的方法施用于患者。在这种情况下，患者需要预防，因为患者表现出一种或多种心脏病或失调的风险因素。然而，该患者尚未被诊断出或显示出诊断出心脏病或病症所需的所有症状。在一些实施方式中，选择进行治疗的受试者患有或曾经患有中风。中风(在本文中也称为缺血性中风和/或脑血管缺血)被世界卫生组织定义为脑功能的局灶性或整体性紊乱的快速发展的临床体征，症状持续至少24小时。中风还涉及死亡，除血管源性影响外，没有其他明显原因。中风通常是由连接至大脑或大脑内部血管堵塞或阻塞引起。完全阻塞后，脑循环停止会在几秒钟内停止神经元电活动。能量状态和离子稳态下降后的几分钟内，高能磷酸盐耗竭、膜离子泵故障、细胞钾流出、氯化钠和水的流入以及膜去极化发生。如果阻塞持续超过五到十分钟，则导致不可挽回的损害。但是，对于不完全缺血的患者，其结果难以评估，并且在很大程度上取决于残余灌注和氧气的可用性。脑血管血栓阻塞后，局部缺血很少发生。取决于侧支血流和局部灌注压力，一些残余灌注通常会持续存在于缺血区域。所公开的方法可用于中风的治疗。
[0146]
尽管缺血事件可以在血管系统的任何位置发生，但颈动脉分叉和颈内动脉的起源是脑血管血栓闭塞的最常见部位，从而导致脑缺血。由于狭窄或血栓形成而导致的血流减少的症状与大脑中动脉疾病引起的症状相似。通过眼动脉的血流经常受到足够的影响，以产生黑朦或短暂性单眼失明。严重的双侧颈内动脉狭窄可能导致脑半球灌注不足。这表现为与急性缺血半球同侧的急性头痛。阻塞或血流减少，导致在前交通动脉远端的一条前脑动脉缺血，在对侧腿部(较不常见)近端臂中产生运动和皮层感觉症状。前脑动脉闭塞或灌注不足的其他表现包括步态共济失调，有时由于矢状旁矢状叶的损伤而导致尿失禁。语言障碍表现为自发性言语减少，可能伴有精神运动活动的普遍抑制。
[0147]
通过出现的症状和/或通过包括介入和非介入诊断工具(例如诸如ct和mr成像)的体格检查来诊断患有中风的受试者。中风受试者可能会出现以下一种或多种症状：麻痹、虚弱、感觉和/或视力下降、麻木、刺痛、失语(例如，无法讲话或口齿不清、阅读或书写困难)、失明(例如，无法识别或识别感觉刺激)、记忆力减退、协调困难、嗜睡、瞌睡或神志不清、膀胱或肠道控制不足以及认知能力下降(例如，痴呆、注意力不集中、无法集中注意力)。使用医学成像技术，可以将患有中风的受试者识别为患有脑梗塞的受试者或患有脑出血的受试者。
[0148]
提供的组合物和方法可以用于已出现中风的患者或可以作为预防中风的预防性治疗。对于具有外科手术或诊断程序的受试者指示短期预防治疗，这些程序具有释放栓子、降低血压或减少脑血流量的风险，以减少由于该程序而导致的任何缺血事件所造成的伤害。对于患有可能导致流向大脑的血流减少或直接影响脑血管的疾病的心脏病的患者，应进行较长时间或长期的预防性治疗。如果是预防性的，则如上所述针对具有缺血性中风风险的受试者进行治疗。如果受试者已出现中风，则治疗可以包括急性治疗。中风受试者的急性治疗是指在病状的症状发作时或发作后48小时内，优选在24小时内，更优选在12小时内，更优选在6小时内，甚至更优选在病状的症状发作后的1、2或3个小时内，或者在诊断时立即或在医务人员疑似已发生中风时施用本发明的组合物。
[0149]
在其他实施方式中，受试者可以是患有心肌梗塞或具有患心肌梗塞风险的受试者。“患有心肌梗塞”是指该受试者当前患有或已患有心肌梗塞。在一些实施方式中，施用应提前(如果及时被疑似或诊断)或在48小时内使用，但是晚施用，例如心血管事件或诊断或疑似心脏病或病症后的14天内，也可能是对受试者有益的。立即施用还可以包括在诊断或疑似有心血管事件或心脏病或疾病后的15、20、30、40或50分钟内，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20或22小时内，或在1或2天内。在又一个实施方式中，含il
‑
33的mbv可以在诊断或疑似心血管事件或心脏病或病症之时或之后不久施用数天、一周或几周(例如，1、2、3或4周)。
[0150]
用于诊断心肌梗塞的许多实验室检测是本领域熟知的。通常，检测可分为四个主要类别：(1)组织坏死和炎症的非特异性指标，(2)心电图，(3)血清酶变化(例如，肌酸磷酸激酶水平)和(4)心脏成像。本领域普通技术人员可以容易地应用任何前述检测来确定受试者何时具有患心肌梗塞的风险，正在遭受或曾遭受心肌梗塞。
[0151]
受试者可能患有心力衰竭。心力衰竭是一种由多种原因导致的临床综合征，其与心脏抽血功能受损的共同点有关，其特征是心脏不能泵出与代谢组织需求相称的血液，或者仅通过提高充盈压力来实现。
[0152]
在其他实施方式中，受试者患有心脏肥大。这种情况通常以左心室肥大为特征，通常具有未扩张腔室，没有明显的前因。当前的诊断方法包括心电图和超声心动图。但是，许多患者没有症状，可能是已知疾病患者的亲属。不幸的是，这种疾病的最初表现可能是突然死亡，经常发生于儿童和年轻人，经常发生在体育锻炼过程中或体育锻炼之后。
[0153]
在另一个实施方式中，受试者的心脏病或病症或其风险的标志物水平升高。标志物可以是，例如，胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)或全身炎症的标志物。标志物的升高水平是高于健康受试者群体(例如，无心脏病或病症的体征和症状的人受试者)的平均值的水平。当标志物为crp时，>1的crp水平被认为是升高的水平。
[0154]
可以选择患有纤维化的受试者。在一些实施方式中，已诊断该受试者患有肝硬化、肺纤维化、心脏纤维化、纵隔纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、肾源性系统性纤维化、瘢痕纤维化、硬皮病纤维化、肾纤维化、淋巴组织纤维化、动脉纤维化、毛细血管纤维化、血管纤维化或胰腺纤维化。可以选择已暴露于或可能暴露于无机颗粒的治疗受试者，所述无机颗粒包括但不限于二氧化硅、石棉、浆果、煤粉或铝土矿。可以选择受试者治疗间质性肺纤维化。可以选择患有心脏纤维化的受试者用于治疗。所公开的方法可以用于治疗或抑制受试者的纤维化。
[0155]
药物组合物可以包含mbv和任选的一种或多种另外的试剂。可以以多种方式配制这些组合物，以施用于受试者，或延迟、预防、降低发展，治疗或减少病程的风险。本文所述的组合物还可以配制成用于应用的形式，以使其防止初始病变的转移。在一些实施方式中，将组合物配制用于局部施用，诸如心内施用。局部施用还可以是在移植入受试者之前和/或之后的移植物。mbv可以通过任何途径施用，包括肠胃外施用，例如，静脉内、腹腔、肌内、真皮内、腹膜内、胸骨内或关节内注射或输注，或通过舌下、口服、局部、鼻内或经粘膜施用，或通过肺部吸入。医师可以选择适当的施用途径。可以配制包括mbv的药物组合物以供局部使用和全身使用，还可以配制用于人或兽药。在一些实施方式中，组合物可以通过注射或导管施用。施用可以是静脉内或肌内施用。
[0156]
公开的组合物可以一次或重复施用。公开的组合物可以局部或全身施用。公开的组合物可以通过静脉内注射(诸如滴注、皮下注射)、局部施用或任何其他途径施用，每月一次至几次，诸如每周两次、每周一次、每两周一次或每四周一次。设想了多种治疗，诸如在规定的时间间隔内，诸如每天、每两周、每周、每两月或每月。施用时间表可以通过例如将每周两次或每周一次的施用间隔延长调整至每两周一次、每三周一次或每四周一次。在一些实施方式中，该方法包括在移植后监测器官功能和/或血液测试值的变化。可以在器官移植之前、器官移植时或器官移植后将组合物施用于受试者。每当需要抑制或预防疾病时，可以开始施用，例如，在受试者的某个年龄时，或在接受实体器官移植后。
[0157]
尽管公开的方法和组合物通常将用于治疗人受试者，但是它们还可以用于治疗其他脊椎动物，诸如其他灵长类、犬、猫、马和牛中的相似或相同的疾病。合适的施用方式最好由医生针对每个受试者分别确定。各种药学上可接受的载体及其制剂描述于标准制剂论文中，例如，remington’s pharmaceutical sciences by e.w.martin.see also wang,y.j.and hanson,m.a.,journal of parenteral science and technology,technical report no.10,supp.42:2s,1988。药物组合物的剂型将通过选择的施用方式来确定。在一些实施方式中，受试者是人，并且mbv来自人组织。
[0158]
在一些实施方式中，当局部施用于受累区域或目标组织(诸如心脏移植物)中的细胞中时，公开的组合物促进肌肉细胞增殖和/或减少炎症。
[0159]
当提供mbv(ecm来源的纳米囊泡)作为肠胃外组合物时，例如，对于注射或输注，它们通常悬浮在水性载体中，例如，在约3.0至约8.0的ph，优选在约3.5至约7.4的ph，诸如约7.2至约7.4的等渗缓冲溶液中。有用的缓冲剂包括柠檬酸钠
‑
柠檬酸和磷酸钠
‑
磷酸，以及乙酸钠
‑
乙酸缓冲剂。
[0160]
可以使用某种形式的储存库或“贮库”缓释制剂，以在注射或递送后的多个小时或几天内将治疗有效量的制剂递送到血液中。缓释组合物的合适实例包括合适的聚合物材料
(诸如，例如呈成形制品形式的半渗透性聚合物基质，例如，薄膜或微胶囊)、合适的疏水性材料(诸如，例如，在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，以及微溶的衍生物(诸如，例如，微溶的盐)。缓释制剂可以口服、直肠、肠胃外、腹腔、阴道内、腹膜内、局部(如粉剂、软膏剂、凝胶剂、滴剂或透皮贴剂)、经颊或经口或经鼻喷雾剂施用。药物组合物可以是包括可生物降解的聚合物和/或多糖胶凝和/或生物粘附性聚合物、两亲性聚合物、改变颗粒的界面性质的试剂和药理活性物质的颗粒形式。这些组合物表现出某些生物相容性特征，其允许活性物质的受控释放。见美国专利号5,700,486。
[0161]
在公开的方法中有用的药学上可接受的载体和辅料是常规的。例如，肠胃外制剂通常包括作为药物和生理学可接受的流体溶媒的注射液，诸如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。可以包括的辅料是，例如，蛋白，诸如人血清白蛋白或血浆制品。如有需要，待施用的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或显而易见的。
[0162]
mbv的施用量将取决于所治疗的受试者、患病的严重程度和施用方式，最好由处方医生决定。在这些范围内，待施用的制剂将包含一定量的mbv，其量有效地在被治疗的受试者中实现预期效果。
[0163]
确切的剂量可以由本领域技术人员根据特定部分的效能、受试者的年龄、体重、性别和生理状况容易地确定。合适的浓度包括但不限于约1ng/ml
–
100gr/ml。
[0164]
本文提供的用于治疗有此需要的受试者的方法可以包括使用另外的治疗剂。包含mbv的组合物还可以包含另外的治疗剂。此类另外的治疗剂包括抗血脂药、抗炎药、抗血栓药、纤维蛋白溶解药、抗血小板药、直接凝血酶抑制剂、糖蛋白iib/iiia受体抑制剂、与细胞粘附分子结合并抑制能力的药物附着在此类分子上的白细胞(例如，抗细胞粘附分子抗体)、α
‑
肾上腺素能受体阻断剂、β
‑
肾上腺素能受体阻断剂、环氧合酶
‑
2抑制剂、血管紧张素系统抑制剂、抗心律不齐药、钙通道阻断剂、利尿剂、正性肌力药药物、血管扩张药、血管加压药、噻唑烷二酮、大麻素1受体阻断剂、免疫抑制剂及其任意组合。
[0165]
抗血脂药是降低总胆固醇、降低ldlc、降低甘油三酸酯和/或增加hdlc的药物。抗血脂药包括他汀类、非他汀类抗血脂药及其组合。他汀类药物是一类药物，已显示可有效降低人类总胆固醇、ldlc和甘油三酸酯水平。他汀类药物在胆固醇合成的步骤中起作用。他汀类药物通过抑制hmg
‑
coa还原酶基因来减少细胞合成的胆固醇的量，从而引发一系列事件，最终导致肝脏细胞对ldlc的摄取增加。随着ldlc摄入量的增加，血液中的总胆固醇和ldlc水平会降低。两种因子的血液水平降低均与动脉粥样硬化和心脏病的风险降低有关，他汀类药物被广泛用于降低动脉粥样硬化的发病率和死亡率。
[0166]
他汀类药物的实例包括但不限于辛伐他汀洛伐他汀普伐他汀氟伐他汀阿托伐他汀西立伐他汀瑞舒伐他汀匹伐他汀和许多其他药物，如以下所述：美国专利号4,444,784；美国专利号4,231,938；美国专利号4,346,227；美国专利号4,739,073；美国专利号5,273,995；美国专利号5,622,985；美国专利号5,135,935；美国专利号5,356,896；美国专利号4,920,109；美国专利号5,286,895；美国专利号5,262,435；美国专利号5,260,332；美国专利号5,317,031；美国专利号5,283,256；美国
