用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的制作方法

本发明涉及一种口腔清洁用组合物，更具体地，本发明涉及一种用于诱导构成牙齿的牙本质缺损部的生理性再矿化来预防或缓解感觉过敏的口腔清洁用组合物。

背景技术：

一般称为“敏感性牙齿”的牙本质感觉过敏是8％至57％的成年人会经历的常见的症状。尤其，牙周疾病作为在韩国最为常见的疾病，患者中的72.5％至98％有敏感性牙齿的困扰(来源：国家健康信息门户网站医学信息；http://health.cdc.go.kr/health/main.do)。

牙本质感觉过敏可以定义为，牙本质小管将外部的所有刺激直接传递到牙髓内，使得对于相同的刺激也反应得比平时敏感而诱发的痛症。虽然牙本质本身没有神经，但是我们感觉牙齿冷是因为冷的温度刺激通过牙本质小管而传递到了牙髓内部的神经。

占牙齿的最多部分的牙本质中具有从牙髓相接至牙釉质的牙本质小管。该管的内部充满了液体，越向牙髓方向直径越大且结构密集，因这种结构性特征，使得外部刺激能够很快地传递到内部的牙髓神经。若与外部接触的牙本质受损而使得牙本质小管与外部接触的面积变大，这也会成为对于相同的刺激反应得比平时敏感的原因。

目前，按照作用原理，用于治疗敏感性牙齿的方法大致分为两种，一种是妨碍传递痛症的神经的信号传递，另一种是堵住露出的牙本质小管而缓解该症状的方法。

首先，用于妨碍传递痛症的神经的信号传递的方法，常用磷酸氢二钾(k2hpo4)成分。但是磷酸氢二钾不仅阻断疼痛的效果低下，而且需要持续反复使用，且限制在咀嚼过程中的咀嚼感，因此难以视为有效的治疗方法。

其次，在用于封闭牙本质小管的方法中，使用磷酸钙(cahpo4)、氟(fluorine)、草酸(oxalate)、作为氨基酸的精氨酸(arginine)和碳酸钙(caco3)等。但是封闭牙本质小管的方法由于也会利用与牙本质相异的异质性物质，因此会在周边的边界部位产生缝隙或者脱离封闭部而神经再次暴露，使得酸痛症状复发。目前，用于缓解牙本质感觉过敏(敏感性牙齿)的漱口水大多为含氟产品，已知具有如下效果，由于氟涂布于牙齿，并与唾液中的钙成分的结合力强，使得封闭露出的牙本质小管而缓解酸痛症状。不过，长期使用氟会具有，使人体免疫体系受损，或者可能诱发关节炎、腰痛、骨质疏松症等的副作用。

技术实现要素：

解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种口腔清洁用组合物，通过牙本质的生理性再矿化(remineralization)而封闭露出的牙本质小管的缺损部，由此预防或缓解感觉过敏，所述口腔清洁用组合物包含肽(peptide)。

本发明的目的不限于以上提及的内容，本发明所属技术领域的普通技术人员可以从以下记载明确理解未提及的其它目的。

技术方案

旨在解决所述技术课题的根据本发明的一种实施方式的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物，提供一种用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物，其包括由下述通式1的氨基酸序列构成的肽。

k-y-r1-r2-r3-r4-r5-r6-r7-r8(通式1)

在所述通式1中，

r1为精氨酸(r)、赖氨酸(k)或谷氨酰胺(q)；

r2为精氨酸(r)或谷氨酰胺(q)；

r3、r4及r5分别为精氨酸(r)或赖氨酸(k)；

r6为天冬酰胺(n)或丝氨酸(s)；以及

r7及r8为赖氨酸(k)或酪氨酸(y)。

其中，所述肽可由序列号1至96中的任意一种氨基酸序列构成。

其中，对于100重量份的所述组合物，可包含0.00005-0.00015重量份的所述肽。

其中，对于100重量份的所述组合物，可包含0.0545-0.0555重量份的氯化十六烷基吡啶。

在示例性的实施例中，就口腔清洁用组合物而言，对于100重量份的所述组合物，可包含85-87重量份的纯化水、1.7-2.9重量份的表面活性剂及0.0045-0.0055重量份的柠檬酸水合物。

