人类抗CD47抗体及其用途的制作方法

本发明有关抗cd47抗体。

背景技术：

cd47为一细胞膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，其含有一具有5个跨膜结构域的细胞外n端ig可变(igv)结构域，及一短型c端细胞内尾部。截至目前为止，已鉴定出四个cd47可变剪接异构型，其细胞质尾部长度不同[brown,e.(2001)jclininvest107(12):1499-500；reinhold,m.i.,etal.(1995)jcellsci108(part11):3419-25]。最近的研究证实，cd47为sirp-α的配体，其表现在免疫系统的吞噬细胞(phagocyticcells)上，包括巨噬细胞、树突细胞、及嗜中性球[tsaietal.(2008)jcellbiol180(5):989-1003]。现已显示，cd47-sirp-α交互作用轴参与数个细胞过程，包括细胞凋亡[wangetal.(2016)jdentres95(6):697-703]、增生[sicketal.(2011)glia59(2):308-19；kauretal.(2013)scirep3:1673]、黏着、及迁移[rebresetal.(2005)jcellphysiol205(2):182-93；sicketal.(2012)brjpharmacol167(7):1415-30]。此外，研究亦显示，cd47-sirp-α交互作用在血管生成过程中亦扮演重要角色[zhangetal.(2015)brainres1623:74-80；chaoetal.(2012)curropinimmunol24(2):225-32]。

cd47普遍表现在所有的人类细胞，并显示在多个肿瘤细胞中过度表现。的确，在至今研究的多数人类癌症中，包括急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病[jaiswaletal.(2009)cell138(2):271-85]、急性淋巴性白血病(all)[chaoetal.(2011)cancerres71(4):1374-84]、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)[chaoetal.(2010)cell142(5):699-713]、多发性骨髓瘤(mm)[rendtlewetal.(2007)brjhaematol138(6):756-60]、膀胱癌、及其他实体瘤(chanetal.(2009)procnatlacadsciusa106(33):14016-21)，过度表现表面cd47，使得cd47成为治疗人类癌症的通用标靶。已有研究显示高浓度的cd47使得癌细胞避免由于吞噬细胞上的sirp-α与cd47的结合而引起吞噬作用(phagocytosis)。cd47与sirp-α之间的交互作用，提供吞噬细胞“别吃我”的信号，且随后防止吞噬性消除癌细胞及抑制t细胞免疫反应[oldenborgetal.(2000)science288(5473):2051-4；blazaretal.(2001)jexpmed194(4):541-9.]。由于肿瘤细胞过度表现cd47以逃避宿主免疫系统的监视，因此cd47靶向治疗旨在恢复目前临床上积极测试的肿瘤细胞清除效果。

目前正在开发中的许多靶向cd47-sirp-α轴的治疗剂，包括抗cd47抗体、经基因工程的诱饵受体(decoyreceptor)、抗sirp-α抗体、及双特异性试剂。在投予时，抗cd47抗体或衍生物选择性地抑制cd47与sirp-α之间的交互作用。cd47-sirp-α交互作用的阻断，消除sirp-α介导的对吞噬细胞的抑制信号，并导致诸如巨噬细胞活化及肿瘤细胞的吞噬作用[chaoetal.(2011)cancerres71(4):1374-84；chaoetal.(2010)cell142(5):699-713；majetietal.(2009)cell138(2):286-99；chaoetal.(2010)scitranslmed2(63):63ra94]。此外，以抗体阻断cd47传递的传讯，亦活化抗肿瘤t淋巴球免疫反应及t细胞介导的表现cd47的肿瘤细胞的杀伤能力[matozakietal(2009)trendscellbiol19(2):72-80；latouretal.(2001)jimmunol167(5):2547-54]。

技术实现要素：

据此，本发明提供新颖的人类cd47阻断抗体，其由癌症病患抗体fab库鉴定，下文称作抗cd47抗体。

在一方面，本发明提供一经分离的人类抗cd47抗体，或其抗原结合片段，其包含：(a)一重链可变(vh)区，包含一选自于由seqidnos:1、3、5、7、9、11、及13所组成群组的胺基酸序列；(b)一l链区，其具有一选自于由seqidnos:2、4、6、8、10、12、及14所组成群组的胺基酸序列；或者(c)一经重新格式化的h链区，其具有一选自于由seqidnos:15、16、17、18、19、20、及21所组成群组的胺基酸序列。