专利号5,256,689；美国专利号5,182,298；美国专利号5,369,125；美国专利号5,302,604；美国专利号5,166,171；美国专利号5,202,327；美国专利号5,276,021；美国专利号5,196,440；美国专利号5,091,386；美国专利号5,091,378；美国专利号4,904,646；美国专利号5,385,932；美国专利号5,250,435；美国专利号5,132,312；美国专利号5,130,306；美国专利号5,116,870；美国专利号5,112,857,美国专利号5,102,911；美国专利号5,098,931；美国专利号5,081,136；美国专利号5,025,000；美国专利号5,021,453；美国专利号5,017,716；美国专利号5,001,144；美国专利号5,001,128；美国专利号4,997,837；美国专利号4,996,234；美国专利号4,994,494；美国专利号4,992,429；美国专利号4,970,231；美国专利号4,968,693；美国专利号4,963,538；美国专利号4,957,940；美国专利号4,950,675；美国专利号4,946,864；美国专利号4,946,860；美国专利号4,940,800；美国专利号4,940,727；美国专利号4,939,143；美国专利号4,929,620；美国专利号4,923,861；美国专利号4,906,657；美国专利号4,906,624；和美国专利号4,897,402。
[0167]
已获批用于人体的他汀类药物的实例包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和罗舒伐他汀。以下参考资料提供了有关hmg
‑
coa还原酶抑制剂的更多信息：drugs and therapy perspectives(may 12,1997),9:1
‑
6；chong(1997)pharmacotherapy 17:1157
‑
1177；kellick(1997)formulary 32:352；kathawala(1991)medicinal research reviews,11:121
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146；jahng(1995)drugs of the future 20:387
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404,and current opinion in lipidology,(1997),8,362
‑
368.another statin drug of note is compound 3a(s
‑
4522)in watanabe(1997)bioorganic and medicinal chemistry 5:437
‑
444。
[0168]
非他汀类抗血脂药包括但不限于纤维酸衍生物(贝特类)、胆汁酸螯合剂或树脂、烟酸剂、胆固醇吸收抑制剂、酰基辅酶a：胆固醇酰基转移酶(acat)抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(cetp)抑制剂、ldl受体拮抗剂、法呢素x受体(fxr)拮抗剂、固醇调节结合蛋白裂解活化蛋白(scap)活化剂、微粒体甘油三酸酯转移蛋白(mtp)抑制剂、角鲨烯合酶抑制剂和过氧化物酶体增殖活化受体(ppar)激动剂。纤维酸衍生物的实例包括但不限于吉非罗齐非诺贝特氯贝丁酯和苯扎贝特。胆汁酸多价螯合剂或树脂的实例包括但不限于：考来维仑考来烯胺(或)和考来替泊dmd
‑
504、gt
‑
102279、hbs
‑
107和s
‑
8921。烟酸剂的实例包括但不限于烟酸和普罗布考。胆固醇吸收抑制剂的实例包括但不限于依折麦布acat抑制剂的实例包括但不限于阿伐麦布、ci
‑
976(parke davis)、cp
‑
113818(pfizer)、pd
‑
138142
‑
15(parke davis)、ff1394和多种其他实例如以下所述：美国专利号6,204,278；美国专利号6,165,984；美国专利号6,127,403；美国专利号6,063,806；美国专利号6,040,339；美国专利号5,880,147；美国专利号5,621,010；美国专利号5,597,835；美国专利号5,576,335；美国专利号5,321,031；美国专利号5,238,935；美国专利号5,180,717；美国专利号5,149,709和美国专利号5,124,337。cetp抑制剂的实例包括但不限于托彻普(torcetrapib)、cp
‑
529414、ceti
‑
1、jtt
‑
705和多种其他实例如以下所述：美国专利号6,727,277；美国专利号6,723,753；美国专利号6,723,752；美国专利号6,710,089；美国专利号6,699,898；美国专利号6,696,472；美国专利号6,696,435；美国专利号6,683,099；美国专利号6,677,382；美国专利号6,677,380；美国专利号6,677,379；美国专利号6,677,
375；美国专利号6,677,353；美国专利号6,677,341；美国专利号6,605,624；美国专利号6,586,448；美国专利号6,521,607；美国专利号6,482,862；美国专利号6,479,552；美国专利号6,476,075；美国专利号6,476,057；美国专利号6,462,092；美国专利号6,458,852；美国专利号6,458,851；美国专利号6,458,850；美国专利号6,458,849；美国专利号6,458,803；美国专利号6,455,519；美国专利号6,451,830；美国专利号6,451,823；美国专利号6,448,295；美国专利号5,512,548。fxr拮抗剂的一个实例是没药甾酮(guggulsterone)。scap活化剂的一个实例是gw532(glaxosmithkline)。mtp抑制剂的实例包括但不限于英普他派(implitapide)和r
‑
103757。角鲨烯合酶抑制剂的实例包括但不限于马来酸。ppar激动剂的实例包括但不限于gw
‑
409544、gw
‑
501516和ly
‑
510929。
[0169]
抗炎剂包括但不限于阿氯芬酸(alclofenac)、双丙酸阿氯米松(alclometasone dipropionate)、丙缩阿尔孕酮(algestone acetonide)、α
‑
淀粉酶(alpha amylase)、安西法尔(amcinafal)、安西非特(amcinafide)、氨芬酸钠(amfenac sodium)、盐酸氨普立糖(amiprilose hydrochloride)、阿那白滞素(anakinra)、阿尼罗酸(anirolac)、阿尼扎芬(anitrazafen)、阿扎丙宗(apazone)、巴柳氮钠、苄达赖氨酸、苯恶洛芬(benoxaprofen)、盐酸苄达明、菠萝蛋白酶、溴哌莫(broperamole)、布地奈德、卡洛芬(carprofen)、非诺洛芬(cicloprofen)、辛喷他宗(cintazone)、克利洛芬(cliprofen)、丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)、丁酸氯倍他松、氯吡酸(clopirac)、cloticasone propionate、药]醋酸三氟米松(cormethasone acetate)、可托多松(cortodoxone)、地夫可特(deflazacort)、地奈德、去羟米松(desoximetasone)、双丙酸地塞米松(dexamethasone dipropionate)、双氯芬酸钾、双氯芬酸钠、醋酸双氟拉松(diflorasone diacetate)、二氟米酮钠(diflumidone sodium)、二氟尼柳、二氟泼尼酯(difluprednate)、双酞嗪酮(diftalone)、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide)、羟西奈德(drocinonide)、恩甲羟松(endrysone)、恩莫单抗(enlimomab)、依诺利康钠(enolicam sodium)、依匹唑(epirizole)、依托度酸、依托芬那酯、联苯乙酸、苯四唑胺(fenamole)、芬布芬、芬氯酸(fenclofenac)、苯克洛酸(fenclorac)、芬度柳(fendosal)、二酮(fenpipalone)、芬替酸(fentiazac)、氟苯哌酮(flazalone)、氟扎可特(fluazacort)、氟芬那酸(flufenamic acid)、氟咪唑(flumizole)、氟肤轻松(flunisolide acetate)、氟尼辛、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、氟考丁酯(fluocortin butyl)、氟米龙醋酸酯(fluorometholone acetate)、氟喹宗(fluquazone)、氟比洛芬、氟瑞托芬(fluretofen)、丙酸氟替卡松、呋喃洛芬(furaprofen)、furobufen、哈西奈德、卤贝他索丙酸酯(halobetasol propionate)、醋酸卤泼尼松(halopredone acetate)、异丁芬酸(ibufenac)、布洛芬、布洛芬铝(ibuprofen aluminum)、布洛芬吡啶甲醇(ibuprofen piconol)、伊洛达普(ilonidap)、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚美辛钠(indomethacin sodium)、吲哚布洛芬(indoprofen)、双甲氧苯吲哚(indoxole)、吲四唑(intrazole)、醋异氟龙(isoflupredone acetate)、伊索克酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、.酮洛芬、盐酸洛非咪唑(lofemizole hydrochloride)、氯诺昔康(lomoxicam)、氯替泼诺、甲氯胺苯酸钠(meclofenamate sodium)、甲氯胺苯甲酸(meclofenamic acid)、甲氯松二丁酯(meclorisone dibutyrate)、甲芬那酸、美沙拉嗪(mesalamine)、美西拉宗(meseclazone)、磺庚甲泼尼龙(methylprednisolone suleptanate)、氟烟吗酯(morniflumate)、萘丁美酮、萘普生、萘普生钠、奈普醇
(naproxol)、尼马宗(nimazone)、奥沙拉秦钠、奥古蛋白(orgotein)、奥帕诺辛(orpanoxin)、奥沙普秦、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、paranyline hydrochloride、木聚硫钠(pentosan polysulfate sodium)、保泰松甘油酸钠(phenbutazone sodium glycerate)、.吡非尼酮、吡罗昔康、肉桂酸吡罗昔康(piroxicam cinnamate)、吡罗昔康乙醇胺(piroxicam olamine)、吡洛芬(pirprofen)、泼那扎特(prednazate)、普立非酮(prifelone)、丙哚乙酸(prodolic acid)、普罗喹宗(proquazone)、普罗沙唑(proxazole)、枸橼酸普罗沙唑(proxazole citrate)、利美索龙(rimexolone)、氯马扎利(romazarit)、柳胆来司(salcolex)、沙那西丁(salnacedin)、双水杨酯、salycilates、血根氯铵(sanguinarium chloride)、塞克那唑(seclazone)、丝美辛(sermetacin)、舒多昔康(sudoxicam)、舒林酸、舒洛芬(suprofen)、安他美辛(talmetacin)、他尼氟酯(talniflumate)、他洛沙酯(talosalate)、特丁非隆(tebufelone)、替尼达帕(tenidap)、替尼达普钠(tenidap sodium)、替诺昔康(tenoxicam)、替昔康(tesicam)、替昔米德(tesimide)、四氢甲吲胺(tetrydamine)、硫平酸(tiopinac)、氢可的松(tixocortol pivalate)、托美丁、托美丁钠、三氯氟松(triclonide)、三氟氨酯(triflumidate)、齐多美辛(zidometacin)、糖皮质激素(glucocorticoids)和佐美酸钠(zomepirac sodium)。