在示例性的实施例中，所述表面活性剂可以为泊洛沙姆和/或聚山梨酯20。

在示例性的实施例中，所述表面活性剂可以包含12-14wt％的所述泊洛沙姆407、86-88wt％的聚山梨酯20。

在示例性的实施例中，就口腔清洁用组合物而言，对于100重量份的所述组合物，可包含9-11重量份的润湿剂。

在示例性的实施例中，所述润湿剂可以为d-山梨醇液和/或浓缩甘油。

在示例性的实施例中，所述润湿剂可包含45-55wt％的所述d-山梨醇液、45-55wt％的所述浓缩甘油。

发明效果

本发明可提供一种口腔清洁用组合物，其通过牙本质的生理性再矿化而封闭露出的牙本质小管的缺损部，由此预防或缓解感觉过敏，所述口腔清洁用组合物包含肽。

本发明的效果不限于以上提及的内容，本发明所属技术领域的普通技术人员可以从以下记载明确理解未提及的其它效果。

附图说明

图1a为表示将根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物所包含的肽对于作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp(dentinsialophosphoprotein，牙本质涎磷蛋白)表达产生的影响进行分组比较的结果的图表。

图1b为表示用根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物所包含的肽处理的mdpc-23细胞中，对作为成牙本质细胞分化标志的dspp基因的表达水平进行比较的结果的图表。

图1c为表示用根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物所包含的组11及12的肽处理的mdpc-23细胞中，对作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp、dmp1(dentinmatrixprotein1，牙本质基质蛋白1)及nestin(巢蛋白)基因的表达水平进行比较的结果的图表。

图1d为表示根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物所包含的肽对于牙髓组织细胞进行细胞毒性评价的结果的图表。

图2表示对于根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管的透光率，图示出混合荧光染色试剂(rhodamineb)并在露出牙本质小管的牙齿上处理1分钟之后用荧光显微镜观察的结果。

图3图示出对根据比较例3-1及比较例3-2与本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管的封闭能力进行比较的结果。

a-c图示仅以纯化水处理的牙本质的牙本质小管(比较例3-1)；d-f图示在根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的构成中，与未包含肽的口腔清洁用组合物进行反应的牙本质小管(比较例3-2)；g-i图示与根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物进行反应的牙本质小管(比例尺：a、d、g为100μm；b、e、h为20μm；c、f、i为10μm)。与牙本质小管露出的牙本质样品分别反应1日、1次、1分钟之后保管在人工唾液中，重复此过程2周之后，用扫描电子显微镜观察牙本质小管的封闭能力。

图4放大了通过根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物而使牙本质小管被封闭的部分，图示了在封闭的牙本质小管和牙本质表面发生再矿化的结果。

具体实施方式

如果参照后面与附图一同详细叙述的实施例，本发明的目的以及效果、用于达成其的技术构成将会明确。在说明本发明方面，当判断认为对公知功能或构成的具体说明可能不必要地混淆本发明要旨时，省略该详细说明。而且，后述的术语作为考虑在本发明中的功能而定义的术语，可根据使用者等的意图或惯例等而有所不同。

但是，本发明并非限定于以下公开的实施例，可以以互不相同的多样形态体现，不过，本实施例是为了使本发明的公开更完整，为了向本发明所属技术领域的普通技术人员完整地告知发明的范畴而提供的，且本发明只由权利要求项的范畴所定义。因此应基于本说明书整体内容而进行该定义。

在整体说明书中，如果说某部分“包含”或“具备”某构成要素时，只要没有特别相反的记载，这并非意指排除其他构成要素，而意指还包含其他构成要素。

下面，通过实施例更详细地说明本发明。

在说明本发明方面，就成牙本质细胞(或成牙质细胞)(odontoblast)而言，可意指如下细胞，即在细胞内对构成牙本质的基质的蛋白质、多糖体进行合成、分泌的细胞。且作为相接于前期牙本质(未钙化的牙本质)，并在牙髓的周边部构成一层的细胞层的圆周形状的细胞，且为牙乳头的细胞中面向成釉器者(成为外胚层系间充质来源细胞)进行分化的细胞，而且还参与牙本质的钙化的细胞。

根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物所包含的肽(下称“促进成牙本质细胞分化的肽”)可以不呈现细胞毒性的同时，还可以增加作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp、dmp1及nestin基因的表达水平，且在与牙髓组织细胞一并移植于生物体时，可呈现出所述牙髓组织细胞形成牙本质/牙髓组织-类似组织的特征。

