酰化的降钙素模拟物的制作方法

本发明涉及酰化的降钙素模拟物，并扩展到其作为药物在治疗各种疾病和病症、调节血糖水平、调节对葡萄糖耐量测试的响应、调节食物摄入、治疗骨质疏松症和治疗骨关节炎中的用途，所述各种疾病和病症包括但不限于糖尿病(i型和ii型)、体重过重、过度进食与代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性和非酒精性脂肪肝病。在全球范围内，大约有2.5亿糖尿病患者，并且预计这一数字将在未来二十年翻一番。该人群中超过90％患有2型糖尿病(t2dm)。据估计，目前仅50至60％的人被诊断出受t2dm影响或处于出现明显t2dm之前的阶段。t2dm是一种异质性疾病，其特征是碳水化合物和脂肪代谢异常。t2dm的病因是多方面的，并且包括影响组织如肌肉、肝脏、胰腺和脂肪组织中的β-细胞功能和胰岛素敏感性的遗传和环境因素两者。结果，观察到胰岛素分泌受损，并且胰岛素分泌受损与β-细胞功能和慢性胰岛素抵抗的进行性下降同步。内分泌胰腺不能补偿外周胰岛素抵抗，导致高血糖症和临床糖尿病的发作。现在，组织对于胰岛素介导的葡萄糖摄取的抵抗被认为是t2dm的主要病理生理决定因素。最佳的t2dm干预的成功标准是血糖水平的降低，这可以是血糖水平的长期降低，以及在食物摄取后耐受高葡萄糖水平的能力增强两者，这可以通过峰值葡萄糖水平降低和清除更快来描述。这两种情况对β-细胞胰岛素输出和功能的压力都较小。i型糖尿病的特征是响应于食物摄取而产生胰岛素的能力损失，因此不能将血糖调节至正常的生理水平。骨骼的物理结构可能会受到多种因素的影响，包括疾病和受伤。最常见的骨病之一是骨质疏松症，其特征是骨量低和骨组织结构恶化，从而导致骨脆性，特别是臀部、脊柱和腕部骨折的易感性增加。在使得骨吸收率超过骨形成率的不平衡状态下，骨质疏松症会发展。已经显示，施用有效量的抗吸收剂如降钙素阻止骨吸收。包括关节疾病(例如骨关节炎(oa)、类风湿性关节炎(ra)或青少年类风湿性关节炎(jra))以及包括由自身免疫应答引起的炎症(例如狼疮、强直性脊柱炎(as)或多发性硬化症(ms))在内的炎症或退行性疾病可由于疼痛和关节破坏而导致活动能力的实质性损失。覆盖并缓冲关节内骨骼的软骨可以随着时间的流逝而退化，因此不希望地使两块骨骼直接接触，这可以在关节运动期间限制一块骨骼相对于另一块骨骼的运动和/或导致一块骨骼对另一块骨骼造成损害。软骨下方的软骨下骨骼也可能退化。施用有效量的抗吸收剂如降钙素可以阻止骨吸收。降钙素在多种物种中高度保守。全长天然降钙素的长度为32个氨基酸。天然降钙素实例的序列如下所示：在wo2013/067357和wo2015/071229中公开了天然降钙素的合成变体，该天然降钙素的合成变体具有旨在提供改善的性质的修饰的氨基酸序列。然而，诸如降钙素和降钙素模拟物的肽通常具有差的吸收、分布、代谢和排泄性质以及快速清除和短半衰期。因此，肽药物通常需要每天肠胃外施用。目前，每日通过皮下注射(s.c.)施用治疗不是最佳的施用方法，因为这给个体患者带来不便，并且可能导致不遵守治疗计划以避免与每日注射相关的不适。因此，每周使用皮下注射给药一次将提高有关患者的生活质量，并进一步帮助遵守治疗计划。本领域已知有许多方法试图改善肽药物的体内半衰期。这样的方法包括改善蛋白水解稳定性(例如，通过保护n-末端和c-末端、用d-氨基酸或非天然氨基酸替换氨基酸、环化肽等)和降低肾脏清除率(例如，通过使肽与大分子如大聚合物、白蛋白、免疫球蛋白等缀合)。然而，本领域中还已知对药物肽进行这样的修饰在例如药物效力降低和不良副反应不可预测如药物敏化方面可能是有害的。因此，不可能预测这样的修饰是否必然会改善肽药物的治疗谱。因此，开发仅需要每周一次施用的肽药物是具有挑战性的前景。改善肽药物的药代动力学和药效学性质的一种方法是使肽酰化。trier等人(博士论文,2016,"治疗性肽的酰化(acylationoftherapeuticpeptides)",dtu；可下载自：http://orbit.dtu.dk/files/127682557/phd_thesis_sofie_trier.pdf)研究了酰化两种治疗性肽(即胰高血糖素样肽2(glp2)和鲑鱼降钙素(sct))的效果，其中酰基具有不同长度(c8-c16)。尽管基于先前对类似肽的观察发现酰化glp2的效果在很大程度上是可预测的，但是发现在酰化sct时所观察到的效果是不可预测的。例如，trier等人发现酰化sct(在肽骨架上的不同位置)始终引起受体效力的实质性损失(损失60至80％)，而glp-2在酰化后保留了受体效力。因此，尽管trier等人确实发现了与酰化sct相关的一些有用性质(尤其是在短链(c8)酰化方面)，但也清楚的是，酰化sct有许多不可预测的和显著的不利影响，最明显的是受体效力的显著下降。另外的值得注意的一点是trier等人的研究专注于酰化鲑鱼降钙素的第18位(lys18)。这是因为先前旨在改善鲑鱼降钙素功效的研究将第18位鉴定为修饰的优势位点(在该情况下是通过peg化而非酰化作用进行修饰的)。在那些研究中，发现了peg化sct的lys18位导致比在cys1或lys11位置处修饰的类似肽更好的功效(youn等人,j.control.release,2006,334-342)。技术实现要素：本发明人发现，在降钙素模拟物的第11位赖氨酸残基处或降钙素模拟物的第19位赖氨酸残基处酰化降钙素模拟物，特别是被某些特定酰基部分酰化时，导致肽的功效与等效非酰化肽相比令人惊讶的改善，而且增加了肽作用的持续时间。类似地，发现降钙素模拟物的功效的最大改善对应于第11位或第19位处的酰化，而酰化第18位产生了较差的结果，这与youn等人的发现相反。因此，本发明人开发了有效的新型酰化的降钙素模拟物，该酰化的降钙素模拟物可以仅需要每周施用一次而不是每天施用一次。因此，一方面，本发明提供了降钙素模拟物，该降钙素模拟物在位于该降钙素模拟物的第11位的赖氨酸残基处被酰化和/或在位于该降钙素模拟物的第19位的赖氨酸残基处被酰化。所述赖氨酸残基的侧链ε-氨基被选自以下中的任一种的酰基酰化：带有任选接头的c16或更长的脂肪酸；或带有任选接头的c16或更长的脂肪二酸。如本文所用，“降钙素模拟物”意指活化降钙素受体(即降钙素受体激动剂)并且优选还活化胰淀素受体(即胰淀素和降钙素受体双重激动剂)的肽。在某些优选的实施方式中，降钙素模拟物的长度为32至37个氨基酸。最优选地，降钙素模拟物的长度为32个氨基酸。在一个优选的方面，其中降钙素模拟物在位于第11位的赖氨酸残基处被酰化，本发明涉及式(i)(a)的降钙素模拟物：cx2x3lstcx8lgkac...其中x2＝a、g或sx3＝n或sx8＝m、v或α-氨基异丁酸(aib)并且其中，kac是赖氨酸残基，其中侧链ε-氨基被选自以下中的任一种的酰基酰化：带有任选接头的c16或更长的脂肪酸；或带有任选接头的c16或更长的脂肪二酸。在另一个优选的方面，其中降钙素模拟物在位于第19位的赖氨酸残基处被酰化，本发明涉及式(i)(b)的降钙素模拟物：cx2x3lstcx8lgx11x12x13x14x15x16x17x18kac...其中x2＝a、g或sx3＝n或sx8＝m、v或α-氨基异丁酸(aib)x11＝r、k、t、a或kac(优选r、k或kac，最优选r或k)x12＝l或y(最优选l)x13＝s、t、w或y(优选t、s或y)x14＝q、k、r或a(优选q或a，最优选q)x15＝d、e或n(最优选d或e)x16＝l或f(最优选l)x17＝h或nx18＝r、k或n(优选r或k)并且其中，kac是赖氨酸残基，其中侧链ε-氨基被选自以下中的任一种的酰基酰化：带有任选接头的c16或更长的脂肪酸；或带有任选接头的c16或更长的脂肪二酸。优选地，式(i)(a)或(i)(b)的降钙素模拟物的长度为32至37个氨基酸，优选长度为32、33、35、36或37个氨基酸。最优选地，式(i)(a)或(i)(b)的降钙素模拟物的长度为32个氨基酸。在本发明的优选方面，降钙素模拟物是式(ii)的32聚体降钙素模拟物：cx2x3lstcx8lgx11x12x13x14x15x16x17x18x19x20x21x22x23x24x25x26x27gx29x30x31p其中x2＝a、g或sx3＝n或sx8＝m、v或α-氨基异丁酸(aib)x11＝kac、r、k、t或a(最优选为kac、r或k)x12＝l或yx13＝s、t、w或yx14＝q、k、r或ax15＝d、e或nx16＝l或fx17＝h或nx18＝r、k或nx19＝kac、l、f或k(最优选为kac、l或f)x20＝q、h或ax21＝t或rx22＝y或fx23＝s或px24＝g、k、q或rx25＝t、i或mx26＝s、n、d、g或ax27＝t、v、f或ix29＝s、a、p或vx30＝n、g或ex31＝a、t或s(最优选为a或t)其中x11为kac和/或x19为kac(使得x11为kac，且x19为l、f或k，优选为l或f；或x11为r、k、t或a，优选为r或k，且x19为kac；或x11为kac，且x19为kac)，并且其中，kac是赖氨酸残基，其中侧链ε-氨基被选自以下中的任一种的酰基酰化：c16或更长的脂肪酸，c16或更长的脂肪二酸，接头-c16或更长的脂肪酸，或接头-c16或更长的脂肪二酸。优选地，式(ii)的32聚体降钙素模拟物为：cx2x3lstcx8lgx11lx13x14x15lx17x18x19x20tx22px24tdvganap其中x2＝a、g或sx3＝n或sx8＝m、v或aibx11＝kac、r、k、t或a(最优选为kac、r或k)x13＝t、s或yx14＝q或a(最优选为q)x15＝d或ex17＝h或nx18＝r或kx19＝kac、l、f或k(最优选为kac、l或f)x20＝q、h或ax22＝y或fx24＝k、q或r其中，x11为kac和/或x19为kac，并且其中，kac是赖氨酸残基，其中侧链ε-氨基被选自以下中的任一种的酰基酰化：c16或更长的脂肪酸，c16或更长的脂肪二酸，接头-c16或更长的脂肪酸，或接头-c16或更长的脂肪二酸。优选地，x2为s，且x3为n；或x2为g，且x3为n；或x2为a，且x3为s。优选地，x13为s或t，最优选为s。优选地，x24为r或k。在优选的实施方式中，-x11为kac，x17为h，x18为k，x19为l，且x20为q或a；或-x11为kac，x17为h，x18为r，x19为l，且x20为q或a；或-x11为kac，x17为n，x18为k，x19为f，且x20为h或a；或-x11为kac，x17为n，x18为r，x19为f，且x20为h或a；或-x11为r或k，x17为h，x18为k，x19为kac，且x20为q或a；或-x11为r或k，x17为h，x18为r，x19为kac，且x20为q或a；或-x11为r或k，x17为n，x18为k，x19为kac，且x20为h或a；或-x11为r或k，x17为n，x18为r，x19为kac，且x20为h或a。在优选的实施方式中，x2为s，x3为n，x11为kac，x13为s，x17为h，x18为k或r，x19为l，x20为q或a，且x22为y；或x2为s，x3为n，x11为r或k，x13为s，x17为h，x18为k或r，x19为kac，x20为q或a，且x22为y。在优选的实施方式中，x2为a，x3为s，x11为kac，x13为s，x17为h，x18为k或r，x19为l，x20为q或a，且x22为f；或x2为a，x3为s，x11为r或k，x13为s，x17为h，x18为k或r，x19为kac，x20为q或a，且x22为f。在优选的实施方式中，x2为g，x3为n，x11为kac，x13为t，x17为n，x18为k或r，x19为f，x20为h或a，且x22为f；或x2为g，x3为n，x11为r或k，x13为t，x17为n，x18为k或r，x19为kac，x20为h或a，且x22为f。在另外的优选方面，本发明涉及降钙素模拟物，其中所述降钙素模拟物是根据式(iii)的33聚体肽：csnlstcx6lgx7lsqdlhrx8qtypkx1tx5vganap(iii)或其中所述降钙素模拟物是根据式(iv)的35聚体肽：csnlstcx6lgx7lsqdlhrx8qtypkx1x2x3tx5vganap(iv)或其中所述降钙素模拟物是根据式(v)的36聚体肽：csnlstcx6lgx7lsqdlhrx8qtypkx1x2x3x4tx5vganap(v)或其中所述降钙素模拟物是根据式(vi)的37聚体肽：csnlstcx6lgkaclzx1x2x3x4tx5vganap(vi)其中x1至x4中的每一个为任意氨基酸，条件是x1至x4中的至少一个为碱性氨基酸残基，和/或x1至x4中的至少两个独立地为极性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，x1至x4中的至少一个为gly残基，并且其中x1至x4均不为酸性残基；其中x5为d或n；其中x6为aib或m；其中x7为kac且x8为l，或x7为r或k且x8为kac，其中z选自sqdlhrlsnnfga、sqdlhrlqtygai或anflvhssnnfga；并且其中，kac为赖氨酸残基，其中侧链ε-氨基被选自以下中的任一种的酰基酰化：c16或更长的脂肪酸，c16或更长的脂肪二酸，接头-c16或更长的脂肪酸，或接头-c16或更长的脂肪二酸。