[0170]
抗血栓形成剂和/或纤溶剂包括但不限于组织纤溶酶原活化剂(例如，)(催化失活的纤溶酶原转化为纤溶酶)。这可能是通过以下物质的相互作用而发生：前激肽释放酶，激肽原，因子xii、xiiia，纤溶酶原活化剂和组织纤溶酶原活化剂tpa)、链激酶、尿激酶、异构化的纤溶酶原
‑
链激酶活化剂复合物、尿激酶原(rpro
‑
uk)、rtpar表示重组)、尿活素(abbokinase)、阿尼普酶(eminase)、sreptase anagrelide hydrochloride、比伐芦定、达肝素钠、达那肝素钠(danaparoid sodium)、盐酸布那唑嗪(dazoxiben hydrochloride)、硫酸依非加群(efegatran sulfate)、依诺肝素钠、伊非曲班(ifetroban)、伊非曲班钠(ifetroban sodium)、肝素钠(tinzaparin sodium)、瑞替普酶(retaplase)、三苯格雷(trifenagrel)、华法林、右旋糖苷(dextrans)、氨基己酸和氨甲环酸
[0171]
抗血小板药包括但不限于氯吡格雷、磺吡酮(sulfinpyrazone)、阿司匹林、双嘧达莫、氯贝丁酯、盐酸吡硫醇、pge、高血糖素、抗血清素药物、咖啡因、茶碱、己酮可可碱、噻氯匹定和阿那格雷。直接凝血酶抑制剂包括但不限于水蛭素(hirudin)、hirugen、水蛭肽(hirulog)、阿加曲班(agatroban)、ppack和凝血酶适体。糖蛋白iib/iiia受体抑制剂既是抗体又是非抗体，包括但不限于(abcixamab)、拉米非班和替罗非班。结合细胞粘附分子并抑制白细胞附着于此类分子的能力的试剂包括多肽试剂。此类多肽包括根据常规方法制备的多克隆和单克隆抗体。这样的抗体在本领域中已经是已知的，并且包括抗icam 1抗体以及其他这样的抗体。
[0172]
α
‑
肾上腺素能阻断剂的实例包括但不限于：多沙唑星(doxazocin)、吡唑星(prazocin)、坦索罗辛和他拉唑嗪(tarazosin)。β
‑
肾上腺素能受体阻断剂是一类可拮抗儿茶酚胺在心绞痛、高血压和心律不齐中的心血管作用的药物。β
‑
肾上腺素受体阻断剂包括但不限于阿替洛尔、醋丁洛尔、阿普洛尔、苯呋洛尔、盐酸倍他洛尔、布尼洛尔(bunitrolol)、盐酸卡替洛尔、盐酸塞利洛尔、hydroxalol、茚诺洛尔(indenolol)、盐酸拉贝洛尔、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(methypranol)、吲
哚美辛(metindol)、酒石酸美托洛尔、metrizoranolol、氧烯洛尔、吲哚洛尔、盐酸普萘洛尔、醋氨心安(practolol)、醋氨心安、纳多洛尔(sotalolnadolol)、替普洛尔(tiprenolol)、tomalolol、马来酸噻吗洛尔、布拉洛尔(bupranolol)、喷布洛尔(penbutolol)、三甲苯心安(trimepranol)、2
‑
(3
‑
(1,1
‑
二甲基乙基)
‑
氨基
‑2‑
羟基丙氧基)
‑3‑
吡啶碳腈hcl、1
‑
丁基氨基
‑3‑
(2,5
‑
二氯苯氧基)
‑2‑
丙醇、1
‑
异丙基氨基
‑3‑
(4
‑
(2
‑
(环丙基甲氧基乙基)苯氧基)
‑2‑
丙醇、3
‑
异丙基氨基
‑1‑
(7
‑
甲基茚满
‑4‑
基氧基)
‑2‑
丁醇、2
‑
(3
‑
叔丁基氨基
‑2‑
羟基
‑
丙硫基)
‑4‑
(5
‑
氨基甲酰基
‑2‑
噻吩基)噻唑、7
‑
(2
‑
羟基
‑3‑
叔丁基氨基丙氧基)邻苯二甲酸酯。以上鉴定的化合物可以以异构体混合物形式使用，或以其各自的左旋或右旋形式使用。
[0173]
选择性cox
‑
2抑制剂是本领域已知的并且可以被利用。这些包括但不限于，如下所述的f cox
‑
2抑制剂：美国专利号5,521,213；美国专利号5,536,752；美国专利号5,550,142；美国专利号5,552,422；美国专利号5,604,253；美国专利号5,604,260；美国专利号5,639,780；美国专利号5,677,318；美国专利号5,691,374；美国专利号5,698,584；美国专利号5,710,140美国专利号5,733,909；美国专利号5,789,413；美国专利号5,817,700；美国专利号5,849,943；美国专利号5,861,419；美国专利号5,922,742；美国专利号5,925,631；和美国专利号5,643,933。许多以上确定的cox
‑
2抑制剂是选择性cox
‑
2抑制剂的前药，并通过体内转化为活性和选择性cox
‑
2抑制剂发挥其作用。由上述cox
‑
2抑制剂前药形成的活性和选择性cox
‑
2抑制剂在pct公开号wo95/00501、pct公开号wo 95/18799和美国专利no.5,474,995中进行描述。
[0174]
血管紧张素系统抑制剂是干扰血管紧张素ii的功能、合成或分解代谢的试剂。这些试剂包括但不限于血管紧张素转换酶(ace)抑制剂、血管紧张素ii拮抗剂、血管紧张素ii受体拮抗剂、活化血管紧张素ii分解代谢的药物以及阻止合成血管紧张素i的药物，血管紧张素ii可从中合成最终得出。这种化合物的种类的实例包括抗体(例如，抗肾素)、氨基酸及其类似物(包括与较大分子偶联的那些)、肽(包括血管紧张素和血管紧张素i的肽类似物)、肾素原相关的类似物等。最有效和最有用的肾素
‑
血管紧张素系统抑制剂是肾素抑制剂、acei抑制剂和血管紧张素ii拮抗剂。
[0175]
血管紧张素ii拮抗剂是通过与血管紧张素ii受体结合并干扰其活性来干扰血管紧张素ii的活性的化合物。血管紧张素ii拮抗剂是熟知的，包括肽化合物和非肽化合物。大多数血管紧张素ii拮抗剂是经过轻微修饰的同类物，其中激动剂活性通过用其他一些氨基酸替代第8位的苯丙氨酸来减弱。可以通过减慢体内变性的其他替代品来增强稳定性。血管紧张素ii受体拮抗剂的实例包括但不限于：坎地沙坦(alacand)、(avapro)、氯沙坦替米沙坦和缬沙坦血管紧张素ii拮抗剂的其他实例包括：肽类化合物(例如，沙拉新(saralasin)、[(sar1)(val5)(ala8)]血管紧张素
‑
(1
‑
8)八肽及相关类似物)；n
‑
取代的咪唑
‑2‑
酮(美国专利号5,087,634)；咪唑乙酸酯衍生物，包括2
‑
n
‑
丁基
‑4‑
氯
‑1‑
(2
‑
氯苯并)咪唑
‑5‑
乙酸(见long et al.,j.pharmacol.exp.ther.247(1),1
‑
7(1988))；4,5,6,7
‑
四氢
‑
1h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
羧酸及其类似物衍生物(美国专利号4,816,463)；n2
‑
四唑β
‑
葡糖醛酸苷类似物(美国专利号5,085,992)；取代的吡咯、吡唑和三唑(美国专利5,081,127)；苯酚和杂环衍生物，诸如1,3
‑
咪唑(美国专利5,073,566)；咪唑并稠合的7元环杂环(美国专利号5,064,825)；肽(例
如，美国专利号4,772,684)；抗血管紧张素ii的抗体(例如美国专利号4,302,386)；芳烷基咪唑化合物，例如联苯甲基取代的咪唑(例如，1988年1月20日公开的ep号253,310)；es8891(n
‑
吗啉代乙酰基
‑
(
‑1‑
萘基)
‑
l
‑
丙氨酰
‑
(4,噻唑基)
‑
l
‑
丙氨酰(35,45)
‑4‑
氨基
‑3‑
羟基
‑5‑
环
‑
六戊酰基
‑
n
‑
己酰胺(sankyo company，ltd.，日本东京)；skf108566(e
‑
α
‑2‑
[2
‑
丁基
‑1‑
(羧基苯基)甲基]1h
‑
咪唑
‑5‑
基[甲基]
‑2‑
噻吩丙酸(smith kline beecham pharmaceuticals，pa)；(dup753/mk954，dupont merck pharmaceutical company)；remikirin(ro42
‑
5892，f.hoffman laroche ag)；a2激动剂(marion merrill dow)和某些非肽杂环(g.d.searle and company)。
[0176]
血管紧张素转化酶(ace)是一种催化血管紧张素i转化为血管紧张素ii的酶。ace抑制剂包括氨基酸及其衍生物，包括二肽和三肽的肽以及抗ace的抗体，它们通过抑制ace的活性而介入肾素
‑
血管紧张素系统，从而减少或消除了升压物质血管紧张素ii的形成。ace抑制剂已在医学上用于治疗高血压、充血性心力衰竭、心肌梗塞和肾脏疾病。已知可用作ace抑制剂的化合物类别包括酰基巯基和巯基烷酰基脯氨酸，诸如卡托普利(美国专利4,105,776)和佐芬普利(美国专利4,316,906)；羧烷基二肽，诸如依那普利(美国专利4,374,829)、赖诺普利(美国专利4,374,829)、喹那普利(美国专利4,344,949)、雷米普利(美国专利4,587,258)和培哚普利(美国专利4,508,729)；羧烷基二肽模拟物，诸如西拉普利(美国专利号4,512,924)和苯那普利(美国专利号4,410,520)；次膦酰基链烷酰基脯氨酸，诸如福辛普利(美国专利号4,337,201)和trandolopril。
[0177]
肾素抑制剂是干扰肾素活性的化合物。肾素抑制剂包括氨基酸及其衍生物、肽及其衍生物以及抗肾素的抗体。作为美国专利主题的肾素抑制剂的实例如下：肽的脲衍生物(美国专利号5,116,835)；通过非肽键连接的氨基酸(美国专利号5114937)；二肽和三肽衍生物(美国专利号5106835)；氨基酸及其衍生物(美国专利号5,104,869和5,095,119)；二醇磺酰胺和亚磺酰基(美国专利号5,098,924)；修饰的肽(美国专利号5,095,006)；肽基β
‑
氨基酰基氨基二醇氨基甲酸酯(美国专利号5,089,471)；吡咯并咪唑酮(美国专利号5,075,451)；氟和氯他汀或含他酮的肽(美国专利号5,066,643)；肽基氨基二醇(美国专利号5,063,208和4,845,079)；n
‑
吗啉代衍生物(美国专利号5,055,466)；胃抑素衍生物(美国专利号4,980,283)；n
‑
杂环醇(美国专利号4885292)；肾素单克隆抗体(美国专利号4,780,401)；以及各种其他肽及其类似物(美国专利5,071,837；美国专利5,064,965；美国专利5,063,207；美国专利5,036,054；美国专利美国专利号5,036,053 5,034,512和4,894,437)。
[0178]
钙通道阻断剂是一类化学上多样化的化合物，在控制多种疾病(包括几种心血管疾病，诸如高血压、心绞痛和心律不齐)方面具有重要的治疗价值(fleckenstein,cir.res.v.52,(suppl.1),p.13
‑
16(1983)；fleckenstein,experimental facts and therapeutic prospects,john wiley,new york(1983)；mccall,d.,curr pract cardiol,v.10,p.1
‑
11(1985))。钙通道阻断剂是一组异源药物，它们通过调节细胞钙通道来阻止或减缓钙进入细胞(remington,the science and practice of pharmacy,nineteenth edition,mack publishing company,eaton,pa.,p.963(1995))。目前可用的大多数钙通道阻断剂，并根据本发明是有用的，属于药物的三个主要化学组之一：二氢吡啶类，诸如硝苯地平；苯基烷基胺类，诸如维拉帕米；和苯并硫氮杂类，诸如地尔硫卓。根据本发明有用的其他钙通道阻断剂包括但不限于aminone、氨氯地平、苄环烷、非洛地平、芬地林、氟桂利嗪、伊