在本发明的一实例中，抗体或其抗原结合片段阻断cd47与信号调节蛋白α(sirp-α)的交互作用。

在另一方面，本发明提供igg4经重新格式化的cd47抗体，其从抗cd47抗体制备与获得。

在本发明的一实例中，igg4经重新格式化的cd47阻断抗体经确认能有效治疗癌症，因本发明发现，在体外，igg4经重新格式化的cd47阻断抗体可治疗癌细胞(如jurkat-1或hl60细胞)且诱导由经极化的thp-1巨噬细胞及周边血液单核细胞(pbmc)证实的强烈吞噬活性，而非经测试的癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)与细胞凋亡。

在又一方面，本发明提供一用于治疗癌症的方法，其包含投予有需求的个体一治疗上有效量的抗cd47抗体。

在一具体实施例中，欲治疗的哺乳类动物癌症选自于由急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、头颈鳞状细胞癌、卵巢癌、及结肠癌组成的群组。

在更一方面，本发明提供一医药组成物，其包含一治疗上可接受量的抗cd47抗体及一或多个医药上可接受的载体。具体而言，医药组成物可有效治疗癌症。

在本发明的实例中，抗cd47抗体包含一重链可变(vh)区，其具有一选自于由seqidnos:1、3、5、7、9、11、及13所组成群组的胺基酸序列。

在本发明的实例中，抗cd47抗体包含一轻链区，其具有一选自于由seqidnos:2、4、6、8、10、12、及14所组成群组的胺基酸序列。

在本发明的实例中，抗cd47抗体包含一重链区，其具有一选自于由seqidnos:15、16、17、18、19、20、及21所组成群组的胺基酸序列。

在又一方面，本发明提供一结合至cd47的片段，其包括本发明抗体的fab、fab’、f(ab)2、f(ab’)2、或scfv。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中图示出了目前较佳的实例。然而，应该理解，本发明不仅限于所示的精确布置和手段。

图1显示经纯化的igg4重新格式化的cd47抗体的凝胶分析；其中利用蛋白质-g层析术，从培养基上清液纯化hek293f短暂表现的cd47抗体，且在还原与非还原条件下，以page-凝胶分析经纯化的抗体(～2μg/道)，并利用考马斯蓝染色观察(m：蛋白质分子量标记；1：在非还原条件下的cd47抗体；2：在还原条件下的cd47抗体)。

图2提供经纯化的抗体结合至cd47-fc蛋白质(r&dsystems，usa)的elisa试验结果。图2a显示经纯化的抗体对cd47-fc蛋白质的直接elisa结合试验的结果；其中经纯化的抗体与hu5f9-g4显示可特异地结合至cd47-fc蛋白质，而非sirp-α。图2b显示经纯化的抗体对cd47-fc蛋白质的滴定elisa分析；其中经纯化的抗体与hu5f9-g4显示以剂量依赖性方式结合重组型cd47，其中经纯化的cd47抗体具有可变的结合活性。

图3显示使用抗cd47抗体的细胞表面cd47结合的流式细胞术分析；其中利用流式细胞术的分析，来自库的抗cd47抗体以剂量依赖性方式结合至细胞表面cd47；以及jurkat-1细胞(图3a)或hl-60细胞(图3b)以抗cd47抗体、hu5f9-g4抗体、经纯化的人类igg4异构型对照组染色及以流式细胞术分析表面结合作用，且以fitc共轭结合的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)用于检测。

图4显示利用流式细胞仪的细胞表面cd47与重组型cd47-fc蛋白质之间的抗体结合竞争分析；其中jurkat-1细胞在20μg/mlcd47-fc融合蛋白质不存在下(右边尖峰)或存在下(左边尖峰)以抗cd47抗体(1μg/ml)染色并利用流式细胞术分析表面结合作用；且以fitc共轭结合的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)用于检测。将hu5f9-g4纳入比较，并以经纯化的人类igg4作为阴性对照组(上左图)。使用选择的cd47抗体、hu5f9-g4、或人类igg4异构型对照组，显示代表性的流式分析。

图5显示利用抗cd47抗体阻断cd47-sirp-α交互作用。在不存在或存在浓度增加的抗cd47抗体或作为对照组的hu5f9-g4之下，利用elisa检测人类cd47-fc结合至sirp-α预涂布的培养孔。抗cd47抗体与hu5f9-g4，具有不同程度的活性，可阻断cd47与sirp-α的交互作用。