优选地，式(iii)至(vi)的x1或x4中的至少一个为碱性氨基酸残基。还优选地，x1或x4中的至少一个为碱性氨基酸残基，并且x1至x4中的至少一个以上独立地为极性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，并且x1至x4均不为酸性残基。还优选地，x1至x4中的至少三个独立地为极性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，并且x1至x4均不为酸性残基。更优选地，x1至x4全部独立地为极性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，并且x1至x4均不为酸性残基。最优选地，x1至x4全部独立地为极性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，x1至x4中的至少三个为碱性氨基酸残基，且x1至x4均不为酸性残基。碱性氨基酸残基可以是具有碱性侧链的任何天然或非天然氨基酸残基，可以选自但不限于arg、his或lys。极性氨基酸残基可以是具有极性不带电荷的侧链的任何天然或非天然氨基酸残基，可以选自但不限于ser、thr、asn、gln或cys。如本文所用，术语“酸性残基”是指具有酸性侧链的任何天然或非天然氨基酸残基，例如glu或asp。在优选的实施方式中，x1选自asn、phe、val、gly、ile、leu、lys、his或arg；x2选自ala、asn、his、leu、ser、thr、gly或lys；x3选自ala、phe、ile、ser、pro、thr、gly或lys；和/或x4选自ile、leu、gly、his、arg、asn、ser、lys、thr或gln；条件是x1或x4中的至少一个为碱性氨基酸残基，和/或x1至x4中的至少两个独立地为极性氨基酸残基和/或碱性氨基酸残基，和/或x1至x4中的至少一个为gly残基。在优选的实施方式中，x1选自asn、gly、ile、his或arg；x2选自asn、leu、thr、gly或lys；x3选自phe、pro、ile、ser、thr、gly或lys；和/或x4选自gly、his、asn、ser、lys、thr或gln；条件是x1或x4中的至少一个为碱性氨基酸残基，和/或x1至x4中的至少两个独立地为极性氨基酸残基和/或碱性氨基酸残基，和/或x1至x4中的至少一个为gly残基。根据上述式(iii)至(v)的本发明的肽可包含以下保守取代中的一种或多种：-肽的第15位处的asp残基被glu取代；-肽的第18位处的arg残基被lys取代；和/或-肽的第24位处的lys残基被arg取代。根据上述式(vi)的本发明的肽可包含以下保守取代中的一种或多种：-肽的第15位处的asp残基被glu取代；和/或-肽的第18位处的arg残基被lys取代，其中式(vi)的肽的z组分是sqdlhrlsnnfga或sqdlhrlqtygai。在本发明的所有方面，接头优选包含谷氨酸残基和/或低聚乙二醇(oeg)氨基酸接头，该低聚乙二醇(oeg)氨基酸接头包含一个oeg氨基酸或连接在一起的两个或更多个oeg氨基酸，其中所述oeg氨基酸为：并且其中n为1至10，优选为1至5，优选为1至3，优选为1或2，最优选为1。oeg氨基酸接头可优选包含一个oeg氨基酸或连接在一起的两个至六个oeg氨基酸。更优选地，oeg氨基酸接头包含一个oeg氨基酸或连接在一起的两个至三个oeg氨基酸。最优选地，oeg氨基酸接头包含连接在一起的两个oeg氨基酸。oeg氨基酸接头可进一步包含与oeg氨基酸接头的氨基末端或羧基末端连接的一个或多个谷氨酸残基。优选地，oeg氨基酸接头选自以下中的任一种：优选地，oeg氨基酸接头为：在优选的实施方式中，酰基选自c18或更长的脂肪酸、c18或更长的脂肪二酸、接头-c18或更长的脂肪酸、或接头-c18或更长的脂肪二酸。优选地，酰基选自以下中的任一种：c18至c30脂肪酸，优选c18至c22脂肪酸，c18至c30脂肪二酸，优选c18至c22脂肪二酸，接头-c18至c30脂肪酸，优选接头-c18至c22脂肪酸，接头-c18至c30脂肪二酸，优选接头-c18至c22脂肪二酸。优选地，c18脂肪二酸是十八烷二酸(cas号871-70-5)。在优选的实施方式中，kac被接头-脂肪二酸酰化，其中所述脂肪二酸是c18至c22脂肪二酸，并且接头是优选地，c18脂肪二酸是十八烷二酸。优选地，本发明的降钙素模拟物选自以下中的任一种：csnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypktdvganapcsnlstcmlgkaclsqelhrlqtypktdvganapcsnlstcvlgkaclsqelhklqtyprtdvganapcaslstcvlgkaclsqdlhklqtfpktdvganapcgnlstcmlgkaclsqdlnkfhtfpqtdvganapcsnlstc(aib)lgkaclsqdlhrlqtypktdvganapcgnlstc(aib)lgkacltqdlnkfhtfpktdvganapcsnlstc(aib)lgkaclanflvhssnnfgailpktdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhtdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhsstdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhssntdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlsnnfgailsstnvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtygailspktdvganapcsnlstcmlgkaclanflvhssnnfgailpktdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkilsstdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkglittdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypknnfgtdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkrttqtdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhttntdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhggqtdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhkkntdvganapcsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhkkhtdvganapcsnlstc(aib)lgrlsqdlhrkacqtypktdvganapcsnlstcmlgrlsqelhrkacqtypktdvganap其中kac如上所定义。在上述肽的第8位的氨基酸残基，如果不是上述情况，则任选地被aib取代。优选地，本发明的降钙素模拟物选自以下中的任一种：accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypktdvganap-nh2accsnlstc(aib)lgkaclsqdlhrlqtypktdvganap-nh2accgnlstc(aib)lgkacltqdlnkfhtfpktdvganap-nh2accsnlstcvlgkaclsqelhklqtyprtdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqelhrlqtypktdvganap-nh2accaslstcvlgkaclsqdlhklqtfpktdvganap-nh2accgnlstcmlgkaclsqdlnkfhtfpqtdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhtdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhsstdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhssntdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlsnnfgailsstnvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtygailspktdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclanflvhssnnfgailpktdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkilsstdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkglittdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypknnfgtdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkrttqtdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhttntdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhggqtdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhkkntdvganap-nh2accsnlstcmlgkaclsqdlhrlqtypkhkkhtdvganap-nh2accsnlstc(aib)lgkaclanflvhssnnfgailpktdvganap-nh2accsnlstc(aib)lgrlsqdlhrkacqtypktdvganap-nh2accsnlstcmlgrlsqelhrkacqtypktdvganap-nh2其中kac被接头-脂肪二酸酰化，其中所述脂肪二酸是c18至c22脂肪二酸，并且接头是优选地，c18脂肪二酸是十八烷二酸。在上述肽的第8位的氨基酸残基，如果不是上述情况，则任选地被aib取代。在上述肽中，“ac”表示肽的n-末端被乙酰化，而“-nh2”表示该肽的c-末端被酰胺化。可将本发明的降钙素模拟物配制为用于肠内施用。例如，可以将降钙素模拟物配制在药物组合物中用于口服施用，该药物组合物包含包衣的柠檬酸颗粒，其中包衣的柠檬酸颗粒增加肽的口服生物利用度。替代地或除此之外，可以将降钙素模拟物与载体一起配制，用于口服施用。示例性载体可以包括5-cnac、snad或snac。也可以将本发明的降钙素模拟物配制为用于肠胃外施用。例如，可以将降钙素模拟物配制为用于注射。本发明还涉及包含如上所述的降钙素模拟物的药物组合物。本发明还涉及如上所述的降钙素模拟物用作药物。在这方面，降钙素模拟物可以用于治疗糖尿病(i型和/或ii型)、体重过重、过度进食、代谢综合征、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪肝病、骨质疏松症或骨关节炎、血糖水平调节不良，对葡萄糖耐量测试的响应调节不良或食物摄入调节不良。降钙素模拟物也可以与二甲双胍或另一种胰岛素敏化剂联合施用。