拉地平、尼卡地平、尼莫地平、perhexylene、加洛帕米、硫帕米和tiapamil类似物(诸如1993ro
‑
11
‑
2933)、phenyloin、巴比妥酸盐和肽强啡肽、ω
‑
芋螺毒素和ω
‑
藻毒素及其类似物和/或其药学上可接受的盐。
[0179]
利尿剂包括但不限于：碳酸酐酶抑制剂、袢利尿药、保钾利尿剂、噻嗪类和相关利尿剂。血管舒张剂包括但不限于冠状血管舒张剂和外周血管舒张剂。血管加压药是产生血管收缩和/或血压升高的药物。血管收缩剂包括但不限于：多巴胺、麻黄碱、肾上腺素、盐酸甲氧明去氧肾上腺素、盐酸去氧肾上腺素(neo
‑
)和间氨基。噻唑烷二酮包括但不限于：罗格列酮吡格列酮曲格列酮(rezulin)。这些中的任何一种均可以用于公开的方法和组合物中。
[0180]
免疫抑制剂包括但不限于类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗增殖剂、生物制剂和单克隆或多克隆抗体。生物制剂包括但不限于重组或合成的肽和蛋白，以及合成形式的核酸。类固醇可以是皮质类固醇。皮质类固醇的实例包括但不限于泼尼松、氢化可的松和甲基泼尼松。钙调神经磷酸酶抑制剂的实例包括但不限于他克莫司、fk506、envarsusastagraf和环孢素和环孢素和单克隆抗体的实例包括但不限于抗cd3抗体(muromonab
‑
cd3、okt3)、维西珠单抗抗cd52(altemtuzumab(
‑
1h))、抗cd25(巴利昔单抗)、抗cd20(利妥昔单抗奥滨尤妥珠单抗奥瑞珠单抗)、抗补体蛋白(依库丽单抗)、抗共刺激分子(布来鲁单抗，)和抗细胞因子或细胞因子受体(托珠单抗乌司奴单抗卡那单抗库奇尤单抗司妥昔单抗布罗利尤单抗依奇珠单抗sarilumab古塞奇尤单抗和替拉珠单抗多克隆抗体的例子包括但不限于抗胸腺细胞球蛋白马和抗胸腺细胞球蛋白
‑
兔(ratg胸腺球蛋白)、多克隆人igg免疫球蛋白(ivig、)。生物蛋白的实例包括但不限于可溶性ctla
‑4‑
igc1
‑
酯酶抑制剂(c1
‑
inh、)、il
‑
1或il
‑
1r拮抗剂(anakinra利纳西普和化脓性链球菌(ides)的igg降解酶。抗增殖药或抗代谢药包括但不限于麦考酚酯、麦考酚酸钠、硫唑嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、西罗莫司依维莫司其他免疫抑制剂包括但不限于柳氮磺胺吡啶、氮杂嘧啶、甲氧沙林和沙利度胺。这些中的任何一种均可以用于所公开的组合物和方法中。在一些实施方式中，免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、抗增殖剂、mtor抑制剂和/或类固醇。在特定的非限制性实例中，钙调神经磷酸酶抑制剂是他克莫司或环孢素；其中抗增殖剂是麦考酚酯；mtor抑制剂是西罗莫司，和/或类固醇是泼尼松、氢化可的松或可的松。
[0181]
提供的方法还可以包括使用其他疗法，例如饮食和/或运动。在一些实施方式中，
这些疗法是使用mbv进行治疗的补充。如本文所用，“共同施用”是指单一组合物以混合物的形式同时施用两种或更多种治疗剂(例如，mbv和第二治疗剂)，或序贯施用，并且在一些实施方式中，时间足够接近，以便化合物可以发挥加和甚至协同作用。在其他实施方式中，治疗剂并行施用。在其他实施方式中，在另一种治疗剂之前或之后施用一种治疗剂。
[0182]
待施用的mbv的剂量具有治疗有效性，并且取决于许多因素，包括施用途径，并且可以由熟练的临床医生确定。在一些实施方式中，mbv的浓度为每ml约1
×
105至约1
×
10
12
，诸如每ml约1
×
106至约1
×
10
11
、每ml约1
×
107至约1
×
10
11
、或每ml约1
×
108至约1
×
10
10
。在一些非限制性实例中，局部施用，提供每ml约1
×
108至约1
×
10
10
的剂量，诸如每ml约1
×
108、每ml约5
×
108、每ml约1
×
109、每ml约5
×
109或每ml约1
×
10
10
。在局部施用时，体积为用于该部位的合适体积。示例性的非限制性体积是进入玻璃体0.1ml。当扩散到移植物表面时为1.0ml，注入3cm长的皮肤切口边缘时为1.5ml；当注入中风腔时，整个腔约为1.40mm3。本领域技术人员可以很容易地为一个位置确定合适的体积。通常，该体积对于治疗具有有效性，并且不会引起目标部位损伤。
[0183]
通常，活性化合物或试剂的剂量可以为每天约0.01mg/kg至每天1000mg/kg。预期1
‑
5mg/kg、5
‑
50mg/kg或50
‑
100mg/kg的剂量可以适合于口服施用，并且每天施用一次或几次。较低的剂量将由其他形式的施用产生，诸如静脉内施用。在人受试者在应用初始剂量时反应不足的情况下，可以在患者耐受性允许的范围内采用更高的剂量(或通过不同的、更局部的递送途径有效地更高的剂量)。预期每天多剂量以达到适当的全身性化合物水平。
[0184]
当施用时，药物制剂以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物的形式施用。这样的制剂可以常规地包含盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选地其他治疗剂。当在药物中使用时，这些盐应该是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐，并且不排除在本发明的范围之外。此类药理和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。同样，可将药学上可接受的盐制备为碱金属或碱土金属盐，诸如钠盐、钾盐或钙盐。参见美国公开申请号2008/0003199，在疾病和病症的治疗和诊断中的il
‑
33，通过引用结合入本文。
[0185]
增加成肌细胞分化的方法
[0186]
还公开了增加成肌细胞分化的方法。这些方法包括将成肌细胞与有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡接触，其中纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
。成肌细胞可以是体内或体外的。
[0187]
肌细胞形成，肌肉细胞确定、分化和融合成多核合胞体的过程，对于正常肌肉发育和受伤后的组织再生至关重要。
[0188]
在一些实施方式中，旨在限制梗塞后心脏功能障碍的后果的治疗包括将细胞(肌细胞或干细胞)移植到受损的左心室中。移植的细胞通过参与心脏收缩来增加心室射血分数。心肌内移植需要大量潜在的收缩细胞。因此，公开的方法可以扩展适合用作心肌或骨骼肌移植物的细胞群。
[0189]
示例性实施方式
[0190]
第1项.一种用于治疗或抑制患有病症或具有患病症风险的受试者的方法，包括：
选择患有病症或具有患病症风险的受试者，和向受试者施用治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，从而治疗或抑制受试者的病症，其中，所述病症是a)器官或组织纤维化；b)实体器官移植排斥；或c)非心肌梗塞或心肌缺血的心脏病。
[0191]
第2项.如第1项所述的方法，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0192]
第3项.如第2项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0193]
第4项.如第1
‑
3中任一项所述的方法，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0194]
第5项.如第1
‑
4项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0195]
第6项.如第1
‑
5项中任一项所述的方法，其中，所述病症是实体器官移植排斥，并且其中，所述受试者是移植的实体器官的接受体。
[0196]
第7项.如第6项所述的方法，其中，将所述纳米囊泡施用于移植的实体器官。
[0197]
第8项.如第7项所述的方法，其中，所述移植的实体器官是心脏。
[0198]
第9项.如第1
‑
5项中任一项所述的方法，其中，所述病症是心脏病。
[0199]
第10项.如第1
‑
5项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病是心力衰竭或心脏缺血。
[0200]
第11项.如第1
‑
5项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病包括急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、缺血
‑
再灌注损伤、跛行、血管闭塞、动脉硬化、心力衰竭、慢性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化、主动脉瓣疾病、主动脉或二尖瓣狭窄、心肌病、房颤、心律不齐和心包疾病
[0201]
第12项.如第1
‑
11项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡经静脉内施用。
[0202]
第13项.如第1
‑
5项中任一项所述的方法，其中，所述病症是器官或组织纤维化。
[0203]
第14项.如第13项所述的方法，其中，所述纤维化是肝硬化、肺纤维化、心脏纤维化、纵隔纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、肾源性系统性纤维化、瘢痕纤维化、硬皮病纤维化、肾纤维化、淋巴组织纤维化、动脉纤维化、毛细血管纤维化、血管纤维化或胰腺纤维化。
[0204]
第15项.如第14项所述的方法，其中，所述纤维化是肺纤维化。
[0205]
第16项.如第14项所述的方法，其中，所述纤维化是心脏纤维化。
[0206]
第17项.如第16项所述的方法，其中，所述心脏纤维化由以下引起：
[0207]
a)肥厚型心肌病、结节病、慢性肾功能不全、中毒性心肌病、缺血
‑
再灌注损伤、急性器官排斥、慢性器官排斥、衰老、慢性高血压、非缺血性扩张型心肌病、心律不齐、动脉粥样硬化、hiv相关的慢性血管疾病和肺动脉高压；或
[0208]
b)心肌梗塞或心肌缺血。
[0209]
第18项.如第15项所述的方法，其中，所述纳米囊泡通过吸入施用于患者。
[0210]
第19项.如第1
‑
16项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡每周、每月两次或每月向受试者施用。
[0211]
第20项.如第1
‑
19项中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
[0212]
第21项.如第20项所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是免疫抑制剂。
[0213]
第22项.如第21项所述的方法，其中，所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、抗增殖剂、mtor抑制剂和/或类固醇。
[0214]
第23项.如第22项所述的方法，其中，所述钙调神经磷酸酶抑制剂是他克莫司或环孢素；其中，所述抗增殖剂是麦考酚酯；其中，所述mtor抑制剂是西罗莫司，和/或其中，所述类固醇是泼尼松、氢化可的松或可的松。
[0215]
第24项.如第1
‑
23项中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
[0216]
第25项.一种用于治疗或抑制患有病症或具有患病症风险的受试者的病症的方法，包括：选择患有病症或具有患病症风险的受试者，和向受试者施用治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，从而治疗或抑制受试者的病症，其中，所述病症是器官或组织纤维化。
[0217]
第26项.如第25项所述的方法，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0218]