图6显示使用经极化的thp-1巨噬细胞或pbmc，抗cd47抗体可增进hl-60或jurkat-1细胞的抗体依赖性吞噬作用活性。抗cd47抗体、cwp1a1、cwp2e8、brp1f3、brp1f11、及hu5f9-g4能明显增进经极化的thp-1-或pbmc介导的对经抗体处理的细胞的吞噬作用。

图7显示抗cd47抗体不引发adcc。使用以raji细胞作为标靶的adccreporterbioassaycompletekit(promega，usa)。效应子与标靶细胞以6比1比率与如图中所示(x轴)的不同浓度的hu5f9-g4、cwp1a1-igg4、或brp1f11-igg4培养6小时。亦纳入具有人类igg1fc片段的cwp1a1-igg1与huigg4以作为对照组。

图8显示jurkat-1或hl-60细胞在抗cd47抗体存在下的细胞凋亡试验。将细胞与10ug/ml的抗cd47抗体、hu5f9-g4、或igg4异构型对照组一起培养。利用膜联蛋白-v染色鉴定凋亡细胞，并以流式细胞术分析。处理抗cd47抗体或hu5f9-g4不会诱导jurkat-1或hl-60细胞的细胞凋亡。

图9显示rbc表面抗原结合试验(a)及rbc凝集试验(b)。人类抗cd47抗体(cwp1a1、cwp2f12、及brp1f11)以剂量依赖性方式结合至rbcs的表面cd47。此外，cwp1a1与brp1f11不会诱导人类rbcs的血球凝集作用。

图10显示hl-60小鼠异种移植模型中人类抗cd47抗体、cwp1a1、及brp1f11的抗肿瘤活性。雄性scid小鼠的右侧腹部以皮下注射100μlmatrigel加上1.0x10⁷个hl-60细胞，随后每周腹腔注射三次异构型对照组抗体(400μg/小鼠)hu5f9-g4，或人类抗cd47抗体brp1f11-g4与具有cwp1a1的igg1或igg4异构型(400μg/小鼠)，持续三周。cwp1a1-g1、cwp1a1-g4、及brp1f11-g4抗体对hl60异种移植物呈现明显抗肿瘤活性。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术性与科学性术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常能理解的相同含义。

如本文使用，“抗体”一词意指由四个多胜肽链组成的免疫球蛋白分子，包括由双硫键相互连接的二个重(h)链与二个轻(l)链。抗体可包括完整的免疫球蛋白及本领域已知的抗体的变体与部分。在本发明中，提供一结合至cd47的片段，包括本发明抗体的fab、fab’、f(ab)2、f(ab’)2、或scfv。

如本文使用，“fc”一词为与细胞表面受体交互作用的抗体尾部区域。此性质容许抗体活化免疫系统。与fab相反的是，所有抗体的一类fc区在各物种中皆相同；其是恒定而非可变。

如本文使用，“抗原结合片段(fragmentantigen-binding)”或“fab”等词意指一抗体上的抗原结合片段，其结合至抗原。fab片段为一仍结合至抗原但为单价且无fc部分的抗体结构。fab由重链与轻链的每一者的一恒定结构域与一可变结构域组成，其中可变结构域含有抗原结合位点，其包含在单体的胺基末端的一组互补决定区。由木瓜酵素消化的抗体产生二个各约50kda的fab片段与一fc片段。

“f(ab')2”一词于本文使用意指一片段抗体，其由胃蛋白酶消化整个igg抗体产生，以移除大部分的fc区，同时保留一些铰链区的完整性。f(ab')2片段具有通过双硫键连接在一起的二个抗原结合f(ab)部分，因此为二价，其中分子量为约110kda。

如本文使用，“单链可变片段”或“scfv”等词意指一抗体或一免疫球蛋白的重链与轻链的可变区的融合蛋白质，其以一短的连接符胜肽(如具有10至25个胺基酸的连接符)相连接。尽管恒定区移除且连接符导入，此单链可变片段保留原始抗体的特异性。

如本文使用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)”一词意指一免疫机制，通过该机制，携带fc受体的效应子细胞可辨识并杀死涂布抗体的标靶细胞，其表面上表现肿瘤或病原体衍生的抗原。

本发明提供特异地结合至人类cd47的抗cd47抗体，且阻断cd47与sirp-α的交互作用。依据实施例8与实施例9所示的分析，本发明的抗cd47抗体能增进巨噬细胞介导的吞噬作用且不会诱导细胞凋亡。