在促进成牙本质细胞分化的肽中，只要能够呈现出促进牙本质的再生或治疗牙本质感觉过敏的效果，则可还包括具有与构成所述肽的氨基酸序列一个以上不同氨基酸残基的序列的突变体肽。

通常，在整体上不改变分子的活性的蛋白质及多肽中的氨基酸的交换在本发明所属技术领域中是公知的。最普遍地发生的交换为氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、asp/gly之间的交换。并且，通过氨基酸序列上的突变或修饰可包含如下的肽，即包含与肽的热、ph等有关的结构性稳定性增加或包含牙本质或牙髓组织的再生促进能力增加的肽。

例如，本发明中提供的位于序列号1的肽的第3位的酸性氨基酸谷氨酰胺，即使被碱性氨基酸的赖氨酸或精氨酸取代，也可照样显示出在本发明中提供的肽的效果；位于序列号1的肽的第4位或第5位的碱性氨基酸精氨酸，即使被酸性氨基酸谷氨酰胺或被碱性氨基酸赖氨酸取代，也可照样显示出在本发明中提供的肽的效果；位于序列号1的肽的第6位、第7位或第9位的碱性氨基酸赖氨酸，即使被碱性氨基酸精氨酸或被芳香族氨基酸酪氨酸取代，也可照样显示出在本发明中提供的肽的效果；位于序列号1的肽的第8位的酸性氨基酸天冬酰胺，即使被中性氨基酸丝氨酸取代，也可照样显示出在本发明中提供的肽的效果；位于序列号1的肽的第10位的芳香族氨基酸酪氨酸，即使被碱性氨基酸赖氨酸取代，也可照样显示出在本发明中提供的肽的效果。

如此地，构成促进成牙本质细胞分化的肽的酸性氨基酸、碱性氨基酸或芳香族氨基酸，即使分别被不同酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸或芳香族氨基酸取代，也可照样显示出效果，因此具有与构成促进成牙本质细胞分化的肽的氨基酸序列一个以上不同氨基酸残基的序列的突变体肽，也包含于促进成牙本质细胞分化的肽的范畴，这是显而易见的。

并且，促进成牙本质细胞分化的肽即使具有在它的n-末端或c-末端附加有任意氨基酸的形式，也可照样显示出在本发明中提供的肽的效果，因此包含于在本发明中提供的肽的范畴。例如，可以是在所述肽的n-末端或c-末端附加有1至300个氨基酸的形式，再如，可以是在所述肽的n-末端或c-末端附加有1至100个的氨基酸的形式，又如，可以是在所述肽的n-末端或c-末端附加有1至24个的氨基酸的形式。

可确认，与在未用促进成牙本质细胞分化的肽处理的mdpc-23细胞(对照组)中测定的作为成牙本质细胞分化标志的dspp基因的mrna水平相比，用促进成牙本质细胞分化的肽处理的mdpc-23细胞中所述dspp基因的mrna水平均呈现1.3倍以上的值(表13至24)。

根据当前为止的报告，已知，若dspp的mrna表达水平增加，则促进成牙本质细胞分化及牙本质再生，因此可知如下：呈现增加所述dspp基因的mrna水平的效果的促进成牙本质细胞分化的肽，示出促进成牙本质细胞分化及牙本质再生的效果(tadurusreenathetal.,thejournalofbiologicalchemistry,vol.278,no.27,issueofjuly4,pp.24874-24880,2003；williamt.butleretal,connectivetissueresearch,44(suppl.1):171-178,2003)。

根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物所包含的肽能够以肽的单独形式使用，也能够以由所述肽重复2次以上而连接的多肽形式使用，还能够以在所述肽的n-末端或c-末端结合有呈现成牙本质细胞分化或牙本质再生效果的药物的复合体形式使用。

实施例1:

用于促进成牙本质细胞分化的肽的合成

通过9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,fmoc)方法合成肽(序列号1)，并且将合成的所述肽的氨基酸取代以合成各组的肽(表1至12)。

n-kyqrrkknky-c(序列号1)