第27项.如第26项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0219]
第28项.如第25
‑
27项中任一项所述的方法，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0220]
第29项.如第25
‑
28项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0221]
第30项.如第25
‑
29项中任一项所述的方法，其中，所述纤维化是肝硬化、肺纤维化、心脏纤维化、纵隔纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、肾源性系统性纤维化、瘢痕纤维化、硬皮病纤维化、肾纤维化、淋巴组织纤维化、动脉纤维化、毛细血管纤维化、血管纤维化或胰腺纤维化。
[0222]
第31项.如第30项所述的方法，其中，所述纤维化是肺纤维化。
[0223]
第32项.如第30项所述的方法，其中，所述纤维化是心脏纤维化。
[0224]
第33项.如第32项所述的方法，其中，所述心脏纤维化由以下引起：
[0225]
a)肥厚型心肌病、结节病、慢性肾功能不全、中毒性心肌病、缺血
‑
再灌注损伤、急性器官排斥、慢性器官排斥、衰老、慢性高血压、非缺血性扩张型心肌病、心律不齐、动脉粥样硬化、hiv相关的慢性血管疾病和肺动脉高压；或
[0226]
b)心肌梗塞或心肌缺血。
[0227]
第33.1项.如第33项所述的方法，其中，所述心脏纤维化由急性器官排斥引起。
[0228]
第33.2项.如第33项所述的方法，其中，所述心脏纤维化由慢性器官排斥引起。
[0229]
第34项.如第25
‑
33.2项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡通过吸入或静脉内施用于患者。
[0230]
第35项.如第25
‑
33.2项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡每周、每月两次或每月向受试者施用。
[0231]
第36项.如第25
‑
35项中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
[0232]
第37项.如第36项所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是免疫抑制剂。
[0233]
第38项.如第37项所述的方法，其中，所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、
抗增殖剂、mtor抑制剂和/或类固醇。
[0234]
第39项.如第38项所述的方法，其中，所述钙调神经磷酸酶抑制剂是他克莫司或环孢素；其中，所述抗增殖剂是麦考酚酯；其中，所述mtor抑制剂是西罗莫司，和/或其中，所述类固醇是泼尼松、氢化可的松或可的松。
[0235]
第40项.如第25
‑
39项中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
[0236]
第41项.一种用于治疗或抑制患有病症或具有患病症风险的受试者的方法，包括：选择患有病症或具有患病症风险的受试者，和向受试者施用治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，从而治疗或抑制受试者的病症，其中，所述病症是实体器官移植排斥。
[0237]
第42项.如第41项所述的方法，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0238]
第43项.如第42项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0239]
第44项.如第41
‑
43项中任一项所述的方法，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0240]
第45项.如第41
‑
43项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0241]
第46项.如第41
‑
45项中任一项所述的方法，其中，将所述纳米囊泡施用于移植的实体器官。
[0242]
第47项.如第46项所述的方法，其中，所述移植的实体器官是心脏。
[0243]
第47.1项.如第46项所述的方法，其中，所述移植的实体器官是肺、肾或肝。
[0244]
第48项.如第41
‑
47.1项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡经静脉内施用。
[0245]
第49项.如第41
‑
46和47.1项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡通过吸入施用于患者。
[0246]
第50项.如第41
‑
49项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡每周、每月两次或每月向受试者施用。
[0247]
第51项.如第41
‑
50项中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
[0248]
第52项.如第51项所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是免疫抑制剂。
[0249]
第53项.如第52项所述的方法，其中，所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、抗增殖剂、mtor抑制剂和/或类固醇。
[0250]
第54项.如第53项所述的方法，其中，所述钙调神经磷酸酶抑制剂是他克莫司或环孢素；其中，所述抗增殖剂是麦考酚酯；其中，所述mtor抑制剂是西罗莫司，和/或其中，所述类固醇是泼尼松、氢化可的松或可的松。
[0251]
第55项.如第41
‑
54项中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
[0252]
第55.1项.如第41
‑
55项中任一项所述的方法，其中，所述实体器官移植排斥是急性排斥。
[0253]
第55.2项.如第41
‑
55项中任一项所述的方法，其中，所述实体器官移植排斥是慢性排斥。
[0254]
第56项.一种用于治疗或抑制患有病症或具有患病症风险的受试者的方法，包括：
选择患有病症或具有患病症风险的受试者，和向受试者施用治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，从而治疗或抑制受试者的病症，其中，所述病症是非心肌梗塞或心肌缺血的心脏病。
[0255]
第57项.如第56项所述的方法，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0256]
第58项.如第57项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0257]
第59项.如第56
‑
58项中任一项所述的方法，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0258]
第60项.如第55
‑
58项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0259]
第61项.如第56
‑
60项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病是心力衰竭或心脏缺血。
[0260]
第62项.如第56
‑
60项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病包括急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、缺血
‑
再灌注损伤、跛行、血管闭塞、动脉硬化、心力衰竭、慢性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化、主动脉瓣疾病、主动脉或二尖瓣狭窄、心肌病、房颤、心律不齐和心包疾病。
[0261]
第63项.如第55
‑
62项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡经静脉内施用。
[0262]
第64项.如第55
‑
62项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡每周、每月两次(bimonthly)或每月向受试者施用。
[0263]
第65项.如第55
‑
64项中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
[0264]
第66项.如第55
‑
65项中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
[0265]
第66.1项.如第55
‑
66项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病是心力衰竭。
[0266]
第66.2项.如第55
‑
66项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病是心肌病。
[0267]
第66.3项.如第55
‑
66项中任一项所述的方法，其中，所述心脏病是缺陷
‑
再灌注损伤。
[0268]
第67项.一种用于治疗或抑制受试者的病症的组合物，其中，所述组合物包括治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，并且其中，所述病症是a)器官或组织纤维化；b)实体器官移植排斥；或c)非心肌梗塞的心脏病。
[0269]
第68项.如第67项所述的组合物，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0270]
第69项.如第67项所述的组合物，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0271]
第70项.如第67
‑
69项中任一项所述的组合物，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0272]
第71项.如第67
‑
70项中任一项所述的组合物，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0273]
第72项.如第67
‑
71项中任一项所述的组合物，其中，所述病症是实体器官移植排斥，并且其中，所述受试者是移植的实体器官的接受体。
[0274]
第73项.第70项所述的组合物，其中，所述纳米囊泡被配制用于施用于移植的实体器官。
[0275]
第74项.第73项所述的组合物，其中，所述移植的实体器官是心脏。
[0276]
第75项.如第65
‑
71项中任一项所述的组合物，其中，所述病症是心脏病。
[0277]
第76项.第75项所述的组合物，其中，所述心脏病是心力衰竭或心脏缺血。
[0278]
第77项.第75项所述的组合物，其中，所述心脏病包括急性冠状动脉综合征、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、血管成形术、短暂性脑缺血发作、缺血
‑
再灌注损伤、跛行、血管闭塞、动脉硬化、心力衰竭、慢性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化、主动脉瓣疾病、主动脉或二尖瓣狭窄、心肌病、房颤、心律不齐和心包疾病
[0279]
第78项.第67
‑
77项中任一项所述的组合物，其中，所述纳米囊泡被配制用于静脉内施用。
[0280]
第79项.第67
‑
71项中任一项所述的组合物，其中，所述病症是器官或组织纤维化。
[0281]
第80项.第79项所述的组合物，其中，所述纤维化是肝硬化、肺纤维化、心脏纤维化、纵隔纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、肾源性系统性纤维化、瘢痕纤维化、硬皮病纤维化、肾纤维化、淋巴组织纤维化、动脉纤维化、毛细血管纤维化、血管纤维化或胰腺纤维化。