本发明的肽可以在其n-末端被酰化或以其他方式被修饰以降低第一氨基酸的正电荷，并且独立地可以在其c-末端被酰胺化。可以将肽配制为作为药物施用，并且可以配制为用于肠内或肠胃外施用。优选的制剂是可注射的，优选用于皮下注射，然而可以将肽与载体一起配制用于口服施用，并且任选地其中载体增加肽的口服生物利用度。合适的载体包括含有5-cnac、snad或snac的载体。任选地，将肽配制为用于口服施用的药物组合物，该药物组合物包含包衣的柠檬酸颗粒，其中包衣的柠檬酸颗粒增加肽的口服生物利用度。本发明包括本发明的肽用作药物的用途。该肽可以用于治疗糖尿病(i型和/或ii型)、体重过重、过度进食、代谢综合征、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪肝病、骨质疏松症或骨关节炎、血糖水平调节不良、对葡萄糖耐量测试的响应调节不良或食物摄入调节不良。特别地，肽可用于降低不希望的高的空腹血糖水平或降低不希望的高的hba1c或降低对葡萄糖耐量试验的不希望的高响应。本发明的肽还可以用于在受试者中减少肝脏中的甘油三酯和/或减少肝脏中的脂肪堆积。可以使用本领域已知的用于生成肽的任何合适方法来产生本发明的肽，例如合成(化学)技术和重组技术。优选地，使用合成方法生产肽。合成肽的合成是本领域所熟知的，并且包括(但不限于)采用各种保护基策略(例如使用fmoc、boc、bzl、tbu等)的固相肽合成。在一些实施方式中，修饰上文讨论的降钙素模拟物的n-末端侧以降低第一氨基酸的正电荷。例如，乙酰基、丙酰基或琥珀酰基可以在半胱氨酸-1上被取代。减少正电荷的替代方式包括但不限于基于聚乙二醇的peg化，或在n-末端添加另一种氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸。可替代地，可以将其他氨基酸添加到上文讨论的肽的n-末端，包括但不限于赖氨酸、甘氨酸、甲酰甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乙酰丙氨酸和二丙氨酰。如本领域技术人员将理解的，具有多个半胱氨酸残基的肽通常在两个这样的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。本文所述的所有这样的肽被定义为任选地包括一个或多个这样的二硫桥，所述二硫桥特别是在cys1-cys7位置处。模仿这一点，第1位和第7位的半胱氨酸可以共同被α-氨基辛二酸键取代。虽然本公开的降钙素模拟物可以以游离酸形式存在，但优选c-末端氨基酸被酰胺化。申请人预期这样的酰胺化可能有助于肽的有效性和/或生物利用度。可以采用合成化学方法来酰胺化c-末端氨基酸。制备本公开的酰胺化形式的降钙素模拟物的另一种技术是在肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶存在下根据已知的技术使前体(具有甘氨酸取代所需的酰胺化产物的c-末端氨基)反应，其中前体在反应中转化为酰胺化产物，例如us4708934和ep0308067和ep0382403中所描述。酰胺化产物的生产也可以使用以下文献中阐述的方法和酰胺化酶来完成：consalvo等人，us7445911；miller等人，us2006/0292672；ray等人,2002,蛋白表达和纯化(proteinexpressionandpurification),26:249-259；和mehta,2004,biopharm.international,july,pp.44-46。优选的酰胺化肽的制备可以通过以下过程来进行：例如，通过在大肠杆菌中产生甘氨酸延伸的前体作为与谷胱甘肽-s-转移酶的可溶性融合蛋白，或者通过根据us6103495中描述的技术直接表达前体。这样的甘氨酸延伸的前体具有与所需的酰胺化产物相同的分子结构，除了在c-末端(其中产物以--x--nh2终止，而前体以--x-gly终止，x为产物的c-末端氨基酸残基)。上述出版物中描述的α-酰胺化酶催化前体向产物的转化。该酶优选是重组产生的，例如，在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生，如上文引用的文章，生物技术和生物药物(biotechnologyandbiopharm)中所述。本公开的肽活性剂的游离酸形式可以以相似的方式产生，除了在“前体”上不包括c-末端甘氨酸，而该前体是最终的肽产物并且不需要酰胺化步骤。除非另有说明，否则本公开的降钙素模拟物的优选剂量对于治疗和预防目的是相同的。所需剂量将在下文中更详细地讨论，并且根据施用方式而不同。除非另有说明或从上下文显而易见，否则本文中的剂量是指不受药物赋形剂、稀释剂、载体或其他成分影响或不考虑药物赋形剂、稀释剂、载体或其他成分的活性化合物(即降钙素模拟物)的重量，尽管希望包括这样的额外成分。制药工业中通常用于递送肽活性剂的任何剂型(胶囊剂、片剂、注射剂等)适合用于本文，术语“赋形剂”、“稀释剂”或“载体”包括通常所包括的这样的非活性成分，以及工业中这样的剂型的活性成分。以下更详细地讨论优选的口服剂型，但不应将其视为施用本公开的活性剂的排他方式。可以将本公开的降钙素模拟物施用至患者以治疗多种疾病或病症。如本文所用，术语“患者”是指属于动物界的任何生物体。在一种实施方式中，术语“患者”是指脊椎动物，更优选地是包括人在内的哺乳动物。因此，本公开包括肽在治疗i型糖尿病、ii型糖尿病或代谢综合征，肥胖症或抑制食欲，或用于降低胰岛素抵抗，或用于降低不希望的高空腹血糖水平，或用于降低不希望的高峰血清葡萄糖水平，或用于降低不希望的高峰值血清胰岛素水平，或用于降低对葡萄糖耐量测试的不期望的大响应，或用于治疗骨质疏松症，或用于治疗骨关节炎，或用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)，或用于治疗酒精性脂肪肝病，或用于降低肝脏甘油三酯，或用于降低受试者肝脏中的脂肪堆积的方法中的用途。存在多种考虑诸如性别、年龄和身高的多种因素的领域认可的体重正常范围量度。本文阐述的需要治疗或预防方案的患者包括体重超过公认标准的患者或由于遗传、环境因素或其他公认的风险因素而比一般人群具有更高的变得超重或肥胖的风险的患者。根据本公开，预期降钙素模拟物可用于治疗糖尿病，其中体重控制是治疗的一方面。在一种实施方式中，该方法包括将本文所述的药学上有效量的任何一种肽肠内施用至需要治疗所述病症的患者。在一种实施方式中，该方法包括将本文所述的药学上有效量的任何一种肽肠胃外施用至需要治疗所述病症的患者。对于肠胃外施用(包括腹膜内、皮下、静脉内、皮内或肌内注射)，可以使用例如本发明的肽在芝麻油或花生油或在丙二醇水溶液中的溶液。如果必要，应适当缓冲水溶液，并首先使液体稀释剂等渗。这些水溶液适用于静脉注射目的。油性溶液适用于关节内、肌内和皮下注射目的。所有这些溶液在无菌条件下的制备可通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地完成。对于肠胃外应用，合适制剂的实例包括溶液，优选油性或水性溶液以及悬浮液、乳液或包括栓剂在内的植入物。可以以多次剂量或单一剂量形式将肽配制成无菌形式，例如分散在流体载体中，例如通常用于可注射剂的无菌生理盐水或5％盐水葡萄糖溶液。所述方法可包括确定患者是否患有所述病症的预备步骤，和/或确定所述治疗在何种程度上有效缓和所述患者的病症的后续步骤，例如，在每种情况下，进行口服葡萄糖耐量测试或静息血糖水平。口服肠内制剂用于通过吞咽以便随后在胃下方的肠中释放来摄取，并因此经由门静脉递送至肝脏，而不是将制剂保持在口腔中以使得通过舌下或口腔途径转移至血流。用于本公开的合适剂型包括片剂、微片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉末剂、泡腾固体和可咀嚼固体制剂。这些制剂可包括明胶，优选水解明胶或低分子量明胶。这样的制剂可以通过冷冻干燥包含降钙素模拟物和水解明胶或低分子量明胶的均匀水溶液并进一步将所得固体材料加工成所述口服药物制剂而获得，并且其中明胶可具有1000至15000道尔顿的平均分子量。这样的制剂可包括保护性载体化合物，例如5-cnac或本文公开的其他化合物。虽然口服制剂如片剂和胶囊是优选的，但用于本公开的组合物可以采用糖浆、酏剂等以及栓剂等形式。口服递送通常是选择的递送途径，因为它方便，相对容易且通常无痛，从而导致相对于其他递送方式更大的患者依从性。然而，生物学、化学和物理屏障(如胃肠道中的变化的ph、强大的消化酶和活性剂不可渗透的胃肠膜)使得将降钙素样肽口服递送至哺乳动物成为问题，例如，口服递送作为由哺乳动物甲状腺的滤泡旁细胞以及由鸟类和鱼类的超支气管腺分泌的长链多肽激素的降钙素最初证明是困难的，这至少部分是由于降钙素在胃肠道中的稳定性不足以及降钙素不能容易地通过肠壁运输到血流中。然而，合适的口服制剂如下所述。患者的治疗在一种实施方式中，以足够的剂量施用本公开的降钙素模拟物以维持患者的模拟物的血清水平为每毫升5皮克至1000纳克，优选每毫升50皮克至500纳克，例如每毫升1纳克至300纳克。血清水平可以通过本领域已知的任何合适的技术来测量，例如放射免疫测定或质谱法。主治医师可以监测患者的响应，然后可以稍微改变剂量以考虑个体患者的代谢和响应。通过将本公开的所有组分作为单个药丸或胶囊来施用，可以最好地实现近同时释放。然而，本公开还包括，例如，将所需量的降钙素模拟物分成两种或更多种片剂或胶囊，所述两种或更多种片剂或胶囊可以一起施用，使得它们一起提供必要量的所有成分。如本文所用，“药物组合物”包括但不限于适合于具体施用至患者的完整剂量，无论在给定的施用中一个或多个片剂或胶囊(或其他剂型)是否是推荐的。可以使用unigene产品中采用的方法配制本公开的降钙素模拟物以用于口服施用。这些可包括美国专利第5,912,014号、美国专利第6,086,918号、美国专利第6,673,574号、美国专利第7,316,819号、美国专利第8,093,207号和美国公开第2009/0317462号中描述的方法。特别地，它可以包括使用化合物与膜转运蛋白如hivtat蛋白的蛋白质转导域缀合，与一种或多种蛋白酶抑制剂和/或可以被包衣的ph降低剂和/或耐酸保护溶媒和/或可以是表面活性剂的吸收增强剂共同配制。在一种实施方式中，优选将本公开的降钙素模拟物以美国专利公开第2009/0317462号中已知的方式配制为用于口服递送。在一种实施方式中，可以将本发明的降钙素模拟物通过与合适的载体化合物混合而配制为用于肠内施用，尤其用于口服施用。合适的载体化合物包括美国专利第5,773,647号和美国专利第5866536号中描述的那些，其中，5-cnac(n-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸，通常为其二钠盐)特别有效。其他优选的载体或递送剂是snad(10-(2-羟基苯甲酰氨基)癸酸的钠盐)和snac(n-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸的钠盐)。在一种实施方式中，本公开的药物组合物包含递送有效量的载体如5-cnac，即足以递送化合物以达到所需效果的量。通常，载体如5-cnac的存在量按重量计为总组合物的2.5％至99.4％，更优选为总组合物的25％至50％。此外，wo00/059863公开了式i的二钠盐其中r1、r2、r3和r4独立地为氢、-oh、-nr6r7、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基；r5为取代或未取代的c2-c16亚烷基、取代或未取代的c2-c16亚烯基、取代或未取代的c1-c12烷基(亚芳基)、或取代或未取代的芳基(c1-c12亚烷基)；r6和r7独立地为氢、氧或c1-c4烷基；其水合物和溶剂化物，特别有效地用于口服递送活性剂如降钙素(例如鲑鱼降钙素)，这些可用于本公开中。使用任选微粉化的5-cnac的优选肠溶制剂通常可如wo2005/014031中所述。可以使用bonemedicallimited的capsitonin产品中使用的方法将化合物配制为用于口服施用。这些包括axcess制剂中所含的方法。更特别地，活性成分可以被包封在能够承受经过胃运输的过程的肠溶胶囊中。这可以含有活性化合物以及亲水性芳香醇吸收增强剂，例如wo02/028436中所述。以已知的方式，肠溶包衣可以以ph敏感的方式，例如在ph值为3到7时变得可渗透。wo2004/091584还描述了使用芳族醇吸收增强剂的合适的配制方法。