依据本发明，抗cd47抗体特异地结合至人类与小鼠cd47。

依据本发明，抗cd47抗体包含一重链可变(vh)区，其具有一选自于由seqidnos:1、3、5、7、9、11、及13所组成群组的胺基酸序列。

依据本发明，抗cd47抗体包含一l链区，其具有一选自于由seqidnos:2、4、6、8、10、12、及14所组成群组的胺基酸序列。

依据本发明，抗cd47抗体为一含有选自于由：

一具有如seqidno:1所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:2所示的胺基酸序列的l链区；

一具有如seqidno:3所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:4所示的胺基酸序列的l链区；

一具有如seqidno:5所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:6所示的胺基酸序列的l链区；

一具有如seqidno:7所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:8所示的胺基酸序列的l链区；

一具有如seqidno:9所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:10所示的胺基酸序列的l链区；

一具有如seqidno:11所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:12所示的胺基酸序列的l链区；以及

一具有如seqidno:13所示的胺基酸序列的vh区，及一具有如seqidno:14所示的胺基酸序列的l链区，

所组成群组的胺基酸。

此外，本发明的抗cd47抗体包含一经重新格式化的h链，其具有一选自于由seqidnos:15、16、17、18、19、20、及21所组成群组的胺基酸序列。

下表列出胺基酸序列：

表1.从库筛选的抗cd47fabs结合体的胺基酸序列。

表2.igg4重新格式化的cd47抗体的重链的胺基酸序列。

依据本发明，抗cd47抗体为一含有选自于由：

一具有选自于由seqidno:15所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:2所组成群组的胺基酸序列的l链区；

一具有选自于由seqidno:16所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:4所组成群组的胺基酸序列的l链区；

一具有选自于由seqidno:17所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:6所组成群组的胺基酸序列的l链区；

一具有选自于由seqidno:18所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:8所组成群组的胺基酸序列的l链区；

一具有选自于由seqidno:19所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:10所组成群组的胺基酸序列的l链区；

一具有选自于由seqidno:20所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:12所组成群组的胺基酸序列的l链区；以及

一具有选自于由seqidno:21所组成群组的胺基酸序列的h链区，及一具有选自于由seqidno:14所组成群组的胺基酸序列的l链区，

所组成群组的胺基酸。

在本文件中，参考下列代表性的本发明抗cd47抗体。cwp1a1代表一具有相应于seqidno:15的h链区及一相应于seqidno:2的l链区的抗体。cwp1c4代表一具有相应于seqidno:16的h链区及一相应于seqidno:4的l链区的抗体。cwp2e8代表一具有相应于seqidno:17的h链区及一相应于seqidno:6的l链区的抗体。cwp2f8代表一具有相应于seqidno:18的h链区及一相应于seqidno:8的l链区的抗体。cwp2f12代表一具有相应于seqidno:19的h链区及一相应于seqidno:10的l链区的抗体。brp1f3代表一具有相应于seqidno:20的h链区及一相应于seqidno:12的l链区的抗体。brp1f11代表一具有相应于seqidno:21的h链区及一相应于seqidno:14的l链区的抗体。

在本发明中，抗cd47抗体促进巨噬细胞介导的吞噬cd47表现细胞。

在本发明中，抗cd47抗体不会诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或细胞凋亡活性。

在本发明中，抗体可包含一选自于由igg1异构型与igg2异构型所组成群组的igg异构型。

在本发明中，抗体可制成一igg4经重新格式化的cd47抗体。

在一具体实施例中，本发明提供一用于治疗癌症的方法，其包含投予有需求的个体一治疗上有效量的抗cd47抗体。

在一具体实施例中，欲治疗的抗cd47的哺乳类动物癌症选自于由急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、头颈鳞状细胞癌、卵巢癌、及结肠癌组成的群组。

在进一步的具体实施例中，本发明提供一医药组成物，其包含一治疗上可接受量的抗cd47抗体及一或多个医药上可接受的载体。具体而言，医药组成物可有效治疗癌症。

在本发明的一具体实施例中，以商业上可购的重组型cd47蛋白质(r&dsystems，usa)筛选一研究用抗体fab库，trb800-01，以分离对cd47的完全人类抗体。以从含有16x口服、22x食管、及15x前列腺癌(irbno.vghks17-ct11-13)且容量为～1x10¹⁰的临床上经诊断的病患中收集的血液样本建构trb800-01。