[0282]
第81项.如第80项所述的方法，其中，所述纤维化是肺纤维化。
[0283]
第82项.如第80项所述的方法，其中，所述纤维化是心脏纤维化。
[0284]
第83项.如第82项所述的方法，其中，所述心脏纤维化由以下引起：
[0285]
a)肥厚型心肌病、结节病、慢性肾功能不全、中毒性心肌病、缺血
‑
再灌注损伤、急性器官排斥、慢性器官排斥、衰老、慢性高血压、非缺血性扩张型心肌病、心律不齐、动脉粥样硬化、hiv相关的慢性血管疾病和肺动脉高压；或
[0286]
b)心肌梗塞或心肌缺血。
[0287]
第83项.如第67
‑
81项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡通过吸入施用于患者。
[0288]
第84项.如第67
‑
83项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡每周、每月两次或每月向受试者施用。
[0289]
第85项.如第67
‑
84项中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
[0290]
第86项.如第85项所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是免疫抑制剂。
[0291]
第87项.如第86项所述的方法，其中，所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、抗增殖剂、mtor抑制剂和/或类固醇。
[0292]
第88项.如第87项所述的方法，其中，所述钙调神经磷酸酶抑制剂是他克莫司或环孢素；其中，所述抗增殖剂是麦考酚酯；其中，所述mtor抑制剂是西罗莫司，和/或其中，所述类固醇是泼尼松、氢化可的松或可的松。
[0293]
第89项.如第67
‑
88项中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
[0294]
第90项.一种增加成肌细胞分化的方法，包括：
[0295]
将成肌细胞与有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡接触，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，
[0296]
从而增加成肌细胞分化。
[0297]
第91项.如第90项所述的方法，其中，所述成肌细胞是体外成肌细胞。
[0298]
第92项.如第90项或第91项所述的方法，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0299]
第93项.如第92项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0300]
第94项.如第90
‑
93项中任一项所述的方法，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0301]
第95项.如第90
‑
94项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0302]
第96项.如第90
‑
95项中任一项所述的方法，其中，所述成肌细胞在哺乳动物受试者中。
[0303]
第97项.如第96项所述的方法，其中，所述哺乳动物受试者是人。
[0304]
第98项.一种用于治疗或抑制患有病症或具有患病症风险的受试者的方法，包括：选择患有病症或具有患病症风险的受试者，和向受试者施用治疗有效量的源自细胞外基质的分离的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡包含白介素(il)
‑
33并包括赖氨酰氧化酶，并且其中，所述纳米囊泡a)不表达cd63或cd81，或b)是cd63
lo
cd81
lo
，从而治疗或抑制受试者的病症，其中，所述病症是心肌梗塞或心肌缺血。
[0305]
第99项.如第98项所述的方法，其中，所述细胞外基质是哺乳动物细胞外基质。
[0306]
第100项.如第99项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞外基质是人细胞外基质。
[0307]
第101项.如第98
‑
100项中任一项所述的方法，其中，所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。
[0308]
第102项.如第98
‑
101项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡包括mir
‑
145和/或mir
‑
181。
[0309]
第103项.如第98
‑
102项中任一项所述的方法，其中，所述病症是心肌缺血。
[0310]
第104项.如第98
‑
102项中任一项所述的方法，其中，所述病症是心肌梗塞。
[0311]
第105项.如第98
‑
104项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡经静脉内施用。
[0312]
第106项.如第98
‑
105项中任一项所述的方法，其中，所述纳米囊泡每周、每月两次或每月向受试者施用。
[0313]
第107项.如第98
‑
106项中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
[0314]
第108项.如第98
‑
107项中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
[0315]
通过以下非限制性实施例对本公开进行说明。
[0316]
实施例
[0317]
受损的心肌细胞被成纤维细胞和相关的过量细胞外基质(ecm)替代后，心肌缺血会导致纤维化，从而导致心肌僵硬和心力衰竭。纤维化还导致慢性心脏移植排斥，这导致移植后(tx)11年之内移植物损失>50％。尚无可用的治疗方法来预防或逆转心脏损伤后的纤维化。
[0318]
免疫抑制剂对导致同种异体移植纤维化的致病性重塑过程无效。il
‑
33是一种il
‑
1家族成员，通常存在于基质细胞核中，通常被认为是警报蛋白，或自组织分子，在组织损伤
后释放，以通过il
‑
33受体(st2)活化免疫细胞。新证据表明，il33通过刺激st2+调节性t细胞(treg)促进心血管和骨骼肌的修复。但是，先前描述的使用il
‑
33促进组织修复的方法仅依赖于可溶性il
‑
33细胞因子的使用，考虑到大量表达st2的细胞，这可能会产生脱靶效应。仍亟需用于递送il
‑
33的新方法，以及用于其中il
‑
33起作用的多种病症的新治疗方法，诸如但不限于心脏病。
[0319]
ecm支架已获得fda批准，可用于多种临床应用，包括心脏修复。尽管目前正在进行一项有关研究在心肌梗塞后使用心内注射ecm水凝胶的i期研究，但仅部分了解ecm指导心脏组织重塑的机制。本文公开了嵌入ecm支架内的基质结合的纳米囊泡(mbv)是核外白介素33(il
‑
33)的丰富来源。bil
‑
33通常在基质细胞核中发现，通常被视为警报蛋白，以提醒免疫系统细胞损伤，从而导致产生涉及il
‑
33受体st2的促炎性介质。有证据表明，il
‑
33可以作为组织修复的启动子，尤其是在心血管疾病模型中，在该模型中，心脏应激后的il
‑
33诱导与改善的预后相关。已经确定il
‑
33被稳定地储存在ecm中并通过掺入mbv而被保护免于灭活。结果显示，来自il33
+/+
的mbv，而非来自il33
‑
/
‑
小鼠组织的mbv，指导st2
‑
/
‑
巨噬细胞分化为修复的、可重塑的m2表型，并进一步表明与mbv相关的il
‑
33通过非经典的st2非依赖性通路调节巨噬细胞活化。il
‑
33作为ecm
‑
mbv不可缺少的组成部分的发现为调节免疫驱动的病理性纤维化提供了机制方面的见解。ecm支架可用于心脏修复。
[0320]
实施例1
[0321]
从ecm生物支架分离的基质结合的纳米囊泡包含全长il
‑
33
[0322]
先前已经描述了从ecm生物支架中分离mbv和表征mirna内容物的特性(huleihel et al.,sci adv 2,e1600502(2016)；huleihel et al.,tissue eng part a 23,1283
‑
1294(2017))。为了鉴定与mbv相关的蛋白信号分子，使用r&d system的小鼠xl细胞因子阵列试剂盒对从去细胞的野生型(wt)小鼠小肠或去细胞的il33
‑
/
‑
小鼠小肠中分离的mbv进行了初步的细胞因子、趋化因子和生长因子筛选(图1a)。在mbv中具有最高表达水平的蛋白的定量表明，与从il33
‑
/
‑
小鼠分离的mbv(il33
‑ mbv)相比，从wt小鼠分离的mbv(il33
+ mbv)中il
‑
33高表达，而存在于分离的mbv中的其他蛋白的表达差异最小(图1b)。此外，从去细胞的野生型小鼠肠道分离的mbv的透射电镜观察表明，这些囊泡的直径约为100nm(图1c)。通过免疫印迹分析进一步验证了细胞因子筛选的结果，结果表明与mbv相关的il
‑
33是该蛋白的全长(32kda)形式(图1d)，而非所描述的较小裂解产物(et al.,proceedings of the national academy of sciences 109,1673
‑
1678(2012)；cayrol et al.,nature immunology 19,375(2018))。随后在临床上常用的ecm手术网片中观察到mbv全长il
‑
33表达，该网片包括实验室产生的和市售的等效膀胱基质(ubm)和matristem
tm
；小肠黏膜下层(sis)和biodesign
tm
；真皮和xenmatrix
tm
；以及心脏ecm(图1e)。结果表明，实验室生产的支架相对于其各自的市售支架具有相似的il
‑
33表达水平，表明这些结果不是实验室生产方案的人造结果。
[0323]
实施例2
[0324]
il
‑
33储存在mbv内腔中并被保护免受蛋白水解降解
[0325]
为了验证检测到的il
‑
33并非mbv分离过程的污染物，使用cl
‑
2b树脂通过尺寸排阻色谱(sec)进一步纯化mbv，并通过280nm的uv吸光度连续监测洗脱馏分
(图2a)。免疫印迹分析证实在重mbv馏分中存在il
‑
33(图2b，上图)。在另一项实验中，首先使用1％x
‑
100裂解mbv，然后通过sec分析提取物。结果表明，裂解的mbv的分子组分主要在较轻的馏分中洗脱，通过uv色谱图(图2a)和免疫印迹分析(图2b，下图)确定。另外，合并馏分6
‑
8的透射电子显微镜显示在这些馏分中存在囊泡(图2c)。这些结果证实il
‑
33与mbv有关，而非mbv分离株的可溶性污染物。接下来确定il
‑
33是否存在于mbv的表面膜上或是否存储在管腔内。用nhs
‑
lc
‑
生物素对从馏分6
‑
8收集的mbv进行生物素化。磺酸盐基团阻止生物素渗透脂质膜，从而仅标记外表面蛋白(diaz et al.,scientific reports 6,37975(2016))。生物素化后，将mbv裂解并进行抗生蛋白链菌素下拉试验，以从未结合的管腔组分中分离表面蛋白。免疫印迹分析表明，il
‑
33仅存在于未结合的馏分中，并未被链霉亲和素(sa)磁珠捕获(图2d)。在另一项实验中，首先将mbv用1％x
‑
100裂解，然后进行生物素化。这使得mbv的表面和腔内组分均可以进行生物素化。免疫印迹分析表明，在链霉亲和素捕获后，il
‑
33与sa磁珠结合(图2d)。累积地，这些数据表明il
‑
33被储存在mbv的腔内。为了证实这些结果，进行了蛋白酶k保护测定。在不存在或存在1％x
‑
100的情况下，将合并的馏分6
‑
8的mbv与浓度递增的蛋白酶k在37℃下孵育30分钟。如免疫印迹分析所示(图2e)，在不存在x
‑
100的情况下，il
‑
33未被蛋白酶k降解。但是，mbv膜经x
‑
100透化使il
‑
33易于接近并易受蛋白酶k作用，导致其降解(图2e)。这些结果证实与mbv相关的il
‑
33存在于囊泡的内腔中，在其中其被保护免于蛋白水解降解。
[0326]
实施例3
[0327]
il33