可以使用oramed产品中所见的方法配制化合物，所述oramed产品可以包含具有ω-3脂肪酸的制剂，如wo2007/029238中所见或如us5,102,666中所述。通常，可以使用这些载体或递送剂的药学上可接受的盐(尤其是单钠盐或二钠盐)、溶剂化物(例如醇溶剂化物)和水合物。根据本公开的药物组合物的口服施用可以如下实现：定期实现，例如每天或每周一次或多次；间歇实现，例如在一天或一周内不定期实现；或者循环实现，例如定期数天或数周，然后进入无需施用的周期。本发明公开的实施方式的药物组合物的剂型可以是任何已知的形式，例如液体或固体剂型。液体剂型包括溶液乳液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物和载体如5-cnac外，液体制剂还可包含本领域常用的惰性赋形剂，如增溶剂，例如乙醇；油类，如棉籽、蓖麻油和芝麻油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；增甜剂；调味剂；以及溶剂，如水。固体剂型包括胶囊、软凝胶胶囊、片剂、囊片剂、粉末剂，颗粒剂或其它固体口服剂型，所有这些都可以通过本领域熟知的方法制备。药物组合物可另外包含通常使用的量的添加剂，包括但不限于ph调节剂、防腐剂、食用香料、掩味剂、香料、保湿剂、张力调节剂(tonicifier)、着色剂、表面活性剂、增塑剂、润滑剂如硬脂酸镁、流动助剂、压缩助剂、增溶剂、赋形剂、稀释剂如微晶纤维素(例如由fmc公司提供的avicelph102)、或其任何组合。其他添加剂可包括磷酸盐缓冲盐、柠檬酸、二醇和其他分散剂。该组合物还可包括一种或多种酶抑制剂，例如放线酰胺素或表放线酰胺素(epiactinonin)及其衍生物；抑肽酶、特斯乐(trasylol)和伯克(bowman-birk)抑制剂。此外，转运抑制剂，即诸如酮洛芬(ketoprofin)的[rho]-糖蛋白，可以存在于本公开的组合物中。本公开的固体药物组合物可通过常规方法制备，例如，通过将活性化合物、载体如5-cnac和任何其它成分的混合物共混，捏合，并填充到胶囊中，或者如不填充到胶囊中，则随后进行模制，然后进一步压片或压模，得到片剂。另外，可以通过已知方法形成固体分散体，然后进一步加工以形成片剂或胶囊剂。优选地，将本公开的药物组合物中的成分在整个固体剂型中均质或均匀地混合。可替代地，可以将活性化合物作为与所述载体的缀合物来配制，所述载体可以是例如us2003/0069170中描述的低聚物。这样的缀合物可以与脂肪酸和胆汁盐一起施用，如其中所述。可以使用与聚乙二醇(peg)的缀合物，如mansoor等人所述。可替代地，可以将活性化合物与亚硝基-n-乙酰基-d,l-青霉胺(snap)和卡波普(carbopol)溶液或与牛磺胆酸盐和卡波普溶液混合来形成粘膜粘附乳液。可以通过装载到如prego等人所公开的壳聚糖纳米胶囊(任选地如pregopregoc,torresd,fernandez-megiae,novoa-carballalr,quihoae,alonsomj.进行的peg修饰)或如garcia-fuentes等人所公开的壳聚糖或peg包衣的脂质纳米颗粒中来配制活性化合物。如guggi等人所述，用于此目的的壳聚糖纳米颗粒可以是亚氨基四氢噻吩修饰的。如dogru等人所述，可以将它们配制成水/油/水乳液。如sinko等人或song等人所述，通过使用牛磺脱氧胆酸盐或月桂酰肉碱可以增加活性化合物的生物利用度。一般地，delafuente等人中讨论了适合作为载体的纳米颗粒，并且所述纳米颗粒可以用于本公开中。用于口服制剂的其他合适策略包括使用chiasma公司的如wo2005/094785所述的瞬时渗透性增强剂(tpe)系统。tpe利用固体亲水性颗粒在疏水性介质中的油性悬浮液，保护药物分子免于由于恶劣的胃肠(gi)环境而失活，同时tpe作用于gi壁以诱导其货物药物分子的渗透。进一步包括使用谷胱甘肽或如us2008/0200563中所述的含有许多硫醇基团的化合物以抑制外排泵对粘膜的作用。这些技术的实际示例也在以下文献中进行了描述：caliceti,p.salmaso,s.,walker,g.和bernkop-schnurch,a.(2004)'口服胰岛素-peg递送系统的开发和体内评价(developmentandinvivoevaluationofanoralinsulin-pegdeliverysystem).'eur.j.pharm.sci.,22,315-323，guggi,d.,krauland,a.h.,和bernkop-schnurch,a.(2003)'通过胃递送全身肽：体内评估鲑鱼降钙素的口服剂型(systemicpeptidedeliveryviathestomach:invivoevaluationofanoraldosageformforsalmoncalcitonin)'.j.control.rel.92,125-135，和bernkop-schnurch,a.,pinter,y.,guggi,d.,kahlbacher,h.,schoffmann,g.,schuh,m.,schmerold,i.,delcurto,m.d.,d'antonio,m.,esposito,p.andhuck,ch.(2005)'硫醇化聚合物作为载体基质在口服肽递送中的应用(theuseofthiolatedpolymersascarriermatrixinoralpeptidedelivery)'-proofofconcept.j.control.release,106,26-33。可以将活性化合物在无缝微球中配制，如wo2004/084870中所述，其中将活性药物成分溶解为被配制成小球的乳液、微乳液或悬浮液；并通过传统或新颖的包衣技术进行可变涂覆。结果是“预溶”形式的包封药物，所述包封药物在口服施用时提供将活性药物预定地即时释放或持续释放到特定位置以及沿胃肠道以特定速率释放。本质上，药物的预溶增强了对药物动力学谱的可预测性，同时增强了渗透性和药物稳定性。人们可以采用如us2009/0074824中所述的壳聚糖涂覆的纳米胶囊。用这种技术施用的活性分子在纳米胶囊内受到保护，因为它们抵抗胃液的作用，是稳定的。此外，该体系的粘膜粘附性质增强了与肠壁粘附的时间(已经证实这些体系胃肠道转运存在延迟)，从而有助于更有效地吸收活性分子。可以使用由tsr1公司开发的方法。这些包括亲水性增溶技术(hst)，其中明胶(一种带有正电荷和负电荷的天然衍生的胶原蛋白提取物)包覆卵磷脂胶束中含有的活性成分的颗粒并防止它们聚集或结块。这导致了疏水性药物颗粒的润湿性通过极性相互作用而改善。此外，两亲性卵磷脂降低了溶解流体和颗粒表面之间的表面张力。活性成分可以与作为赋形剂的葫芦脲一起配制。可替代地，可以使用merrionpharmaceuticals的gipet技术来生产含有活性成分和吸收增强剂的肠溶衣片剂，所述吸收增强剂可以是us2007/0238707中描述的中链脂肪酸或中链脂肪酸衍生物或如us7268214中所述的膜转位肽。可以采用girestm技术，该技术由置于用于口服施用的药物胶囊中的可充气小袋内的控释剂型组成。在胶囊溶解后，气体发生系统使在胃中的小袋充气。在临床试验中，已经表明小袋在胃中保留16-24小时。可替代地，活性物质可以与保护性改性剂缀合，使其能够承受胃中的酶促降解并有助于其吸收。活性物质可以与单分散的短链甲氧基聚乙二醇糖脂衍生物共价缀合，所述衍生物在纯化后结晶并被冻干成干燥的活性药物成分。这些方法描述于us5438040和www.biocon.com中。人们还可以采用肝脏定向囊泡(hdv)进行主动递送。hdv可以由包封活性物质的脂质体(直径≤150nm)组成，所述脂质体在其脂质双层中还含有肝细胞靶向分子。靶向分子指导包封的活性物质向肝细胞递送，因此需要相对微量的活性物质来起作用。这样的技术在us2009/0087479中进一步描述，并且在www.diasome.com中进一步描述。该活性物质可以被掺入到组合物中，所述组合物另外含有包含醇和共溶剂的基本上非水性的亲水性介质，所述亲水性介质与中链部分甘油酯组合，任选地与长链peg物质混合，如us2002/0115592中关于胰岛素所描述的。可替代地，可以使用以下文献中所述的肠道贴剂：shenz,mitragotris,pharmres.2002apr；19(4):391-5‘用于口服给药的肠道贴剂(intestinalpatchesfororaldrugdelivery)’。如美国专利第7189414号中所述，活性物质可以被掺入到由与疏水聚合物共混的水凝胶所形成的易蚀基质中。待治疗的成年人的合适口服剂量水平可以为0.05至5mg，优选约0.1至2.5mg。患者的剂量治疗频率可以是每周1至4次，优选每周1至2次，最优选每周1次。期望的是，治疗将维持至少6周的延长时间，优选至少6个月的延长时间，优选至少一年的延长时间，并且任选地终生的延长时间。可以使用根据本公开的组合物和单独施用一种或多种其他治疗剂来进行相关病症的组合治疗。可替代地，根据本公开的组合物可以合并一种或多种其他治疗剂以用于组合施用。根据本公开的组合疗法包括如所描述的活性化合物与胰岛素、glp-2、glp-1、gip或胰淀素的组合，或一般是与其他抗糖尿病药的组合。因此，包括共同制剂的联合治疗剂可以与以下制备：胰岛素敏化剂，包括双胍如二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍，tzd's(ppar)如巴拉格列酮、吡格列酮、利格列酮、罗格列酮和曲格列酮，双重ppar激动剂如阿格列扎、莫格他唑和替格列扎；或促分泌剂，包括磺酰脲类如磺胺丁脲、氯磺丙脲、格列齐特、甲苯磺酰胺、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列本脲(glibenclamide)、格列本脲(glyburide)、格列喹酮、格列吡脲和格列美脲，美格列脲/格列奈类(k+)如那格列奈、瑞格列奈和米格列奈；glp-1类似物如艾塞那肽、利西拉肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、度拉糖肽和阿必鲁肽；dpp-4抑制剂如阿格列汀、利格列汀、沙格列汀、西他列汀和维达列汀；胰岛素类似物或特殊制剂如(速效)赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素、(长效)胰岛素甘精胰岛素、地特胰岛素、可吸入胰岛素-exubra和nph胰岛素；以及其他，包括α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，胰淀素类似物如普兰林肽，sglt2抑制剂如达格列净、恩格列净、瑞格列净和舍格列净，以及杂类包括苯氟雷司和托瑞司他。进一步的组合包括与瘦素共同施用或共同配制。瘦素抵抗是2型糖尿病中良好确认的组分；然而，到目前为止，注射瘦素未能在这种病症下改善。相反，有证据支持胰淀素并且因此支持具有类胰淀素能力的分子，如鲑鱼降钙素模拟物，能够改善瘦素敏感性。胰淀素/瘦素组合已显示对体重和食物摄入以及胰岛素抵抗的协同作用[kusakabet等人]。进一步的优选组合疗法包括将本发明的肽与一种或多种减肥药物共同配制或共同施用。这样的减肥药物包括但不限于：脂肪酶抑制剂(例如胰脂肪酶抑制剂，例如奥利司他)，食欲抑制性苯丙胺衍生物(例如苯丁胺)、托吡酯、(苯丁胺/托吡酯组合)、5-ht2c受体激动剂(例如locaserin)、(纳曲酮/安非他酮组合)、胰高血糖素样肽1[glp-1]类似物和衍生物(例如利拉鲁肽、索马鲁肽)、肌浆/内质网(sr)ca2+atp酶(serca)抑制剂(例如肌脂蛋白)、成纤维细胞生长因子21[fgf-21]受体激动剂(例如fgf-21类似物)和β3肾上腺素能受体激动剂(例如米拉贝隆(mirabegron))。这样的组合可以用于治疗超重病症，例如肥胖。附图说明图1：kbp346、kbp347、kbp349、kbp351、kbp352、kbp353和kbp089在食物摄入和体重方面的比较。a)食物摄入，0至4小时。b)体重变化，4小时。c)食物摄入，4至24小时。d)体重变化，24小时。e)食物摄入，24至49小时。f)体重变化，48小时。图2：kbp375、kbp376和kbp377的单一剂量测试。在t＝0时给予单一剂量，并且监测单一剂量36nmol/kg的每种分子对食物摄入和体重的影响168小时，并与未酰化的基准进行头对头比较。a)食物摄入。b)体重变化。图3：kbp356、kb358、kbp362、kbp364、kb368和kbp370的剂量响应测试。