首先，组1的肽为序列号1的肽，或以赖氨酸或精氨酸取代所述序列号1的肽的第5至7位的氨基酸而合成(表1)。

【表1】

组1的肽

然后，以赖氨酸或精氨酸取代序列号1的肽的第5至7位的氨基酸，并以丝氨酸取代第8位的氨基酸，从而合成了组2的肽(表2)。

【表2】

组2的肽

然后，以赖氨酸或精氨酸取代序列号1的肽的第5至7位的氨基酸，并以酪氨酸取代第9位的氨基酸，从而合成了组3的肽(表3)。

【表3】

组3的肽

然后，以赖氨酸或精氨酸取代序列号1的肽的第5至7位的氨基酸，并以丝氨酸取代第8位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组4的肽(表4)。

【表4】

组4的肽

然后，以精氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，从而合成了组5的肽(表5)。

【表5】

组5的肽

然后，以精氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，从而合成了组6的肽(表6)。

【表6】

组6的肽

然后，以精氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组7的肽(表7)。

【表7】

组7的肽

然后，以精氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组8的肽(表8)。

【表8】

组8的肽

然后，以赖氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，从而合成了组9的肽(表9)。

【表9】

组9的肽

然后，以赖氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，从而合成了组10的肽(表10)。

【表10】

组10的肽

然后，以赖氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组11的肽(表11)。

【表11】

组11的肽

最后，以赖氨酸取代序列号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组12的肽(表12)。

【表12】

组12的肽

实施例2:检验利用成牙本质细胞的牙本质的再生促进效果

实施例2-1:检验肽对dspp(dentinsialophosphoprotein)启动子活性产生的影响

首先，在包含10％fbs的dmem培养基，以5％的co2及37℃的条件来培养作为小鼠来源成牙本质细胞的mdpc-23细胞。

然后，在24孔板以每孔5x10⁴细胞数接种培养的所述mdpc-23细胞，并培养24小时之后，利用脂质体plus^tm试剂在所述培养的细胞中，导入重组载体来进行转化，其中所述重组载体为在pgl3载体导入了dspp启动子和荧光素酶基因的重组载体。用所述实施例1中合成的组1至12的肽分别处理被转化的所述mdpc-23细胞，并在培养48小时之后，测定在各个转化的所述mdpc-23细胞中的荧光素酶活性，并对按照各组算出的平均水平进行了比较(图1a)。此时，作为对照组使用了未用促进成牙本质细胞分化的肽处理的转化的mdpc-23细胞。

图1a为表示本发明中提供的各肽对于作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp表达产生的影响进行分组比较的结果的图表。从图1a可确认，本发明中提供的各肽虽然整体上示出了对照组中测定的荧光素酶(luciferase)活性水平的约1.3倍以上的值，但按各组呈现出差异，组12的肽示出最高水平的荧光素酶活性，而呈现出第二高水平的荧光素酶活性的肽为组11的肽。

因此，可知，本发明中提供的肽呈现出活化dspp启动子的效果。

实施例2-2：检验肽对于作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp基因的表达水平产生的影响

用所述实施例1中合成的各组肽处理所述实施例2-1中培养的mdpc-23细胞，并培养48小时之后，测定在所述mdpc-23细胞中表达的作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp基因的mrna水平，以对于在对照组中测定的dspp基因的mrna水平的相对比率来换算出所述测定的各个dspp基因的mrna水平(表13至24)。而且，按各组比较了根据各组的肽测定的dspp基因的mrna水平的平均值(图1b)。此时，作为对照组使用了未用促进成牙本质细胞分化的肽处理的mdpc-23细胞。

所述dspp基因的表达水平通过rt-pcr及实时pcr分析来进行测定：具体地，利用trizol试剂从所述mdpc-23细胞分离出总(total)rna。利用2μg的总rna和1μl的逆转录酶及0.5μg的寡核苷酸(oligo；dt)合成了cdna。将合成的cdna利用于实时聚合酶链式反应。利用sybrgreenpcrmastermix(takara，日本)，在abiprism7500序列检测系统(sequencedetectionsystem)(appliedbiosystems)中，与下述各引物进行了实时聚合酶链式反应。以在94℃下，1分钟；在95℃下，15秒钟；在60℃下，34秒钟的方式重复40个循环(cycles)的条件下进行了实时聚合酶链式反应。作为结果分析，利用比较循环阈值(comparativecyclethreshold；ct)方法进行了评价。此时，作为内部对照组使用了gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因，测定值则在执行3次重复实验之后，使用了其平均值及标准偏差值。

dspp_f:5'-attccggttccccagttagta-3'(序列号97)

dspp_r:5'-ctgttgctagtggtgctgtt-3'(序列号98)

gapdh_f:5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(序列号99)

gapdh_r:5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(序列号100)