在本发明的另一具体实施例中，经由淘选(panning)，经溶析的噬菌体的效价明显增加，代表cd47特异性结合体富集。利用对cd47蛋白质的直接elisa分析，进一步确认从第3轮淘选中随机选出的384个殖株，且选择od450大于0.5的阳性结合体进行定序分析。鉴定出7个独特丛集，并选择进行重新格式化为全长的人类igg4，以在freestyle^tm293-f系统(invitrogen，usa)中使用hek293细胞表现，并进一步确认。

利用下列实施例进一步说明本发明，其应理解为仅具说明性且不以任何方式局限本发明的其余部分。在没有进一步说明的情况下，据信本领域的技术人员将能基于本文的说明充分使用本发明。

实施例1.针对重组型cd47蛋白质的人类抗体fab库筛选

从经选择的癌症病患血液(其多样性～10¹⁰)中建构人类抗体fab库。简言之，如下述，进行抗体库的cd47抗体的鉴定。在4℃下，elisa孔以500ng/孔(溶于pbs)的人类cd47-fc蛋白质(r&dsystems，usa)涂布16小时。在阻断之后，将～10¹⁰噬菌体加入，并在室温下的振荡器上培养1小时。移除未结合的噬菌体，且培养孔以含有0.05％tween-20(pbs-t)的pbs清洗10次。在清洗之后，加入100μl的0.1mtea溶液(sigma，usa)冲提结合的噬菌体，并以50μl的1mtris-hcl，ph7.4中和。随后，将经冲提的噬菌体用于感染对数期tg-1细胞，分盘在含有抗生素与葡萄糖的1.5％琼脂盘上，并在30℃培养整夜。在隔天早上，以经解体的(scrapped)细菌(30od600)用于噬菌体拯救，其使用m13hyperphages(progen，germany)。在离心之后，经拯救的噬菌体以peg沉淀，并在pbs中重构、滴定，且用于下一轮淘选。将淘选过程额外重复两次。在最后一轮筛选之后，选择单独的殖株，培养并以1mmiptg诱导，以产生fab。利用针对cd47-fc蛋白质的elisa，分析含有源自各单独殖株的经表现的fabs的上清液，以鉴定结合体。

实施例2.cd47结合体定序分析与重新格式化

选择od450>0.5的elisa阳性结合体以进行定序分析。经鉴定的cd47结合体的重链经基因工程为一人类igg4框架，以最小化fc依赖性效应子功能(如adcc与cdc)的募集。轻链与重链可变(vh)区的胺基酸序列，及经鉴定的cd47结合体的经重新格式化的全长重链序列(以igg4异构型形式)列于表1与表2。随后，将单独的经重新格式化的cd47抗体重链与相应的轻链次选殖至个别的pci-neo载体(promega，usa)，用于成对的hek293转染、表现、纯化、及确认。

实施例3.抗体表现与纯化

hek293细胞与freestyle^tm293expressionmedium(invitrogen，usa)用于产生重组型抗体。依据制造商的说明(invitrogen，usa)进行短暂转染。欲纯化抗体，将培养基上清液施加于pierce蛋白质g琼脂糖树脂(thermofisher，usa)，并对pbs透析。在还原或非还原条件下，4-12％boltbis-trisplus凝胶(invitrogen，usa)上以sds-page分析经纯化的抗体，并以考马斯亮蓝染色(invitrogen，usa)观察结果。

图1的结果显示，所有的igg4经重新格式化的抗cd47抗体皆适当地表现与产生。同时，利用蛋白质-g层析术，获得大于90％纯度的各单独的抗体。

实施例4.cd47结合研究

欲检查与确认结合特异性，首先以直接elisa试验验证经纯化的抗cd47抗体。简言之，在4℃下，96孔elisa培养盘(nunc，denmark)以1μg/ml的重组型cd47-fc或sirp-α(r&dsystems，usa)涂布16小时。在室温下，cd47或sirp-α预涂布的培养孔以溶于pbs的5％脱脂奶粉阻断1小时，接着加入100ul的0.5μg/ml人类抗cd47抗体，并在室温下震荡培养1小时。在培养与清洗之后，将100μl的1:2500稀释的hrp共轭结合的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)加入各培养孔中，并在室温下培养1小时。在最终清洗之后，利用tmb溶液(invitrogen，usa)检测经结合的抗体。利用加入50μl的1mhcl终止反应，并在od450nm下读取各孔的吸亮度。