在t＝0时给予单一剂量，并且监测单一剂量36nmol/kg的每种分子对食物摄入和体重的影响168小时。a-b)酰化的kbp-066变体的食物摄入和体重。c-d)酰化的kbp-062变体的食物摄入和体重。e-f)酰化的kbp-110变体的食物摄入和体重。图4：单一高剂量kbp372和kbp356对食物摄入和体重的影响。a)kbp-042a11.03(kbp372)对食物摄入的影响。b)kbp-042a11.03(kbp372)对体重的影响。c)kbp-066a11.03(kbp356)对食物摄入的影响。d)kbp-066a11.03(kbp356)对体重的影响。图5：kbp350的4小时食物摄入研究。图6：累积食物摄入。a)随时间变化的累积食物摄入。在研究的最初21天每天监测一次食物摄入。n＝3至4笼+/-sem。b)在图9a中显示的数据的曲线下总面积。n＝9-10。+/-sem。图7：研究期间的zdf体重。a)个体大鼠的体重(克)，b)以溶媒标准化的体重百分比。在前21天内每天记录体重，然后每周记录两次，直到研究结束(第62天)前一周。每天监测kbp-066a11.03组的体重，直到研究结束(第62天)前一周。n＝9-10只大鼠。+/-sem。图8：zdf空腹血糖。在研究开始后第0、14、28、42和62天，在禁食6小时后，测量空腹血糖。n＝9-10。+/-sem。图9：zdfhba1c值a)基线hba1c。b)研究结束时的hba1c。从研究开始的第-3天测量hba1c。在研究结束时即第62天测量hba1c。n＝9-10。+/-sem。图10：口服葡萄糖耐量测试(ogtt)。a)在雄性zdf大鼠中180分钟内的ogtt。b)在a)中所示的ogtt期间的曲线下总面积。在处理8周后进行ogtt。在-30分钟的时间点之前将大鼠禁食11小时。在时间点-30、0、15、30、60、120和180分钟测量血糖水平。在0分钟的时间点口服施用葡萄糖。高于33.3mmol*l-1的血糖值被指定为检测上限；33.3mmol*l-1。未在同一天向大鼠预先给药盐水或kbp-066或kbp-066a。n＝9-10。+/-sem。图11：kbp-305、kbp-306、kbp-307、kbp-356、kbp-381、kbp-382和kbp-383的单一剂量测试。在t＝0时给予单一剂量，并且监测单一剂量3nmol/kg的每种分子对食物摄入和体重的影响96小时，并与彼此以及与溶媒进行头对头比较，以确定最佳酰化长度。a)短期食物摄入(克)。b)体重变化(克)。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图12：使用具有不同酰化长度，.03、.04和.05酰化的kbp-066a11化合物在hfdsd大鼠中进行的六周体重减轻研究。用kbp-066a11.03、kbp-066a11.04、kbp-066a11.05或溶媒处理大鼠，每3天单次皮下注射4nmol化合物/kg来给药至大鼠。在整个研究中每天记录体重。a)每日食物摄入(克(g))；b)个体大鼠的体重减轻(克(g))。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图13：使用具有不同酰化长度，.03、.04或.05酰化的kbp-066a11化合物在hfdsd大鼠中进行的体重减轻研究中的其他参数。用kbp-066a11.03、kbp-066a11.04、kbp-066a11.05或溶媒处理大鼠。每3天单次皮下注射4nmol化合物/kg来给药至大鼠。a)口服葡萄糖耐量测试。b)ogtt的曲线下增量面积。c)研究结束时附睾wat的重量(克(g))。d)研究结束时腹股沟wat的重量(克(g))。e)研究结束时肾周wat的重量(克(g))。f)研究结束时体重相对于基线的变化(克(g))。在整个研究中每天记录体重。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图14：使用放射性标记的鲑鱼降钙素(125i-sct)作为示踪剂进行的竞争性配体结合测定，并从大鼠(大家鼠(rattusnorvegicus))和人(智人(homosapiens))两种不同物种中进行了2％的血清白蛋白测定。使用0.25nm125i-sct作为示踪剂。a)在2％rsa中进行的竞争性结合测定。b)在2％hsa中进行的竞争性结合测定。数据以+/-sem表示。图15：用于研究kbp-066骨架的酰化位置的kbp-356、kbp-386、kbp-387、kbp-388、kbp-389和kbp-390的单一剂量测试。在t＝0时给予单一剂量，并且监测单一剂量3nmol/kg的每种分子对食物摄入和体重的影响96小时，并与彼此以及与溶媒进行头对头比较，以确定最佳酰化位置。a)短期食物摄入(克)。b)体重变化(克)。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图16：用于研究kbp-021骨架的酰化位置的kbp-391、kbp-312、kbp-313、kbp-314、kbp-315、kbp-316、kbp-317和kbp-318的单一剂量测试。在t＝0时给予单一剂量，并且监测单一剂量3nmol/kg的每种分子对食物摄入和体重的影响96小时，并与彼此或与溶媒进行头对头比较，以确定最佳酰化位置。a)短期食物摄入(克)。b)体重变化(克)。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图17：使用具有相同酰化长度.03、.04和.05但位置不同(a11和a19)的kbp-066化合物在hfdsd大鼠中进行的六周体重减轻研究。每3天单次皮下注射4nmol化合物/kg的kbp-066a11.03(kbp-356)、kbp-066a19.03(kbp-389)或溶媒来给药至大鼠。在整个研究中每天记录体重和食物摄入。a)研究期间的每日食物摄入(克)。b)个体大鼠的体重减轻(克(g))。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图18：使用具有不同酰化长度，.03、.04和.05酰化的kbp-066a11化合物在hfdsd大鼠中进行的体重减轻研究中的其他参数。用kbp-066a11.03或kbp-066a19.03或溶媒处理大鼠。每3天单次皮下注射4nmol化合物/kg来给药至大鼠。a)口服葡萄糖耐量测试。b)ogtt的曲线下增量面积。c)研究结束时附睾wat的重量(克(g))。d)研究结束时腹股沟wat的重量(克(g))。e)研究结束时肾周wat的重量(克(g))。f)研究结束时体重相对于基线的变化(克(g))。在整个研究中每天记录体重。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。图19：使用kbp-356、kbp-384和kbp-385的单一剂量来研究kbp-066骨架的酰化接头。在t＝0时给予单一剂量，并且监测单一剂量4nmol/kg的每种分子对体重的影响96小时，并与彼此比较，以确定最佳酰化接头。a)短期食物摄入(克)。b)体重变化(克)。n＝4只大鼠每组。数据以+/-sem表示。实施例以下实施例中描述的本公开的实施方式是为了帮助理解本公开而提出的，不应解释为以任何方式限制本公开的范围，本公开的范围如在其后的权利要求书中所限定。提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制作和使用所描述的实施方式的完整公开和描述，所述实施例不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是所有的实验或仅进行的实验。已经尽力确保所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。在以下实施例中，采用以下材料和方法。细胞和细胞系购买了以下表达降钙素、胰淀素和cgrp受体的细胞系，并根据制造商的说明培养所述细胞系。1.降钙素受体(ctr)：来自discoverx的u2os-calcr(目录号：93-0566c3)。2.胰淀素受体(amy-r)：来自discoverx的cho-k1calcr+ramp3(目录号：930268c2)。化学品硫黄素t(t3516，sigma)。将测定的储备液tht制成在5mm磷酸钠ph7.2中的10mm溶液。将等分试样在-20℃下避光保存。即将使用前将储备液tht解冻并稀释。对于测试的降钙素模拟物(以下称为“酰化的kbp”或简称为“kbp”)，最终缓冲液条件为10mmtris-hclph7.5。孔中的最终肽浓度应为100至200μm，最终的tht浓度应为4μm。最后添加tht(10μl)。动物模型在动物模型研究中，使用12周龄的健康spraguedawley(sd)大鼠评估了酰化的kbp的效力。在一些实例中，在测试之前和测试期间给它们饲喂普通的食物，而在其他实例中，在测试之前和测试期间的8周内给12周龄的健康sd大鼠饲喂高脂饮食(hfd)。酰化的降钙素模拟物下表1a和1b列出了已测试的酰化的降钙素模拟物的氨基酸序列。如其中所使用的：1酰化是指kac-(谷氨酸接头)-(c16脂肪酸[棕榈酸酯])；2酰化是指kac-(谷氨酸接头)-(c18二酸[十八烷二酸])；3酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c18二酸[十八烷二酸])。4酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c20二酸[二十烷二酸])。5酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c22二酸[二十二烷二酸])。6酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c16二酸[十六烷二酸])。7酰化是指kac-(3xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c18二酸[十八烷二酸])。8酰化是指kac-(3xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c18二酸[十八烷二酸])。9酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c24二酸[二十四烷二酸])。10酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c26二酸[二十六烷二酸])。11酰化是指kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c14二酸[十四烷二酸])。测试的降钙素模拟物基于以下修饰前的核心肽序列：csnlstcmlgrlsqdlhrlqtypktdvganap(kbp089)csnlstc(aib)lgrlsqdlhrlqtypktdvganap(kbp066)cgnlstc(aib)lgrltqdlnkfhtfpktdvganap(kbp062)csnlstcvlgklsqelhklqtyprtdvganap(kbp042)csnlstc(aib)lgrlanflvhssnnfgailpktdvganap(kbp110)csnlstcmlgrlsqelhrlqtypktdvganap(kbp021)在表1b中，还使用了以下附加命名法则：因此，例如，命名kbp-066a11.03表明该肽由kbp-066核心序列组成，该核心序列通过在11位的赖氨酸残基被c18二酸2*oeg酰化取代而被修饰。各种酰化具有以下化学结构：oeg-oeg-yglu-c14二酸(即11酰化)oeg-oeg-yglu-c16二酸(即6酰化)oeg-yglu-c18二酸(即8酰化)oeg-oeg-yglu-c18二酸(即3酰化)oeg-oeg-oeg-yglu-c18二酸(即7酰化)oeg-oeg-yglu-c20二酸(即4酰化)oeg-oeg-yglu-c22二酸(即5酰化)oeg-oeg-yglu-c24二酸(即9酰化)oeg-oeg-yglu-c26二酸(即10酰化)初始酰化研究(实施例1至5)实施例1(图1和图5)不同位置(第9位“a09”，第11位“a11”，第16位“a16”，第18位“a18”和第32位“a32”)的1酰化变体与非酰化基准肽(kbp-089)对12周瘦sd大鼠的食物摄入和体重的影响的单一剂量比较。