【表13】

组1的肽对作为dspp基因的mrna水平产生的效果

【表14】

组2的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表15】

组3的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表16】

组4的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表17】

组5的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表18】

组6的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表19】

组7的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表20】

组8的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表21】

组9的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表22】

组10的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表23】

组11的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

【表24】

组12的肽对dspp基因的mrna水平产生的效果

从所示表13至24可确认，与在未用促进成牙本质细胞分化的肽处理的mdpc-23细胞(对照组)中测定的作为成牙本质细胞分化标志的dspp基因的mrna水平相比，在用促进成牙本质细胞分化的肽处理时，所述dspp基因的mrna水平均示出1.3倍以上的值。尤其，与dspp基因的mrna水平相比，组11的所有肽示出3倍以上的值，而与dspp基因的mrna水平相比，组12的所有肽则示出3.8倍以上的值。

而且，图1b为表示用促进成牙本质细胞分化的肽处理的mdpc-23细胞中，对作为成牙本质细胞分化标志的dspp基因的表达水平进行比较的结果的图表。从图1b可确认，用促进成牙本质细胞分化的肽处理时，作为成牙本质细胞分化标志的dspp基因的mrna水平增加，与图1a类似地，示出在对照组中测定的dspp基因的mrna水平的约1.3倍以上的值。

实施例2-3:检验肽对作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp、dmp1及nestin基因的表达水平产生的影响

从所述实施例2-2的结果可确认，促进成牙本质细胞分化的肽可增加dspp基因的mrna水平，尤其组11及12的肽可使dspp基因的mrna水平增加至少3倍以上。

据此，确认了所述组11及12的肽是否也能增加其他作为成牙本质细胞分化标志基因的dmp1及nestin基因的mrna水平。

大致上，除了使用下述各引物，并作为肽使用组11及12的肽之外，执行与所述实施例2-2相同的方法，测定促进成牙本质细胞分化的肽对dmp1及nestin基因的表达水平产生的效果，并比较按各组算出的平均水平(图1c)。此时，作为对照组，使用了未用促进成牙本质细胞分化的肽处理的mdpc-23细胞，作为比较组，使用了dspp基因的mrna水平。

dmp1_f:5'-cattctccttgtgttcctttggg-3'(序列号101)

dmp1_r:5'-tgtggtcactatttgcctgtg-3'(序列号102)

nestin_f:5'-ccctgaagtcgaggagctg-3'(序列号103)

nestin_r:5'-ctgctgcacctctaagcga-3'(序列号104)

图1c为表示用组11及12的肽处理的mdpc-23细胞中，对作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp、dmp1及nestin基因的表达水平进行比较的结果的图表。从图1c可确认，用促进成牙本质细胞分化的肽处理时，作为成牙本质细胞分化标志基因的dspp、dmp1及nestin基因的表达水平均增加，但按各基因呈现出增加水平上的差异，与组11的肽相比，组12的肽可使得增加到更高的水平。

众所周知，各所述分化标志基因是参与成牙本质细胞分化和牙本质的钙化过程的基因，因此分析出在本发明中提供的肽呈现出促进牙本质再生的效果。

实施例2-4:评价用于促进牙本质或牙髓组织的再生及治疗牙本质感觉过敏的肽对于牙髓组织细胞的细胞毒性

首先，就人牙髓干细胞而言，在首尔大学牙科医院，从10名成人(18-22岁)的智齿中分离了牙髓组织细胞。具体地，全部实验在得到临床研究评审委员会(hospital'sinstitutionalreviewboard)的认可后，并在获得患者的同意的情况下进行了实验，根据junghs等人(jmolhistol.(2011))的方法切割智齿来使牙髓露出，并利用镊子分离了牙髓组织。利用剃须刀刀片细切分离的所述牙髓组织，放入60mm平皿，利用盖玻片覆盖之后，在dmem培养基中进行培养，从而获得培养的牙髓组织细胞。