图2a的结果指出，虽然结合活性因殖株而异，所有候选抗体与hu5f9-g4显示对重组型cd47具有特异性，且对sirp-α蛋白质(r&dsystems，usa)不具有交叉反应性。hu5f9-g4为一靶向cd47的人源化抗体，其在体外与体内具有非凡的生物活性，可作为比较用的阳性对照组。

使用滴定elisa试验，以检查彼等候选抗体的结合活性。在滴定elisa试验方面，培养孔在4℃下以1μg/ml的重组型cd47-fc涂布16小时。在室温下，cd47欲涂布培养孔以溶于pbs的5％脱脂奶粉阻断1小时，随后加入100ul1:3系列稀释的抗cd47抗体，其始于30nm，并在室温下震荡培养1小时。在培养与清洗之后，将100ul的1:2500稀释的hrp共轭结合的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)加入各孔，并在室温下培养1小时。在最终清洗之后，利用tmb溶液(invitrogen，usa)检测经结合的抗体。以1mhcl终止反应，并在od450nm下读取各孔的吸亮度。随后，利用graphpadsoftware，计算各经测试的cd47抗体的ec50(半最大吸亮度所需的抗体浓度)。

如图2b所示，所有经测试的抗cd47抗体以剂量依赖性方式结合至重组型cd47，且经测定的hu5f9-g4、cwp1a1、cwp1c4、cwp2e8、cwp2f8、cwp2f12、brp1f3、及brp1f11的ec50分别为0.1442nm、0.1835nm、0.2271nm、0.4694nm、0.3264nm、0.4413nm、10.1nm、及1.21nm。

实施例5.细胞表面抗原结合试验

在本发明的一具体实施例中，利用流式细胞仪，以细胞表面cd47结合作用检查重组型与天然的cd47蛋白质之间是否有差异。抗cd47抗体随浓度增加的结合活性可抗jurkat-1或hl-60细胞(bcrc，中国台湾)上的细胞表面cd47。在细胞表面抗原结合试验方面，在4℃下，将1×10⁵个jurkat-1细胞(bcrc，中国台湾)与0.001、0.01、0.1、1、10、或100μl/ml的抗cd47抗体培养在100μl中15min。在培养之后，细胞以冰冷的染色缓冲液(1xpbs+2％fbs+0.05％nan3)清洗三次，接着以fitc共轭结合的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)培养。最后，细胞以bdaccuri^tmc6plus流式细胞仪(bdbiosciences，usa)清洗与分析。将平均荧光强度(mfi)数值绘图。

由图3收集的结果显示，在经测试的两细胞株中，抗cd47抗体与hu5f9-g4的细胞表面结合具有剂量依赖性，而人类igg4异构型对照组(biolegend，usa)则否。

实施例6.利用流式细胞术的cd47结合作用竞争试验

在本发明的另一具体实施例中，通过使用流式细胞术的抗体结合作用竞争试验，在有或无过量的重组型cd47-fc蛋白质之下，进行抗cd47抗体针对天然cd47的结合特异性。在4℃下，不存在或存在10μg/ml重组型cd47-fc蛋白质时，将1×10⁵个jurkat-1细胞与1μg/ml的人类抗cd47抗体培养15分钟。其后，在以bdaccuri^tmc6plus(bdbiosciences，usa)流式细胞仪分析之前，细胞经清洗并以fitc共轭连接的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)染色。

图4显示，抗cd47抗体与hu5f9-g4的表面cd47结合活性显示可因存在10μg/ml的cd47-fc融合蛋白质而阻断，代表所有经测试的抗体对cd47的特异性结合作用。

实施例7.cd47-sirp-α交互作用阻断试验

利用elisa试验测试重组型抗cd47抗体的cd47-sirpα交互作用阻断活性。在4℃下，elisa培养孔(nunc，denmark)以1μg/ml的重组型人类his标记的sirp-α蛋白质(r&dsystems，usa)涂布16小时。在阻断之后，加入1μg/ml的重组型cd47-fc蛋白质与3倍系列稀释的抗cd47抗体，其始于30nm，并在室温下培养1小时。在培养之后，清洗培养孔并以hrp共轭结合的山羊抗人类fc抗体(1:2500稀释，jacksonimmunoresearch，usa)培养1小时。在最终清洗之后，以tmb受质检测经结合的cd47-fc蛋白质。利用加入1mhcl终止反应，并获得od450读值。利用graphpadsoftware，计算各经测试的cd47抗体的ic50(抑制半最大吸亮度所需的抗体浓度)。