kbp核心位置/酰化kbp-346kbp-042a11/1酰化kbp-347kbp-089a18/1酰化kbp-349kbp-089a11/1酰化kbp-350kbp-089a12/1酰化kbp-351kbp-089a16/1酰化kbp-352kbp-089a9/1酰化kbp-353kbp-089a32/1酰化在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为六组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：25nmol/kg(^100μg/kg))。将它们禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量的肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时)。测量基线和皮下注射后24小时和48小时的体重。在位置“a09”、“a11”和“a32”进行1酰化的酰化产生了持久的体内响应(图1)，值得进一步测试(参见下文)。第12位(图5)、第16位和第18位返回了不可接受的结果，因此没有进行进一步的实验。实施例2：β-抑制蛋白(β-arrestin)测定pathhunterβ-抑制蛋白gpcr测定是全细胞功能测定，可通过检测β-抑制蛋白与激活的gpcr的相互作用直接测量配体活化gpcr的能力。由于β-抑制蛋白的募集独立于g蛋白信号传导，因此这些测定提供了强大且通用的筛选和分析平台，所述筛选和分析平台几乎可用于任何gi偶联受体、gs偶联受体或gq偶联受体。在该系统中，gpcr与小的酶片段prolinktm框内融合，并在稳定表达β-抑制蛋白和较大的β-gal的n端缺失突变体(称为酶受体或ea)的融合蛋白的细胞中共表达。gpcr的活化刺激了β-抑制蛋白与带prolink标签的gpcr的结合，并迫使这两种酶片段互补，从而形成了活性β-gal酶。这种相互作用导致酶活性的增加，这种酶活性的增加可以使用化学发光的检测试剂进行测量。在独立的生物测定中，在指定的时间点以下表2和表3所示的增加的kbp剂量(100、20、4、0.8、0.16、0.032nm和溶媒)处理ctr和amy-r细胞。在白色384孔板(greinerbio-one，784080)中进行该测定。实验前一天，将细胞以每孔2500个细胞接种到10μl细胞类型特定的培养基中。为了定量gpcr介导的β-抑制蛋白募集，使用了pathhuntertm检测试剂盒(93-0001，discoverx)，并根据制造商的说明进行了相应的测定。持续/持久响应是使用来自discoverx(货号：93-0566c3)细胞系的降钙素受体(ctr)：u2os-calcr进行的，与传统的三小时输出相反，在3、6、24、48或72小时内进行β-抑制蛋白积累，然后测定并分析β-抑制蛋白积累。表2(2酰化)和表3(3酰化)列出了β-抑制蛋白研究的结果。表2.对2酰化(kac-(谷氨酸接头)-(c18二酸)的β-抑制蛋白研究表3.对3酰化(kac-(2xoeg氨基酸与连接至n末端的谷氨酸残基连接在一起)-(c18二酸[十八烷二酸]))的β-抑制蛋白研究β-抑制蛋白研究表明如下：1)就肽上的酰化位置而言，酰化的效力如下：a11>a32>a09。2)就活化降钙素受体(ctr)、胰淀素受体(amy-r)、延长的ctr响应和抑制食物摄入而言，在第11位处的2酰化或3酰化通常针对每种肽核心都是远远优越的酰化/位置组合。3)用相同的酰化修饰时，具有不同核心的酰化kbp在体外证明了相似的效力和模式。实施例3(图2)kbp089的a09(kbp375)、a11(kbp376)和a32(kbp377)的3酰化变体与非酰化基准(kbp-089)对20周hfdsd大鼠的食物摄入和体重的影响的单一剂量比较。kbp核心注释位置/酰化kbp-375kbp-089kbp-089a09.03a9/3酰化kbp-376kbp-089kbp-089a11.03a11/3酰化kbp-377kbp-089kbp-089a32.03a32/3酰化在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为11组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：36nmol/kg(150-157μg/kg))。将它们禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时...144至168小时)。测量基线和皮下注射后每24小时的体重。动物模型研究证实了β-抑制蛋白研究的结果，并证明了其功效相比于裸肽(nakedpeptide)的改善：1)使用kbp-089作为核心肽，就酰化位置的益处而言，a11>a32>a09。2)就持久的体内活性和功效而言，在给定的剂量下2酰化和3酰化远优于未酰化的kbp-089。动物模型研究还表明，与裸肽相比，在第9位酰化会降低该肽的效力，从而排除了第9位作为进一步研究的关注位置。实施例4(图3)具有不同肽核心的a11和a32的3酰化变体与各自的非酰化基准kbp(kbp-066、kbp-062和kbp-110)对20周hfdsd大鼠的食物摄入和体重的影响的单一剂量比较。kbp核心注释位置/酰化kbp-356kbp-066kbp-066a11.03a11/3酰化kbp-358kbp-066kbp-066a32.03a32/3酰化kbp-362kbp-062kbp-062a11.03a11/3酰化kbp-364kbp-062kbp-062a32.03a32/3酰化kbp-368kbp-110kbp-110a11.03a11/3酰化kbp-370kbp-110kbp-110a32.03a32/3酰化在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为11组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：4nmol/kg(^17μg/kg)，12nmol/kg(^50μg/kg)或36nmol/kg(^150μg/kg))。将它们禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时...144至168小时)。测量基线和皮下注射后每24小时的体重。结果如下：1)肽核心不影响通过在11或32位处进行酰化而观察到的改善。2)a11是比a32更好的酰化位点。实施例5(图4)kbp-042和kbp-066的a11/3酰化变体对20周hfdsd大鼠的食物摄入和体重的单一高剂量影响。在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为11组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：300nmol/kg(^1000μg/kg))。kbp核心注释位置/酰化kbp-372kbp-042kbp-042a11.03a11/3酰化kbp-356kbp-066kbp-066a11.03a11/3酰化将大鼠禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量的肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时...188至312小时)。测量基线和皮下注射后每24小时的体重。使用kbp356和kbp372进行的高剂量测试证明了持续数天的优越的持久体内功效。因此，这些酰化的肽是用于开发每周一次的肽治疗剂的明确候选者。实施例6(图6至图10)对化合物kbp-356(kbp-066a11.03)进行进一步的工作，该化合物在肽的第8位包含aib残基，在肽的第11位包含优选的酰化。在雄性zdf大鼠中进行长期研究。(肥胖纯合隐性(fa/fa)品系：370)(charlesriver，美国)。5周龄时运送大鼠。每个笼子饲养2-3只大鼠。雄性zdf大鼠的长期处理：在5周龄时(第-6天)将大鼠运送到nordicbioscience的动物设施中。使大鼠适应环境三天。记录hba1c和bw(第-3天)。在第4天，根据hba1c(主要)和bw(次要)将大鼠随机分组。该研究在第1天开始。剂量浓度和频率每天向动物给药一次kbp-066或盐水(溶媒)。每三天进行一次kbp-066a11.03给药。在中午左右通过皮下(sc)施用进行给药。盐水：剂量体积为1ml/kg。kbp-066：剂量体积为1ml/kg，剂量浓度为5、50或500μg/kg，化合物浓度为5、50或500mg/l。剂量当量(以nmol/kg以)分别为1.43、14.3和143nmol/kg。kbp-066a11.03：剂量体积为1ml/kg，剂量浓度为25μg/kg，化合物浓度为25mg/l。剂量当量(以μg/kg以)为104μg/kg。处理组(nmol/kg)处理组(μg/kg)每个处理组每周总剂量：5μg/kgkbp-066相当于35μg/kg/周或10nmol/kg/周50μg/kgkbp-066相当于350μg/kg/周或100.4nmol/kg/周500μg/kgkbp-066相当于3500μg/kg/周或1004nmol/kg/周25nmol/kgkbp-066相当于243.4μg/kg/周或58.3nmol/kg/周将化合物溶解在盐水中，并在-20℃下保存。在即将施用前解冻等分试样。测试结果的收集第-3天：hba1c测量第1天：(研究的第一天)，大鼠禁食6小时并取bg和血样。随后进行给药。第14天：空腹血糖(fbg)+血液样本(空腹6小时)第28天：fbg+血液样本(空腹6小时)第42天：fbg+血液样本(空腹6小时)第57天：(gr.1+2)/第58天(gr.3+4)otgg，未预先给药kbp-066或kbp-066a11.03(11小时禁食)。在ogtt期间在t＝120或t＝180时测量hb1ac。第62天：fbg+血液样本(空腹6小时)食物摄入每天监测食物摄入。在前三周每天监测体重，然后在第三周后每周监测两次体重。空腹血糖使用监测系统(rochediagnostics，rotkreuz，瑞士)每两周监测空腹血糖：从尾静脉(25g针头)进行测量。hba1c对于第一次(随机)和第二次(第二次ogtt之后)hba1c测量，大鼠是未禁食的。将一滴血加到hba1c盒上，并使用dcavantage分析仪测量hba1c。随后在第一次和第二次hba1c测量过程中进行化合物或盐水给药。口服葡萄糖耐量测试处理八周后进行了葡萄糖耐量测试(ogtt)。使用前一天的体重计算给予的葡萄糖剂量。动物禁食11小时。在时间点-30分钟之前约45分钟施加热量(请参见下图)。在第一次ogtt期间向动物预给药kbp-066、kbp-066a11.03或盐水，但在第二次ogtt中则不给药，由此即下图中的(c)。ogtt表b＝血样(edta)，约200-300μlbg＝血糖g＝葡萄糖(口服1g葡萄糖/kgbw，2ml/kg)c＝化合物(或盐水)(sc.)结果图6a+b：累积食物摄入图6a示出了研究期间的累积食物摄入。所有处理组的饮食均少于溶媒。此外，更高的剂量导致更高的食物摄入减少。与所有剂量的kbp-066相比，酰化kbp-066a11.03处理组的食物摄入减少最多。在研究结束时，与溶媒相比，所有处理组在研究过程中所消耗的食物均显著减少，酰化kbp-066a11.03处理显示食物摄入量减少最多；相比于溶媒，食物摄入减少了约35％(图6b)。图7a+b，体重在研究的前三周，所有处理组均体重减轻。随着zdf溶媒大鼠逐渐病重，因此无法维持其体重/增重速率(图7a)，处理组在体重方面赶上了溶媒组。与溶媒相比，增重速率取决于剂量，也取决于处理组中使用的化合物的类型(图7b)。酰化kbp-066a11.03处理组的恢复速率最慢，其次是14.3和143nmol/kg组，而体重恢复最快的是1.43nmol/kg。这显示，相比于每天一次皮下给予未酰化kbp-066，以皮下给药方案每三天给予一次酰化kbp-66a11.03具有额外的药理学益处。图8，空腹血糖由于zdf溶媒大鼠病情逐渐加重，无法维持fbg，因此与溶媒相比，所有处理组在研究期间均有效减弱fbg。酰化kbp-066a11.03处理是最有效的处理，在这种2型糖尿病的超级攻击性动物模型的62天研究过程中，使得fbg仅适度地增加5mm。未酰化kbp-066以剂量依赖性方式降低fbg，但在减弱fbg方面不如酰化处理组有效。同样，这显示，相比于非酰化kbp-066，酰化kbp-66a11.03具有额外的药理学益处。