然后，在96孔板以每孔约3×10³细胞数来接种所获得的所述牙髓组织细胞，培养24小时之后，以10或50μg/ml浓度处理组11或12的肽，并重新培养1、3或5日。在所述培养结束之后，以pbs清洗所培养的细胞，并加入20μl的mtt溶液，之后，在约37℃下反应4小时。在反应结束之后，去除mtt溶液，加入100μl的dmso后，在540nm波长下测定了吸光度(图1d)。此时，作为对照组，使用了以未用所述肽处理条件下培养的牙髓组织细胞。

图1d为表示促进成牙本质细胞分化的肽对于牙髓组织细胞的细胞毒性进行评价的结果的图表。从图1d可确认，即使加入促进成牙本质细胞分化的肽，牙髓组织细胞的存活率也呈现与对照组相同的水平。

实施例3：用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的制备

步骤1:

将泊洛沙姆407添加于纯化水，并在搅拌机中搅拌约30分钟(搅拌条件：paddle15～20rpm，disperse400～500rpm)。

步骤2:

添加山梨酸钾、氯化十六烷基吡啶、木糖醇、乙酰磺胺酸钾、着色剂(蓝色1号)、d-山梨醇液、浓缩甘油后，在搅拌机中搅拌约30分钟(搅拌条件:paddle15～20rpm，disperse400～500rpm)。

步骤3:

将聚山梨酯20(tween20)、黄岑提取物、绿茶提取物、洋甘菊提取物、迷迭香提取物、薄荷香(hf-3585)加温后进行添加，在搅拌机中搅拌约30分钟(搅拌条件:paddle15～20rpm，disperse400～500rpm)

步骤4:

将促进成牙本质细胞分化的肽(序列号96)以约0.0001％而混合后，添加柠檬酸水合物并调节为ph5.5～6.0之间而制备。

【表25】

根据本发明的实施例3的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的组成表

用于使用在比较例的组合物的准备

比较例3-1:

准备如同实施例3的体积的纯化水。

比较例3-2:

制备了在实施例3的成分中除了纯化水之外，均同样含有使得不包含促进成牙本质细胞分化的肽(序列号96)的其余的成分。

实验例1:

观察根据实施例3的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管的透光率

一.切割牙齿，使牙本质小管露出

利用钻石锯横向切割拔出的人的牙齿的齿冠部，使得露出牙本质小管之后，约在5分钟之内以磷酸盐缓冲溶液清洗2次。

二.清洗切割的牙齿

使前述切割的牙齿与0.5m的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,edta,ph7.4)溶液反应约5分钟后，在约5分钟之内以磷酸盐缓冲溶液清洗2次。

三.将荧光染色试剂添加于根据实施例3的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物

在含有促进成牙本质细胞分化的肽(序列号96)的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物中添加荧光染色试剂而使得包含0.1％的荧光染色试剂，充分混合之后，使牙本质小管露出的切割牙齿反应约1分钟。

四.观察用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的渗透程度

在约5分钟之内，将反应后的切割牙齿在磷酸盐缓冲溶液中清洗2次之后，为了使所切割牙齿的牙本质小管看上去长，利用钻石锯约以0.5mm厚度纵向切割，之后以荧光显微镜观察渗透程度(参照图2)。

实验例2:

观察根据实施例3的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管封闭能力

一.人工唾液的制备

人工唾液的组成如下表26。

※在纯化水中，以实现下述表2的各成分的最终浓度的方式进行添加并进行混合，最后添加磷酸钾(k2hpo4)。

※人工唾液的ph被测定为在与人的唾液类似的7.2附近。

【表26】

二.牙本质小管样品的制备

利用钻石锯来横向切割所拔出的人的牙齿，从而制备厚度为1mm的牙本质小管露出的牙本质样品。

※就牙本质样品而言，为了使牙本质小管完全露出，与约32％的磷酸(phosphoricacid)溶液反应约5分钟之后，在约5分钟之内以纯化水清洗3次。然后，牙本质样品在超声波清洗机中在约5分钟之内清洗了6次，从而使牙本质小管完全露出。

之后，以磷酸盐缓冲溶液清洗3次后保管。

三.观察用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管封闭能力

利用根据实施例3的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物，与牙本质小管样品反应约1分钟，之后与人工唾液反应约24小时。

重复此过程2周之后，用蒸馏水清洗3次，而后进行干燥，并用扫描电子显微镜(日本东京日立s-4700(s-4700，hitachi,tokyo,japan))观察牙本质小管的封闭程度(图3的g-i)。