+ mbv通过非经典的st2非依赖性通路活化促重塑巨噬细胞表型
[0328]
体外开展了il
‑
33
+
或il
‑
33
‑ mbv对髓样细胞影响的广泛机理研究。考虑到il
‑
33在mbv内腔中的位置，可以假设il
‑
33的包封会阻止与其同源st2受体的结合，这表明存在非st2的转导机制。为了研究这种情况，用干扰素
‑
γ(ifn
‑
γ)和脂多糖(lps)刺激从b6 wt(图3a)或st2
‑
/
‑
小鼠(图3b)分离的骨髓巨噬细胞(bmdm)诱导m1样巨噬细胞表型，白介素4(il
‑
4)诱导m2样表型，重组il
‑
33，从去细胞野生型(il33
+ mbv)或il33
‑
/
‑
(il33
‑
mbv)小鼠肠道分离的mbv，或从猪小肠粘膜下层(sis mbv)分离的mbv。结果表明，巨噬细胞响应于sis mbv和il33
+ mbv表达精氨酸酶1(arg
‑
1)，类似于il
‑
4刺激的(m2)细胞的表达模式(图3a，3d)。相反，il33
‑ mbv诱导inos表达，但不诱导arg
‑
1表达(图3a，3c)。从st2
‑
/
‑
小鼠中分离的巨噬细胞也观察到了类似的效果。具体地，il33
+ mbv而非il33
‑
mbv将st2
‑
/
‑
巨噬细胞活化定向为修复的、促重塑的m2
‑
样表型(图3b，3c，3d)。随后通过western印迹分析证实了免疫标记测定的结果，该结果表明用il33
+ mbv而不是il33
‑ mbv刺激巨噬细胞可以诱导arg
‑
1表达的上调(图4a)。此外，il33
+ mbv诱导arg
‑
1表达的这种能力被证明与特征明确的il
‑
4/il
‑
13介导的m2巨噬细胞分化通路不同，因为il33
+ mbv非依赖于stat6磷酸化而活化m2巨噬细胞(图4b)。这些数据表明，mbv相关的il
‑
33通过未表征的、非经典的st2非依赖性通路调节巨噬细胞的活化。
[0329]
实施例4
[0330]
骨骼肌祖细胞暴露于巨噬细胞分泌产物后的肌生成的评价
[0331]
研究表明，与可选活化的m2巨噬细胞相关的分泌组对于骨骼肌成肌细胞是成肌的
41,42
。先前，我们已经表明以ecm处理的巨噬细胞为条件的培养基可以促进c2c
12
成肌细胞
的肌管形成和肌节肌球蛋白表达
43
。本研究显示了相似的结果，即以il33
+ mbv刺激而不是il33
‑ mbv刺激的巨噬细胞为条件的培养基促进c2c
12
成肌细胞的肌管形成，类似于il
‑
4诱导的m2样巨噬细胞的生物活性(图5a，b)。
[0332]
实施例5
[0333]
实施例1
‑
4的材料和方法
[0334]
小鼠肠的去细胞：新鲜的小肠获自成年野生型(wt)b6小鼠或成年il
‑
33
‑
/
‑
b6小鼠。在磷酸盐缓冲液(pbs)中洗涤小肠，以完全去除所有肠内容物，并从每个肠中获得1.5cm长的碎片，以立即去细胞。如先前所述将样品去细胞(oliveira ac,et al.plos one.2013；8(6):e66538)。简而言之，首先将样品在连续的柔和搅拌下浸入5m nacl中72h。每24h更换一次去细胞溶液。然后将小鼠肠ecm冻干，并使用具有#40目筛的wiley mill研磨成颗粒。
[0335]
皮肤ecm的制备：皮肤ecm的制备如先前所述(reing je,et al.biomaterials.2010；31(33):8626
‑
33)。简而言之，从市售体重(～110kg)的猪(tissue source inc.)收获全厚度皮肤，并通过机械分层去除皮下脂肪和表皮。然后将该组织用0.25％胰蛋白酶(thermo fisher scientific)处理6小时，70％乙醇处理10小时，3％h2o2处理15min，0.26％edta/0.69％tris中的1％x
‑
100(sigma
‑
aldrich)处理6小时，溶液更换另外16个小时，然后用0.1％过氧乙酸/4％乙醇(rochester midland)处理2小时。在最后一步之后，在每次化学变化之间交替用水和磷酸盐缓冲液(pbs)进行洗涤。所有化学暴露均在300rpm的轨道振荡器上在搅拌下进行。然后将皮肤ecm冻干，并使用具有#40目筛的wiley mill研磨成颗粒。
[0336]
膀胱基质(ubm)的制备：如先前所述制备ubm(mase vj,et al.orthopedics.2010；33(7):511)。来自市售体重动物的猪膀胱获自tissue source，llc。简而言之，机械地除去浆膜、外膜肌、粘膜下膜和肌膜粘膜。通过用去离子水洗涤，使粘膜的腔尿道上皮细胞与基底膜分离。剩余的组织由基底膜和膜粘膜下层固有层组成，并通过在0.1％过乙酸中与4％乙醇在300rpm下搅拌2小时而去细胞。然后将组织用pbs和无菌水充分冲洗。然后将ubm冻干并使用具有#60目筛的wiley mill研磨成颗粒。
[0337]
小肠粘膜下层(sis)的制备：如先前所述制备sis(badylak sf,et al.j surg res.1989；47(1):74
‑
80)。简而言之，空肠从6个月龄的市场体重(～110至～120kg)的猪收获，并纵向分割。机械去除外膜粘膜的表层。同样，机械除去浆膜和外膜，留下粘膜下粘膜和粘膜基底部分。通过在0.1％过乙酸中与4％乙醇在300rpm下搅拌2小时以完成组织的去细胞和消毒。然后将组织用pbs和无菌水充分冲洗。然后将sis冻干并使用具有#60目筛的wiley mill研磨成颗粒。
[0338]
心脏ecm的制备：如先前所述制备心脏ecm(wainwright jm,et al.tissue eng part c methods.2010；16(3):525
‑
32)。简而言之，安乐死后立即获得猪心脏，并在
‑
80℃冷冻至少16h并解冻。进行主动脉插管，并以1升/分钟的速度交替注入1型试剂级(1型)水和2
×
pbs，每次15分钟。在37℃下连续灌注0.02％胰蛋白酶/0.05％edta/0.05％nan3、3％x
‑
100/0.05％edta/0.05％nan3和4％脱氧胆酸(每次在约1.2升/分钟下进行2h)。最后，以1.7升/分钟的速度向心脏灌注0.1％过氧乙酸/4％etoh 1小时。在每种化学溶液之后，将1型水和2
×
pbs冲洗通过心脏，以帮助细胞溶解以及去除细胞碎片和化学残留物。然后将心脏ecm冻干，并使用具有#60目筛的wiley mill研磨成颗粒。
[0339]
基质结合的纳米囊泡(mbv)的分离：如先前所述(huleihel l,et al.sci adv.2016；2(6):e1600502)分离mbv。简而言之，将酶消化的ecm分别在500g(10min)、2500g(20min)和10,000g(30min)下进行离心分离，以除去胶原原纤维残余物。上述每个离心步骤进行三次。然后将无纤维的上清液在4℃下以100,000g(beckman coulter optima l
‑
90k超速离心机)离心70分钟。洗涤100,000g的沉淀，并将其悬浮在500μl的pbs中并通过0.22μm的过滤器(millipore)。
[0340]
细胞因子抗体阵列：按照生产商的说明，使用小鼠xl细胞因子阵列试剂盒(r&d systems；minneapolis，mn，usa)，分析mbv中储存的细胞因子。从去细胞的wt小鼠肠(n＝3)或去细胞的il
‑
33
‑
/
‑
小鼠肠(n＝3)分离的mbv制备提取物。将提取物稀释并与阵列膜共孵育过夜。冲洗该阵列以除去未结合的蛋白，与抗体混合物共孵育，然后使用链霉亲和素
‑
辣根过氧化物酶和化学发光检测试剂进行显影。使用image j软件量化平均点像素密度。
[0341]
透射电子显微镜(tem)：如先前所述(huleihel l,et al.sci adv.2016；2(6):e1600502)，对装载在碳涂层格栅上并固定在4％多聚甲醛中的mbv进行tem成像。使用jeol 1210 tem和高分辨率advanced microscopy techniques数码相机以80kv对栅格进行成像。使用jeol tem软件由代表性图像确定mbv的大小。
[0342]
尺寸排阻色谱法(sec)：如先前所述(an,et al.j extracellular vesicles.2014；3(1))，通过sec对mbv进行分馏分离，简而言之，使用15ml的sepharose cl
‑
2b树脂(sigma aldrich)将其堆叠在1cm
×
20cm的玻璃柱中，洗涤并用pbs平衡，将1ml mbv上样到柱上，并立即开始使用pbs作为洗脱缓冲液进行馏分收集(每馏分0.3ml，总共收集30个馏分)。使用biologic lp系统(biorad)通过uv 280nm连续监测馏分，通过将mbv在1％x
‑
100中孵育30min来制备裂解的mbv，然后如上所述进行sec。
[0343]
mbv蛋白的生物素化：如前所述(diaz g，et al.sci rep。2016；6：37975)进行mbv蛋白的生物素化，有少量修改。在不存在或存在10mm磺基
‑
nhs
‑
生物素的情况下，将100微克完整mbv在室温下孵育30min。磺基
‑
nhs
‑
生物素中磺酸盐基团的存在会阻止试剂渗透mbv膜。孵育后，使用10kda mwco过滤柱除去过量的sulfo
‑
nhs
‑
生物素，然后用1％x
‑
100裂解mbv。在另一项实验中，首先将100微克的mbv溶解在1％x
‑
100中。裂解后，进行缓冲液交换，用1
×
pbs代替1％x
‑
100溶液。然后将mbv提取物在不存在或存在10mm磺基
‑
nhs
‑
生物素的条件下于室温孵育30min。孵育后，使用10kda mwco过滤柱除去过量的sulfo
‑
nhs
‑
生物素。将mbv
±
生物素或mbv提取物
±
生物素在1
×
pbs中稀释至500μl，并与50μl预洗涤的链霉亲和素
‑
琼脂糖树脂(sigma aldrich)共孵育。在室温在轨道摇床上孵育2小时后，将链霉亲和素
‑
琼脂糖树脂通过以10,000
×
g离心5min沉淀。将代表未结合馏分的上清液转移至新管中，并将树脂在300mm nacl中洗涤5次。通过与洗脱缓冲液(2％sds，6m尿素)在室温下孵育15分钟，然后在96℃下孵育15分钟，从树脂上洗脱结合的蛋白。
[0344]
蛋白酶k保护测定：如前所述进行蛋白酶k保护测定(de jong og,et al.j cell mol med.2016；20(2):342
–
350)。简而言之，将mbv在pbs或浓度递增的pbs中的蛋白酶k中(存在或不存在1％x
‑
100的情况下)在37℃下以20μl的最终体积孵育1h。加入20μl 95℃2x laemmli buffer和10mm dtt终止测定。5min后。在95℃下孵育后，将样品用于免疫
印迹分析。
[0345]
巨噬细胞的分离和活化：如先前所述(huleihel l,et al.tissue eng part a.2017；23(21
‑
22):1283
‑
1294)分离并表征小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)。简而言之，从6至8周龄的c57bl/6小鼠中收获骨髓。洗涤收集自骨髓的细胞，并以1
×
106个细胞/ml接种，然后在存在巨噬细胞集落刺激因子(mcsf)的情况下分化为巨噬细胞7天，每48h进行一次完全培养基更换。然后使用以下方法之一活化巨噬细胞24h：(1)20ng/ml干扰素
‑
γ(ifnγ)和100ng/ml脂多糖(lps)(affymetrix ebioscience，santa clara，ca；sigma aldrich)促进m
ifnγ+lps
表型(m1样)，(2)20ng/ml白介素(il)
‑
4(invitrogen)促进m
il
‑4表型(m2样)，(3)100ng/ml il
‑
33(peprotech)，或(4)25μg/ml wt小鼠mbv，il
‑
33
‑
/
‑ mbv或sis
‑
mbv。在37℃下孵育后，将细胞用无菌pbs洗涤并用2％多聚甲醛(pfa)固定以进行免疫标记。
[0346]
巨噬细胞免疫标记：为了防止非特异性结合，将细胞在由pbs、0.1％
‑
x、0.1％
‑