图9，基线和研究结束时的hba1c正如预期的，雄性zdf大鼠中在糖尿病发作和处理程序之前的基线hba1c值几乎相同(图9a)。在研究结束时(第62天)，与溶媒相比，所有处理组的hba1c水平均显著降低。有趣的是，酰化kbp-066a11.03处理组的hba1c值最低。此外，它也显著低于所有未酰化kbp-066处理组(图9b)，表明了酰化相比于未酰化等效物的进一步优势。图10，口服葡萄糖耐量测试(ogtt)处理八周后进行了口服葡萄糖耐量测试，结果如图10a所示。由于处理引起的fbg差异，个体ogtt曲线明显不同。在计算的tauc值中突出显示了这种差异(图10b)。与溶媒相比，所有处理组的tauc均显著更低。酰化kbp-066a11.03处理组的tauc值最低，并且也显著低于三组未酰化kbp-066处理组中的两组，与最后一组143nmol/kgkbp-066相比，p值为0.06(图10b)。总之，集体数据显示，在肥胖和糖尿病zdf大鼠中，相比于每天一次皮下给予未酰化kbp-066，以皮下给药方案每三天给予酰化kbp-66a11.03具有额外的药理学益处。实施例1至6的结果总结通过酰化部位进行酰化研究的结果位置a09(在肽的第9位处酰化)在位置“a09”具有1酰化的酰化产生了持续的长时间体内活性，值得进一步测试(图1a至f)。此外，位置a09具有2酰化和3酰化的酰化减弱了对ctr和amyr受体的ec50，并且不会对ctr产生长时间响应(表3-4)。然而，a09具有2酰化和3酰化的酰化破坏了先前观察到的核心肽的长时间的体内功效，从而使得酰化的kbp的效力类似于溶媒。因此，在单次皮下注射36nmol/kg化合物后，它们在减少食物摄入和减轻体重两者方面均比未酰化核心肽(图2a-b)效力低。因此，不再考虑位置a09。位置a11(在肽的第11位处酰化)位置a11具有1酰化的酰化产生了持续的长时间体内活性，值得进一步测试(图1a至f)。位置a11具有2酰化和3酰化的酰化得到最佳的对ctr和amyr受体的测定ec50，并在所有测试的核心肽中产生最高的长时间响应值(tauc)(表3-4)。此外，在单次皮下注射36nmol/kg化合物后，在减少食物摄入(图2a)和减轻体重(图2b)方面，与非酰化核心肽相比，a11/3酰化显著改善了核心肽的体内活性。当使用kbp-089作为核心肽时，a11/3酰化在减少食物摄入和减轻体重方面也比其他任何酰化位置更好(图2a至b)。在剂量响应测试(图3a至f)中进一步强调了这种差异，其中三种剂量(4nmol/kg，12nmol/kg和36nmol/kg)均优于相应的a32/3酰化肽。就效力而言，最低剂量4nmol/kg的a11/3具有与36nmol/kg的a32/3酰化肽相似的谱。这对于所有测试的核心肽均得到了一致的证明(图3a至f)。为了进一步研究具有3酰化的a11位置的效力，以高剂量(300nmol/kg)测试了在位置a11处具有3酰化的酰化kbp-042和kbp-066，并与非酰化版本进行了比较，以证明持久的体内功效以及持久的生物利用度的潜在最大作用(图4a至d)。对于kbp-042(图4a)和kbp-066(图4c)，位置a11进行的3酰化减弱了食物摄入持续超过120小时，在^144小时后，恢复到溶媒的食物消耗水平。对于kbp-042(图4b)和kbp-066(图4d)，处理介导的体重减轻在96小时后达到峰值，并且在^240小时后体重恢复到基线水平。总之，就保留配体效力和最大化持久的体内功效而言，a11是测试的最佳位置。位置a12(在肽的第12位处酰化)与溶媒相比，在4小时食物摄入研究中，具有1酰化的a12位置在体内产生的结果较差(图5)。因此，位置a12不是酰化的良好候选者，未进行进一步测试。位置a16(在肽的第16位处酰化)具有1酰化的a16位置证明了没有体内长时间活性(图1a至f)。因此，位置a16不是使用1酰化的良好候选者，未进行进一步测试。位置a18(在肽的第18位处酰化)具有1酰化的a18位置在4至24小时的测试期间是有效的，但是延长的活性研究中并未保持所观察到的功效(kbp-347，48h，图1f)。因此，位置a18不是使用1酰化的良好候选者，未进行进一步测试。位置a32(在肽的第32位处酰化)具有1酰化的a32位置证明了对食物摄入和体重的体内长时间作用，并且是测试化合物中最好的化合物之一(图1a至f)。与位置a11相比，具有2酰化和3酰化的位置a32导致对ctr和amyr受体的ec50测定值均较差。与位置a11相比，位置a32的酰化稍微减弱了ctr介导长时间响应，但仍保持了长时间响应(表3-4)。对于所有测试核心肽，与非酰化对应物相比，位置a32的酰化改善了单一剂量皮下处理的体内功效。但是，在体内研究期间，在等效剂量下，该位置在所有测试的2酰化和3酰化中均比a11更差(图2a至b，图3a至f)。总之，就使用1酰化、2酰化和3酰化保持配体效力和改善体内功效而言，与位置a11相比，a32是普通的位置。进一步的酰化研究(实施例7至12)实施例7：β-抑制蛋白和硫黄素t测定使用与上文结合实施例2所描述的相同的方案，进行另外的pathhunterβ-抑制蛋白gpcr测定。在独立的生物测定中，在指定的时间点以表4.1至4.4所示的增加的kbp剂量(范围1μm至0.1nm和溶媒)处理ctr和amy-r细胞。还进行了硫黄素t测定。硫黄素t(tht)是一种广泛用于淀粉样蛋白原纤维检测的染料。在存在原纤维的情况下，tht在450nm处具有最大激发光，在480nm处具有增强的发射，而tht在未结合淀粉样蛋白原纤维时在这些波长下基本上是无荧光的。因此，tht与荧光酶标仪结合使用，是筛选大量体外样品中是否存在淀粉样蛋白原纤维的理想工具。用于kbps的tht测定是对nielsen等人(nielsenl,khuranar,coatsa,s,brangej,vyass,等人.环境因素对胰岛素原纤维形成动力学的影响：分子机制的阐明(effectofenvironmentalfactorsonthekineticsofinsulinfibrilformation:elucidationofthemolecularmechanism).生物化学(biochemistry).2001；40(20):6036-46.1)描述的用于测量胰岛素原纤化的过程的改进。在384孔板(greinerbio-one，784080)中样品一式三份地进行原纤化筛选测定，最终体积为20μl。使用光学粘合膜将板密封，以防止样品在测定过程中蒸发。将该板装入荧光酶标仪中，例如带有softmaxpro7.0.2软件的spectramax，并将模板设置为37℃，激发波长为450nm，发射波长为480nm。酶标仪应每10分钟测量一次荧光，持续24小时，在第一次读数之前先晃动5秒，然后在所有其他读数之前晃动3秒。可替代地，在以下孵育时间后读板：0、1、2、4和24小时。绘制相对荧光单位(rfu)作为时间的函数。如nielsen等人所述，原纤化被确定为rfu增加超过基线。在本递交文件中，基于18h荧光信号定义了四个原纤化层次，以获得反映肽原纤化潜力的单一输出：无＝<1000rfu，低＝1000至3000rfu，中＝3000至10000，高＝>10000。硫黄素t测定的结果也在表4.1至4.4中显示。表4.1.对不同酰化长度(kac-(谷氨酸接头)-(c14至c26二酸))的β-抑制蛋白研究表4.2.使用骨架(kbp-066)和3酰化(kac-(谷氨酸接头)-(c18二酸))，对不同酰化位置的β-抑制蛋白研究表4.3使用骨架(kbp-021)和3酰化(kac-(谷氨酸接头)-(c18二酸))，对不同酰化位置的β-抑制蛋白研究表4.4使用骨架(kbp-066)和相同的酰化(c18二酸)，对不同酰化接头的β-抑制蛋白研究结果-酰化长度就根据酰化长度的体外效力而言，在酰化长度和体外效力之间存在明显的相关性。由最短酰化(11(c14二酸)和6(c16二酸))得到的对ctr和amyr的ec50值，在两种受体上产生最低的ec50(表4.1)，而最长酰化(9(c24二酸)和10(c26二酸))，在两种受体上产生记录到的最高的ec50值。使用kbp-066骨架的该系列中测试的酰化肽均无任何原纤化问题。结果-kbp-066骨架上的酰化位置表4.2列出了该系列的对ctr和amyr的ec50值。就根据kbp-066骨架上的酰化位置的体外效力而言，三个位置突出地作为有效的降钙素和胰淀素受体的双重激动剂。a11、a19和a24对两种受体均具有唯一的5×10-9m范围的ec50值，而相比之下，所有其他测试的位置均是有缺陷的。a11、a19和a24的效力的提高似乎转化为kbp-066骨架的体内功效的改善(参见下文描述的图15、17和18)。有趣的是，a09是最好的ctr激动剂之一，但具有较差的amyr活性，这提示接近n-末端的酰化会破坏amyr活性并产生有偏向的配体。在大多数位置处，对于kbp-066骨架而言，原纤化似乎不是问题，因为在tht测定中只有一种肽(kbp-066a16.03(387))产生“低”评分。结果-kbp-021骨架上的酰化位置表4.3列出了该系列的对ctr和amyr的ec50值。就根据kbp-021骨架上的酰化位置的体外效力而言，两个位置突出地作为有效的双重激动剂。a11和a19对两种受体均具有唯一的5×10-9m范围的ec50值，而相比之下，所有其他测试的位置均是有缺陷的。a11和a19效力的提高也似乎转化为kbp-021骨架的体内功效的改善(参见下文描述的图16)。有趣的是，原纤化似乎是kbp-021骨架的问题，作为唯一测试的肽，位置a19尽管在体外和体内均具有良好的效力，但是在tht测定中评分为“高”分数。在tht测定中，其旁边的位置“a18”也以“中”分数获得高分，提示kbp-021骨架在骨架的该区域被酰化时容易发生原纤化。此外，更长的酰化似乎也增加了该骨架kbp-021的原纤化，因为a11位置的4酰化和5酰化在tht测定中评分为“低”分数，然而，该问题并没有影响有利的具有3酰化的位置a11。结果-酰化接头表4.4列出了该系列的对ctr和amyr的ec50值。就根据kbp-066骨架上的酰化位置的体外效力而言，与oeg-oeg-oeg-γglu(385)和oeg-γglu(384)相比，oeg-oeg-γglu接头(356)对ctr的ec50值为几乎10倍好，但是，所有接头对amyr具有在5×10-9m范围内的非常相似的ec50。在原纤化方面，最短的接头oeg-γglu(384)在tht测定中产生了“低”评分，而其他两个接头产生了“无”分数。实施例8(图11)在相同位置和骨架(分别为a11和kbp-066)的数种酰化变体(3、4、5、6、9、10、11)对实验前饲喂8周hfd的20周龄sd大鼠在短期环境下的食物摄入和体重的影响的单一剂量比较。kbp核心酰化长度注释位置/酰化kbp-356kbp-066c18二酸kbp-066a11.03a11/3酰化kbp-383kbp-066c20二酸kbp-066a11.04a11/4酰化kbp-382kbp-066c22二酸kbp-066a11.05a11/5酰化kbp-381kbp-066c16二酸kbp-066a11.06a11/6酰化kbp-307kbp-066c24二酸kbp-066a11.09a11/9酰化kbp-306kbp-066c26二酸kbp-066a11.10a11/10酰化kbp-305kbp-066c14二酸kbp-066a11.11a11/11酰化在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为8组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：3nmol/kg(^10-11μg/kg))。将它们禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时，48至72小时，和72至96小时)。测量基线和皮下注射后4小时、24小时、48小时、72小时和96小时的体重。图11结果-食物摄入和体重6酰化、10酰化、11酰化能够减弱食物摄入和体重，并在24小时达到峰值抑制，然后反弹至溶媒水平。9酰化能够减弱食物摄入和体重，并在48小时达到峰值抑制，然后反弹至溶媒水平。3酰化能够减弱食物摄入和体重，并在72小时达到峰值抑制，然后反弹至溶媒水平。4酰化和5酰化能够减弱食物摄入和体重，并在96小时后达到峰值抑制，然后反弹。因此，3酰化、4酰化和5酰化都是酰化长度的主要候选者，这是因为最初的目标是抑制食物摄入和体重最少72小时，因为在啮齿类动物中每3天给药一次相当于在人类中每周给药一次。