比较实验例2-1:

利用在比较例3-1制备的纯化水，与牙本质小管样品反应约1分钟，之后与人工唾液反应24小时。

重复此过程2周之后，用蒸馏水清洗3次，而后进行干燥，并用扫描电子显微镜观察牙本质小管的封闭程度(图3的a-c)。

比较实验例2-2:

利用在比较例3-2中制备的口腔清洁用组合物，与牙本质小管样品反应约1分钟，之后与人工唾液反应约24小时。

重复此过程2周之后，用蒸馏水清洗3次，而后进行干燥，并用扫描电子显微镜观察牙本质小管的封闭程度(图3的d-f)。

根据所述实施例1，用荧光显微镜观察根据实施例3的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管透光率的结果，如图2，在含有促进成牙本质细胞分化的肽的口腔清洁用组合物，在已处理的牙齿的情况下，在牙本质表面观察到很强的荧光。不仅如此，沿着露出的牙本质小管的下方，观察到荧光染色试剂的渗透。

然后，比较所述实验例2和比较实验例2-1及2-2的结果如图3所示。图3图示了对于比较例3-1及比较例3-2和根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的牙本质小管封闭能力进行比较的结果，更详细地，a-c图示了仅以纯化水处理的牙本质的牙本质小管(比较例3-1)，d-f图示了在根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物的构成中，与未含有肽的口腔清洁用组合物进行反应的牙本质小管(比较例3-2)，g-i图示了与根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物进行反应的牙本质小管(比例尺：a、d、g为100μm；b、e、h为20μm；c、f、i为10μm)。

通过图3可知，能够观察到与根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物进行反应的牙本质的牙本质小管发生再矿化，从而牙本质小管得到封闭。

图4放大了通过根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物而使牙本质小管被封闭的部分，从而图示了在封闭的牙本质小管和牙本质表面发生再矿化的结果。

参照图4，可更详细地观察通过实验例3的牙本质小管形态，可确认在牙本质小管和牙本质表面均发生再矿化。根据本发明的实施例的用于缓解感觉过敏的口腔清洁用组合物，在牙本质形成薄膜的同时，与存在于牙本质小管内及唾液中的磷酸-钙离子结合得很强，诱导露出的牙本质小管及牙本质表面再矿化，由此而有效地封闭牙本质小管。即，根据本发明的实施例的用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物，不仅在露出的牙本质小管的表面，而且在牙本质小管内部也诱导再矿化，从而可呈现出缓解和/或预防敏感性牙齿症状的效果。

在本说明书和附图中公开了本发明的优选实施例，虽然使用了特定的术语，但这仅仅是为了容易地说明本发明的技术内容并有助于理解发明而以一般的含义进行了使用，而并非用于限定本发明的范围。除了在此公开的实施例之外，也可实施基于本发明的技术思想的其他变形例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员是显而易见的。

"本研究为基于2017年度中小风险企业部的技术开发事业支援的研究[s2462696]"

<110>海森斯柏奥公司

<120>用于缓解牙本质感觉过敏的口腔清洁用组合物

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>83

lystyrlysglnargarglysasntyrlys

1510

<210>84

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>84

lystyrlysglnargargargasntyrlys

1510

<210>85

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>85

lystyrlysglnlyslyslysasntyrlys

1510

<210>86

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>86

lystyrlysglnlysarglysasntyrlys

1510

<210>87

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

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lystyrlysglnlyslysargasntyrlys

1510

<210>88

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>88

lystyrlysglnlysargargasntyrlys

1510

<210>89

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>89

lystyrlysglnarglyslyssertyrlys

1510

<210>90

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>90

lystyrlysglnarglysargsertyrlys

1510

<210>91

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>91

lystyrlysglnargarglyssertyrlys

1510

<210>92

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>92

lystyrlysglnargargargsertyrlys

1510

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<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>93

lystyrlysglnlyslyslyssertyrlys

1510

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<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

<400>94

lystyrlysglnlysarglyssertyrlys

1510

<210>95

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

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lystyrlysglnlyslysargsertyrlys

1510

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<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>新型肽

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lystyrlysglnlysargargsertyrlys

1510

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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<220>

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>104

ctgctgcacctctaagcga19