抗cd47抗体如图5所示能阻断重组型人类cd47与重组型人类sirp-α之间的交互作用。hu5f9-g4、cwp1a1、cwp1c4、cwp2e8、cwp2f8、及cwp2f12的经计算的ic50分别为0.063nm、0.053nm、0.155nm、0.556nm、0.068nm、及0.063nm。此研究的结果显示cwp1a1、cwp2f8、及cwp2f12具有类似于或比hu5f9-g4更好的阻断活性。

实施例8.体外抗体介导的吞噬作用试验

随后，检查是否cd47与sirp-α交互作用阻断性抗体能诱导cd47⁺癌细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。体外吞噬作用试验的进行简易地如下所述。利用pma、lps(sigma，usa)、及ifn-γ(r&dsystems，usa)，诱导thp-1(bcrc，中国台湾)单核细胞分化成巨噬细胞。随后，经极化的thp-1细胞在使用之前以celltrackerred(ctr,lifetechnology，usa)染色。在5μg/ml异构型对照组抗体、hu5f9-g4、或人类抗cd47抗体(igg4)的存在下，cfse标记的人类细胞jurkat-1或hl-60细胞(bcrc，中国台湾)在37℃下与经极化的thp-1巨噬细胞培养3小时。细胞在流式细胞术分析之前清洗，以确定吞噬指数(每100个巨噬细胞摄入的细胞数量)。以50ng/mlrhm-csf(peprotech，usa)处理7天，诱导pbmc衍生的巨噬细胞，并利用抗cd14抗体(abcam，usa)染色确认。在10μg/ml异构型对照组抗体、hu5f9-g4、或人类抗cd47抗体存在下，cfse标记的hl-60细胞与巨噬细胞在37℃下培养2小时。随后，细胞以流式细胞术分析，以确定吞噬指数。

以hl-60aml与jurkat-1all细胞作为标靶细胞。利用经极化的thp-1细胞及人类周边血液衍生的巨噬细胞检查吞噬活性。利用流式细胞术测定吞噬活性。如图6a-c所示，通过经极化的thp-1与pbmc衍生的巨噬细胞，人类抗cd47抗体与hu5f9-g4明显促进肿瘤细胞的吞噬作用。

实施例9.adcc试验

欲评估是否人类cd47抗体除了吞噬作用以外亦引发adcc，利用adcc报导子生物试验，检查具有igg4框架的cwp1a1-igg4、brp1f11-igg4、及hu5f9-g4的adcc活性。在此研究中，具有人类igg1fc片段的cwp1a1-igg1与huigg4亦分别纳入作为对照组。依据制造商的说明，使用以raji细胞作为标靶的adccreporterbioassaycompletekit(promega，usa)。效应子与标靶细胞以6比1比率与如图中所示(x轴)的不同浓度的huigg4、hu5f9-g4、cwp1a1-igg1、cwp1a1-igg4、或brp1f11-igg4培养6小时。在培养之后，添加bio-glo荧光素酶试验试剂，并读取冷光。样本以二重复进行，且将二重复数值的平均值绘图，其中误差条代表平均值的标准误差(sem)。

图7所示的结果指出，cwp1a1-igg1能以剂量依赖性方式诱导adcc活性。反之，cwp1a1-igg4、brp1f11-igg4、hu5f9-g4、及huigg4不会诱导adcc。总的来说，trb人类cd47抗体、cwp1a1-igg4、及brp1f11-igg4的作用机制不会诱导adcc或细胞凋亡，而是活化抗体依赖性细胞吞噬作用。

实施例10.细胞凋亡试验

进行细胞凋亡试验，以检查抗cd47抗体结合至cd47是否直接地诱导癌细胞的细胞凋亡。人类细胞jurkat-1、hl-60、或raji细胞以1x10⁶个细胞/ml再悬浮于含有10％fbs的rpmi-1640培养基。将10μg/ml异构型对照组、2d3、hu5f9-g4、或人类抗cd47抗体(igg4)加入，且细胞在37℃下培养3小时。在hl-60细胞株的情况中，以星形孢菌素(staurosporine)作为阳性对照组。依据制造商的说明(bdbiosciences，usa)，以膜联蛋白-v与pi染色鉴定凋亡细胞，并以流式细胞术分析。