20、4％山羊血清和2％牛血清白蛋白组成的封闭溶液中于室温下孵育1h。然后去除封闭缓冲液，并将细胞在以下一抗中的一种的溶液中孵育：(1)以1:200稀释的单克隆抗f4/80(abcam，cambridge，ma)作为泛巨噬细胞标志物，(2,3)以1:100稀释的多克隆抗诱导型一氧化氮合酶(inos)(abcam，cambridge，ma)作为m1样标志物，和抗精氨酸酶1(abcam，cambridge，ma)以1:200的稀释度作为m2样标志物。将细胞在4℃下孵育16小时，除去一抗，然后用pbs洗涤细胞。将荧光团偶联的二抗(alexa驴抗兔488或驴抗大鼠488；invitrogen，carlsbad，ca)的溶液在室温下加入合适的孔中1h。然后去除抗体，用pbs洗涤细胞，并使用dapi对细胞核进行复染。细胞因子活化的巨噬细胞用于建立标准化的暴露时间(阳性对照)，此后在整个组中保持恒定。cellprofiler(broad institute，cambridge，ma)用于量化图像。使用非配对student t检验(将处理的巨噬细胞与适当的m0培养基对照进行比较)，或对于多重比较通过tukey事后检验进行方差因素分析，从而分析数据的统计显著性。数据以平均值
±
标准差表示，最小值为n＝3，p值<0.05被认为具有统计学意义。
[0347]
c2c
12
肌生成测定：高血清培养基(20％胎牛血清)可在细胞周期内维持细胞增殖并抑制分化。相反，低血清培养基(1％胎牛血清，1％马血清)诱导细胞周期退出和肌管形成，从而提供了阳性对照。这些分别称为增殖培养基和分化培养基。通过检查骨骼肌成肌细胞融合指数确定成肌分化潜能。在增殖培养基中培养c2c
12
骨骼肌成肌细胞，直至它们达到约80％融合为止。然后将培养基更换为由巨噬细胞上清液和增殖培养基的50:50溶液组成的处理培养基，或增殖培养基或分化培养基的对照。5
‑
7天后，或当分化培养基对照显示肌管形成时，将细胞固定以进行2％多聚甲醛的免疫标记。根据先前描述的方案，将固定的细胞在室温下封闭1h，然后在抗肌动蛋白肌球蛋白抗体中孵育。一抗孵育后，将细胞用pbs洗涤，然后在室温下以1:200的稀释度在alexa fluor驴抗小鼠488二抗中孵育1h，并用dapi复染。使用zeiss axiovert显微镜每个孔拍摄五个20倍视野的图像。
[0348]
实施例6
[0349]
il
‑
33在移植排斥和mbv中的应用
[0350]
急性心脏移植(htx)排斥通常通过免疫抑制剂疗法避免，该疗法控制受体cd4
+
和cd8
+ t细胞对同种抗原的应答。但是，这种免疫抑制疗法对慢性心脏移植排斥(cr)无效，并且由此产生的免疫介导的纤维化和血管重塑导致进行性心肌功能障碍，并在移植后约11年内丧失大部分htx。最近的研究表明，先天性免疫细胞，诸如炎性巨噬细胞、单核细胞和单核
细胞来源的树突状细胞(dc)，在cr中起着关键作用，因为与移植过程相关的缺血
‑
再灌注损伤(iri)之后它们对释放的损伤相关分子模式(damp)具有强促炎性应答。实体器官迅速被受体单核细胞和受体单核细胞来源的dc浸润，这对引发和维持cr的同种异体t细胞起重要的局部刺激作用。因此，很明显，包含损伤相关分子模式的自分子在组织损伤期间被释放并刺激浸润的先天免疫细胞中的促炎反应。但是，人们对在损伤部位也存在的局部内源性负调节剂的免疫控制了解很少。il
‑
33，隔离在基质细胞核中的il
‑
1家族成员，可能具有这种免疫调节特性。重组il
‑
33的递送通过扩展调节性t细胞(treg)促进心脏移植后的移植存活。本文公开了从各种器官的ecm分离的mbv是il
‑
33的丰富且稳定来源的发现。尽管人们认为il
‑
33是一种核蛋白，但仍缺乏将其从核中螯合释放并介导对免疫细胞的作用的机制。本文提供的数据证实，mbv中的il
‑
33是非隔离和免疫调节性il
‑
33的重要来源，它能够指导先天免疫细胞在体外和体内的分化。
[0351]
实施例7
[0352]
il
‑
33的缺失增加慢性排斥
[0353]
体外研究显示了将巨噬细胞转移至免疫调节和可能修复的m2亚型的有效能力(图3a
‑
3c，图4a
‑
4b)。为了检测il
‑
33(包括mbv中的il
‑
33)对心脏移植结果的影响，将来自bm12小鼠的il
‑
33缺陷或il
‑
33充足的心脏移植到野生型(wt)c57bl/6(b6)接受体小鼠中。这些小鼠的核和mbv均缺乏il
‑
33。bm12小鼠表达的h2
‑
ab1
bm12
与h2
‑
ab1
b
具有3个核苷酸差异，导致3个氨基酸置换，被wt b6小鼠的免疫系统识别为非自身氨基酸。在这些研究中，将il
‑
33缺陷(ko)或il
‑
33充足的bm12移植物(wt)移植到b6接受体中，并在移植后90
‑
100天评估慢性排斥相关的血管闭塞和纤维化的发展(图6a
‑
6d)。苏木素和伊红(h+e；图6a)和tri
‑
chrome染色(图6b)以及计算机辅助图像分析证实血管病明显增加(图6c)并缺失肌肉纤维/纤维化疾病(图6d)。htx缺乏il
‑
33。因此，il
‑
33的完全缺失明显增加慢性排斥的发生。
[0354]
实施例8
[0355]
il
‑
33
+ mbv控制移植后炎性骨髓细胞的生成
[0356]
在机理研究中，研究了移植物il
‑
33的完全缺失和il
‑
33
+ mbv修复的影响，特别是其如何影响协调慢性排斥的局部免疫细胞。在这些研究中，在术后第3天分离并通过流式细胞术分析评估白细胞。从未实验bm12小鼠心脏(未实验对照组，contrls)中分离的白细胞作为基线对照组(n＝4)。从流式细胞术分析生成代表性点图(图7a
‑
7d)，并进行统计分析(p值通过单因素方差分析(anova)生成，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001)。缺乏il
‑
33的心脏移植物的早期炎症反应明显增强，诸如存在局部炎性髓样细胞，诸如单核细胞来源的树突状细胞(monodc)(图7a
‑
7b：cd45
+ cd11b
+ cd11c
+ f4
‑
80
lo mhcii
hi
)和炎症tx后早期巨噬细胞(图7c
‑
7d；cd45
+ cd11b
+ f4
‑
80
hi ly6c
hi mhcii
hi
)。可以通过使用il
‑
33
+ mbv恢复局部il
‑
33来纠正炎症性骨髓细胞的这种增加(图8a
‑
8d)。这通过心脏移植物中cd11b+cd11c
hi monodc(图8a，8c)和cd11b
+ f4/80
hi ly6c
hi
炎性巨噬细胞(图8b，8d)的显著减少证明。总体而言，这些数据将mbv中的il
‑
33鉴定为控制移植后移植物中炎性骨髓细胞生成的重要局部因子。
[0357]
减少局部炎症可以限制早期排斥和随后发展的慢性排斥。所有实体器官(心脏、肾脏、肝脏、肺脏)均遭受某种形式的慢性排斥，其中包括纤维化疾病和加速的血管病理。根据在常用啮齿动物实体移植模型中的发现，在其他实体器官移植后立即进行局部il
‑
33
+ mbv
递送可以限制局部髓样细胞的炎症能力并促进改善移植结果。实体器官移植后早期由于缺血时间延长和组织损伤引起的炎症与不良的移植结局以及增加的急性和慢性排斥有关。相反，在活体供体移植后观察到最佳移植结局，其中短暂的缺血时间减少/限制了由先天髓样细胞浸润所介导的炎症反应。当前的免疫抑制剂主要利用移植后的靶标适应性免疫细胞(t细胞和b细胞)。除类固醇外，它们对先天免疫细胞无效。这些药物通常对引发排斥的先天细胞无有效影响。因此，靶向先天髓样细胞的mbv和靶向免疫细胞的适应性免疫抑制剂的联合使用是非常有效的联合使用。
[0358]
实施例9
[0359]
实施例7
‑
8的材料和方法
[0360]
动物：c57bl/6(b6)和bm12小鼠购自jackson laboratories。il33
‑
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小鼠获赠自s.nakae(university of tokyo,tokyo,japan)
84
。通过将bm12小鼠回交至il33
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背景6次，产生bm12 x il33
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小鼠。st2
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小鼠最初在balb/c背景上产生，如
85
所述，然后从c57bl/6背景回交7次后从dr.anne sperling(芝加哥大学)获得。然后将这些小鼠再杂交3次至c57bl/6背景。将动物饲养在无特定病原体的设施中。
[0361]
血管化心脏移植：与野生型(wt)b6小鼠相比，其h2
‑
ab1
b
中具有3个氨基酸置换的b6 bm12通常用作慢性排斥小鼠模型中的心脏移植供体。通过将bm12小鼠与il
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33缺陷的b6小鼠杂交，我们可以确定il
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33在慢性排斥中的作用。将bm12或bm12 x il33
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心脏异位移植到c57bl/6或c57bl/6 il33
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接受体的腹部。简而言之，将供体心脏通过供体升主动脉和肺动脉的端侧吻合术分别移植到受体腹主动脉和下腔静脉。每天通过腹部触诊心脏收缩来评估移植功能。在某些实验中，将il
‑
33
+ mbv在猪源ubm水凝胶中稀释至1mg/ml mbv的终浓度。移植物再灌注后，将移植物覆盖在含有40μg稀释mbv的水凝胶中。更换肠道并使其在移植心脏周围恢复其正常位置，同时水凝胶中的mbv稳定地粘附在心脏表面。每天通过腹部触诊心脏收缩来验证移植功能，直到指定收获日为止。
[0362]
分离脾脏和移植物浸润的白细胞：麻醉小鼠并通过左心室用pbs+0.5％肝素灌注，直到流出右心室的液体不含任何可见血液。分离脾脏，机械解离和rbx裂解后产生单细胞悬液。然后将心脏取出，切成碎片，并在温和的macs解离器(miltenyi biotec)上使用程序e在含有350u/ml iv型胶原酶和1ul/ml dnase i的培养基中，在gentle macs c管中匀浆。然后使用40μm细胞过滤器过滤获得，并在lympholyte
‑
m(cedarlane)密度梯度上以1500g离心20min，然后在中间相中用巴斯德吸管移出细胞，并转移到新的洗涤管中，进行细胞计数和分析。
[0363]
流式细胞术：将分离的脾细胞和移植物浸润的白细胞与热灭活的山羊血清(5％)孵育以阻断fcr，用活/死区分色处理，然后用荧光素结合的abs的不同组合进行标记(bd bioscience，biolegend，ebioscience或md biosciences)以评估骨髓细胞的数量，使用lsrfortessa流式细胞仪(bd，biosciences)获取数据，并使用flowjo 10.1版(treestar)进行分析。
[0364]
组织学和免疫组织化学染色：将空白小鼠心脏和心脏移植物用福尔马林固定，石蜡包埋，切片为4μm，然后按照标准方案用h+e或masson’s trichrome染色。使用nearcyte软件(可通过nearctye.org在互联网上获得)，将蓝色纤维化+面积(mm2)除以整个组织面积(mm2)，然后乘以100，得出纤维化面积测量％。通过手动比较每个心脏样品中被阻塞的动脉
相对于动脉总数来计算动脉阻塞百分比。
[0365]
实施例10
[0366]
纤维化治疗
[0367]
从间质性肺纤维化(ipf)患者和年龄匹配的正常(对照)患者的移植肺中分离人肺成纤维细胞。在接受mbv治疗前后，测定col1、col3、纤连蛋白和acta2(纤维化的标志物)的表达水平。将mbv以两种不同浓度(1
×
109和3
×
109)颗粒/ml添加到培养基中。结果表明，所有治疗导致这些纤维化标志物的表达水平均明显降低。从去细胞的肺中分离的mbv下降更明显。见图9a，9b。因此，mbv的施用可以用作减少肺和其他组织中纤维化的疗法。
[0368]
显而易见的是，在不偏离所描述的本发明的精神的情况下，可以改变或改进所描述的方法或组合物的详细细节。我们要求落入以下权利要求的范围和精神内的所有此类改进或改变的权利。