实施例9(图12、13和14)对短期试验中表现最好的酰化变体(3、4、5)进行了进一步的研究，并使用重复给药进行研究，以比较具有相同位置和骨架(分别为a11和kbp-066)的酰化的效果。在研究开始之前，在饲喂hfd8周的20周龄sd大鼠中，在长期环境(五周研究)中研究食物摄入量和体重。kbp核心酰化长度注释位置/酰化kbp-356kbp-066c18二酸kbp-066a11.03a11/3酰化kbp-383kbp-066c20二酸kbp-066a11.04a11/4酰化kbp-382kbp-066c22二酸kbp-066a11.05a11/5酰化将大鼠两两置于笼中，按体重随机分成处理组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：3nmol/kg(^14μg/kg))。每天监测食物摄入和体重，持续35天。在研究结束时，先进行ogtt，然后处死动物，然后取出脂肪组织并称重。雄性hfdsd大鼠的长期处理将大鼠在12周龄时运送到nordicbioscience的动物设施中，立即以hfd再饲喂八周。在研究开始之前，根据体重将大鼠随机分组。该研究在第1天开始。剂量浓度和频率每三天向动物给药一次kbp。每天中午左右通过皮下(sc)施用进行给药。将化合物溶解在盐水中，并在-20℃下保存。在即将施用前解冻等分试样。盐水：剂量体积为1ml/kg。kbp：剂量体积为1ml/kg，剂量浓度为4nmol/kg。剂量当量(μg/kg)为^14μg/kg。每个处理组的每周总剂量：4nmol/kgkbp相当于28nmol/kg/周或^100μg/kg/周测试结果的收集第1天：(研究的第一天，进行给药第1至35天：每日监测食物摄入和体重第35天：研究结束时的体重第35天：口服葡萄糖耐量测试。第35天：处死+脂肪组织称重口服葡萄糖耐量测试。处理五周后进行了葡萄糖耐量测试(ogtt)。使用前一天的体重计算给予的葡萄糖剂量。动物禁食11小时。在时间点-30分钟之前约45分钟施加热量(请参见下图)。在ogtt的前一天，向动物给药kbp或溶媒。ogtt表bg＝血糖g＝葡萄糖(口服1g葡萄糖/kgbw，2ml/kg)白色脂肪组织(wat)称重解剖整个附睾和肾周wat库(watdepot)并称重。对于腹股沟wat，切下固定的解剖限制区域并称重。图12结果，食物摄入量和体重图12显示了长期研究期间作为处理时间的函数的食物摄入和体重的变化。图12a显示了3酰化、4酰化和5酰化之间的食物摄入的动态，而图12b显示了3酰化、4酰化和5酰化介导的体重减轻。显然，在处理5周后，所有三种酰化均使体重显著降低，但是，3酰化、4酰化和5酰化在对体重的功效上没有差异。图13结果，ogtt和脂肪组织图13显示了具有相应iauc(ogtt)的ogtt的结果(图a+b)，以及附睾、腹股沟和肾周三种不同脂肪组织的重量(图13c至e)，以及研究终点的体重(图13f)。用3酰化处理导致iauc(ogtt)、附睾wat大小、周围wat大小和作为研究的体重显著降低。用4酰化和5酰化处理导致iauc(ogtt)、附睾wat大小和研究终点的体重显著降低，但周围wat大小未显著降低。几种处理均未显著减少腹股沟wat的大小。与4/5相比，3酰化的性能略好于溶媒，但处理组之间无显著差异。图14结果，竞争性i-125sct配体结合为了研究在短期环境下4酰化和5酰化的改善功效是否可以转化到人身上，进行了竞争性配体结合测定以研究酰化与啮齿动物和人中的血清白蛋白的结合。图14显示了kbp-066a11.03和kbp-066a11.05与放射性标记的i-125鲑鱼降钙素(nex423，perkinelmer)在2％啮齿动物血清白蛋白(rsa)(图4a)或2％人血清白蛋白(hsa)(图4b)中的竞争性结合。当进行2％hsa测定时，3酰化和5酰化之间的ec50没有差异。但是，当在rsa中进行测定时，5酰化使ic50进一步向右移动，提示在测定中对rsa的亲和力更强。因此，在啮齿动物的短期环境中观察到的改善的功效最有可能是啮齿动物独有的现象，而不能转化到人身上。实施例10(图15)不同位置(第9位“a09”，第11位“a11”，第12位“a12”，第16位“a16”，第18位“a18”，第19位“a19”和第32位“a32”)的3酰化变体彼此之间对20周hfdsd大鼠的食物摄入和体重的影响的单一剂量比较。kbp核心注释位置/酰化kbp-354kbp-066kbp-066a09.03a9/3酰化kbp-356kbp-066kbp-066a11.03a11/3酰化kbp-386kbp-066kbp-066a12.03a12/3酰化kbp-387kbp-066kbp-066a16.03a16/3酰化kbp-388kbp-066kbp-066a16.03a18/3酰化kbp-389kbp-066kbp-066a18.03a19/3酰化kbp-390kbp-066kbp-066a19.03a24/3酰化kbp-358kbp-066kbp-066a24.03a32/3酰化在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为8组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：4nmol/kg(^10-11μg/kg))。将它们禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时，48至72小时，和72至96小时)。测量基线和皮下注射后4小时、24小时、48小时、72小时和96小时的体重。测试了两种骨架，kbp-066和kbp-021。图15结果–食物摄入和体重就骨架上的位置而言，kbp-066的结果如下。在短期环境下，以4nmol/kg的剂量(图5)，位置a11和a19在抑制食物摄入72小时和抑制体重96小时方面是两个最佳位置。第三佳位置是a24，然后是a18和a16。效力最差的酰化位置是a12，由于它似乎在某种程度上干扰了dacra介导的对食物摄入和体重的功效，因此看起来是不利的酰化位置。基于这些数据，a11和a19是酰化骨架kbp-066的优选位置。图16结果–食物摄入和体重当以与kbp-066相同的实验环境使用不同骨架kbp-021时，位置模式略有不同。kbp核心注释位置/酰化kbp-312kbp-021kbp-021a09.03a9/3酰化kbp-391kbp-021kbp-021a11.03a11/3酰化kbp-313kbp-021kbp-021a12.03a12/3酰化kbp-314kbp-021kbp-021a16.03a16/3酰化kbp-315kbp-021kbp-021a16.03a18/3酰化kbp-316kbp-021kbp-021a18.03a19/3酰化kbp-317kbp-021kbp-021a19.03a24/3酰化kbp-318kbp-021kbp-021a24.03a32/3酰化在短期环境下，以3nmol/kg的剂量(图6)，位置a11和a19在抑制食物摄入72小时和抑制体重96小时方面是两个远远最佳位置，就像kbp-066骨架所观察到的那样。第三佳位置是a18，但与a11和a19相比要差得多。a24位置比溶媒好，但与对kbp-066骨架观察到的相去甚远。在食物摄入和体重上，位置a16，a12和a09均与溶媒不相上下，表明它们所被酰化的位置是不利的，正如由肽活性所推断的。但是，如体外特性表4.3所示，与kbp-021结合使用时，a19和a18在原纤化潜力方面存在重大问题，这使得对于骨架kbp-021来说a11成为优选的酰化位置。实施例11(图17和18)对短期试验中表现最好的酰化位置(a11和a19)进行了进一步的研究，并使用重复剂量进行研究，以比较具有相同酰化和骨架(即分别为3酰化和kbp-066)的酰化的效果。在研究开始之前，在饲喂hfd8周的20周龄sd大鼠中，在长期环境(五周研究)中研究食物摄入量和体重。kbp核心酰化位置注释位置/酰化kbp-356kbp-066a11kbp-066a11.03a11/3酰化kbp-389kbp-066a19kbp-066a19.03a19/3酰化遵循上文实施例9中所述的实验方案。简而言之，将大鼠两两置于笼中，按体重随机分成处理组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：4nmol/kg(^14μg/kg))。每天监测食物摄入和体重，持续35天。在研究结束时，先进行ogtt，然后处死动物，然后取出脂肪组织并称重。图17结果-长期环境下a11和a19的食物摄入量和体重图17显示了长期研究期间作为处理的函数的随时间过去的食物摄入(图17a)和体重(图17b)的变化。显然，a11和a19都以相似的方式抑制食物摄入，并在处理5周后使体重显著降低，但是，位置a11和a19之间在对体重的功效上没有差异。图18结果，ogtt和脂肪组织图18显示了具有相应iauc(ogtt)的ogtt的结果(图a+b)，以及附睾、腹股沟和肾周三种不同脂肪组织的重量(图18c至e)，以及研究终点的体重(图18f)。用位置a11处理导致iauc(ogtt)、附睾wat大小、肾周wat大小和作为研究的体重显著降低。用位置a19处理导致iauc(ogtt)、附睾wat大小和作为研究的体重显著降低，但周围wat大小未显著降低。几种种处理均未显著减少腹股沟wat的大小。与位置a19相比，位置a11相对于溶媒性能稍好，但处理组之间无显著差异。实施例12(图19)在相同位置和骨架(分别为a11和kbp-066)的三种酰化接头变体(3、7和8)对实验前饲喂8周hfd的20周龄sd大鼠在短期环境下的食物摄入和体重的影响的单一剂量比较。kbp核心酰化长度酰化接头注释位置/酰化kbp-356kbp-066c18二酸oeg-oeg-γglukbp-066a11.03a11/3酰化kbp-385kbp-066c18二酸oeg-oeg-oeg-γglukbp-066a11.07a11/7酰化kbp-384kbp-066c18二酸oeg-γglukbp-066a11.08a11/8酰化在测试前四天将大鼠单笼饲养。将大鼠按体重随机分为8组(溶媒(0.9％nacl)，kbp(剂量：4nmol/kg(^13-14μg/kg))。将它们禁食过夜，然后在早晨使用皮下施用以单剂量肽或溶媒处理。用以下间隔监测食物摄入(0至4小时，4至24小时，24至48小时，48至72小时，和72至96小时)。测量基线和皮下注射后4小时、24小时、48小时、72小时和96小时的体重。图19结果-食物摄入和体重测试的所有三种接头在短期环境下均能良好工作，并且均在反弹前长达72小时内减弱食物摄入(图19a)。96小时后，3酰化略优于7酰化和8酰化。这在相应的体重减轻上很明显(图19b)，其中3酰化较早在24小时之内与7酰化和8酰化分离，并在随后的两个时间点72小时和96小时继续分离。此外，8酰化似乎就原纤化潜力(表4.4)而言有一些较小的倾向，可能会使进一步开发使用该类型的酰化的化合物复杂化。实施例7至12的结果总结酰化长度从图11至14和表4.1采集的数据表明，在针对人的每周一次给药方案开发酰化肽时，在c18二酸至c22二酸范围内，3酰化、4酰化和5酰化是可互换的。因此，对于本发明，c18、c20和c22二酸是优选的酰化长度。酰化位置从图15、17和18采集的数据表明，当使用kbp-066骨架和3酰化时，a19在短期环境中可能有微弱优势，而a11在长期环境中可能有微弱优势。当与kbp-066骨架组合时，a11和a19都没有任何原纤化问题(表4.2)。总体而言，这些数据表明，连同kbp-066的酰化位置a11和a19是用于开发人的每周一次给药方案的两个最全面的酰化位置。因此，a11和a19是酰化kbp-066的优选位置。同样，基于表4.3和图16，显然，当与kbp-021结合时，a11和a19是两个最佳的酰化位置。但是，由于a19在这种情况下非常易于原纤化，因此基于整体性能，具有3酰化的a11是kbp-021骨架的优选酰化位置和长度。酰化接头根据该测试和表4.4，似乎oeg-oeg-γglu接头是最佳的接头，因为将其缩短会产生潜在的原纤化问题，而延长它最多不会起作用。此外，如图19所示，oeg-oeg-γglu接头在体内短期环境中也表现最好，使其成为整体上优选的酰化接头。在本说明书中，除非另有明确说明，否则使用词语“或”的含义是在满足所述条件的任一个或两者时返回真值的运算符，而不是要求仅满足条件之一的运算符“排他性地或”。词语“包含”的含义是“包括”，而不是“由...组成”。以上公认的所有先前的教导通过引用并入本文。当前第1页12