如图8a所示，发现与异构型对照组类似的是，经测试的抗cd47抗体与hu5f9-g4不会诱导jurkat-1细胞的细胞凋亡。图8b显示，不同于以星形孢菌素的处理，人类抗cd47抗体不会诱导hl-60细胞的细胞凋亡。以raji细胞进行试验亦获得类似结果(数据未显示)。总的来说，发明人的结果指出，抗人类cd47抗体诱导吞噬作用而非细胞凋亡活性。

在本发明中，具有治疗潜力的抗cd47抗体目前在异种移植动物模型中测试其对急性骨髓性白血病与实体瘤的功效。

实施例11.rbc表面抗原结合试验与rbc凝集试验

在rbc表面抗原结合试验方面，利用流式细胞仪测定细胞表面cd47结合活性。使用密度梯度离心法，通过ficoll-paqueplus(sigma，sweden)分离人类红血球细胞。在4℃下，将经纯化的人类rbcs与1、10、及100μg/ml的抗cd47抗体(igg4)培养在100μl中15min。在培养之后，细胞以冰冷的染色缓冲液(1xpbs+2％fbs+0.05％nan3)清洗三次，接着以fitc共轭结合的山羊抗人类fc抗体(jacksonimmunoresearch，usa)培养。细胞以bdaccuri^tmc6plus流式细胞仪(bdbiosciences，usa)清洗与分析。将平均荧光强度(mfi)数值绘图。在rbc凝集试验方面，人类rbcs首先稀释在pbs中，接着以多个抗体浓度加入96孔圆底培养盘(thermo，denmark)中。培养盘在37℃下培养4小时。将非经血液凝集的rbcs定义为断续点(punctuatedot)，且利用imagej软件计算ha指数。

如图9a所示，人类抗cd47抗体(cwp1a1、cwp2f12、及brp1f11)以剂量依赖性方式结合至rbcs的表面cd47。图9b显示，cwp1a1与brp1f11不会诱导人类rbcs的血球凝集作用。反之，hu5f9-g4(为一临床检查时的抗cd47抗体)诱导严重的rbc血球凝集作用。结果指出，在rbcs的血球凝集作用方面，抗cd47抗体、cwp1a1、及brp1f11可具有比hu5f9-g4更好的安全性轮廓。

实施例12.使用小鼠异种移植模型的体内抗cd47抗体功效评估

雄性scid小鼠(biolasco，中国台湾)的右侧腹部以皮下注射100μlmatrigel(corning，usa)加上1.0x10⁷个hl-60细胞(0.1ml细胞悬浮液)。小鼠以异构型对照组抗体(400ug/小鼠)、hu5f9-g4、或具有igg1或igg4异构型的人类抗cd47抗体brp1f11-g4与cwp1a1(400μg/小鼠)每周腹腔注射三次，持续三周。每周测量肿瘤体积二次。利用方程式v＝lw²/2计算肿瘤体积。在小鼠牺牲之后，切除肿瘤组织并以福尔马林固定。

欲评估抗肿瘤活性，以hl-60异种移植模型测试抗cd47抗体brp1f11-g4、cwp1a1-g1、及cwp1a1-g4，并与hu5f9-g4抗体相比较。如图10a所示，各小鼠以腹腔注射投予400μg的cwp1a1-g1、cwp1a1-g4、及brp1f11-g4抗体证实对人类急性前髓细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia)hl60异种移植物具有明显抗肿瘤活性，且其可与hu5f9-g4的比拟。各处理的代表性肿瘤显示于图10b。

实施例13.药物动力学评估

以大鼠(n＝5)评估抗cd47抗体的pk。利用尾静脉注射，将10mg/kg的抗cd47抗体投予大鼠。在注射之后0分钟、1小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、6天、8天、10天、12天、及14天，经由每只大鼠的尾静脉收集血液样本。利用酵素连接免疫吸附试验(elisa)测定血清中抗体的浓度。从相同培养盘上的标准曲线的4-参数逻辑式回归，插值抗cd47抗体的血清浓度。

鉴于上述，抗cd47抗体在人类igg4框架上进行基因工程，以最小化fc依赖性效应子功能(adcc与cdc)的募集，且不涉及细胞凋亡，因此，本发明建议，抗cd47抗体(以及hu5f9-g4)能经由阻断sirp-α与cd47的交互作用，引发活化巨噬细胞介导的吞噬作用。

序列表

<110>三钰生物科技股份有限公司

陈,皇慈

<120>人类抗cd47抗体及其用途

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