用于治疗铜缺乏的组合物和使用方法

用于治疗铜缺乏的组合物和使用方法
1.相关申请的交叉引用本专利申请要求2018年7月12日提交的美国临时申请号62/697,207的优先权，并通过引用并入其整个公开内容。
2.关于联邦资助的研究的声明本发明在国立卫生研究院颁布的gm111672下在政府支持下完成。政府具有本发明中的某些权利。
技术领域
3.本公开内容总体上涉及铜缺乏，并且更具体地但非限制性地涉及用于治疗铜缺乏的组合物及其使用方法。
4.背景本部分提供背景信息以促进对本公开内容的各个方面的更好理解。应当理解，应从这一角度来阅读本文件的该部分中的陈述，而不是作为现有技术的承认。
5.铜是细胞色素c氧化酶(cco)（线粒体呼吸链的末端酶）的重要辅因子。编码铜递送至cco所需的蛋白的几个基因中的遗传性功能缺失突变导致受影响婴儿中的cco活性降低和严重病理。铜补充恢复具有这些基因中的两个（coa6和sco2）的突变的患者细胞中的cco功能，从而提示潜在的治疗方案。但是，直接铜补充法尚未在人类患者中成为治疗上有效的，这凸显了鉴定高效铜转运药理剂的需求。利用基于候选物的方案，鉴定了一种研究性抗癌药物伊来司莫(es)，该药物通过增加线粒体铜含量和恢复cco活性来拯救coa6缺陷型酵母细胞的呼吸缺陷。es还拯救铜代谢的其它酵母突变体中的呼吸缺陷，从而提示更宽的适用性。低纳摩尔浓度的es在铜缺乏的斑马鱼模型中和在一系列铜缺乏的哺乳动物细胞（包括从sco2患者衍生出的那些）中恢复了cco的含铜亚基。本文呈现的发现揭示，es可以通过模仿缺失的铜的转运蛋白和伴侣蛋白的功能来恢复细胞内铜稳态，并且可以具有治疗人类铜代谢病症的潜力。
6.铜向细胞色素c氧化酶(cco)的递送所需的基因中的遗传致病突变扰乱线粒体能量代谢并导致致命的线粒体疾病。通过直接补充铜来治疗具有这些突变的人类患者的先前尝试是不成功的，可能是由于向线粒体的无效铜递送。进行了有针对性的搜索以鉴定可以有效地跨生物膜转运铜的化合物，并将一种研究性抗癌药物伊来司莫鉴定为最有效的铜递送剂。伊来司莫通过增加细胞和线粒体铜含量来拯救铜缺乏的酵母、斑马鱼和哺乳动物模型中的cco功能。因此，本公开内容提供了重新使用该抗癌药物用于治疗铜代谢病症的可能性。
7.本发明的开发部分地由韦尔奇基金会（welch foundation）在授权号a
‑
1810下资助。
8.发明概述提供本概述来介绍一些概念，所述概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述并不旨在鉴定所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在用作限制所要求保护的主
可以包括、但不限于
−
h、
−
or8、
−
nr
10
r
11
、
−
c(o)r8、
−
c(o)or8、
−
oc(o)r8、
−
c(o)nr
10
r
11
、
−
nr9c(o)r8、
−
op(o)(or8)2、
−
sp(o)(or8)2、
−
sr8、
−
s(o)
p
r8、
−
os(o)
p
r8、
−
s(o)
p
or8、
−
nr9s(o)
p
r8、
−
s(o)
p
nr
10
r
11
、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，p是1或2。在一些实施方案中，r8、r9、r
10
和r
11
可以各自独立地包括、但不限于
−
h、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，r
10
和r
11
中的至少一个与它们所连接的氮一起形成杂环基或杂芳基。
15.在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种药物组合物，其具有图11b中所示的结构、或其互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物、笼形化合物或前药。在一些实施方案中，所述组合物还包括赋形剂，所述赋形剂可以包括、但不限于盐、溶剂、缓冲剂、稀释剂、粘合剂、压缩助剂、造粒剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、片剂包衣、片剂薄膜、着色剂或它们的组合。在一些实施方案中，x1、x2、x3和x4可以各自独立地包括、但不限于o、s、se、te、po、n(r7)
m
、p(r7)
m
、as(r7)
m
、sb(r7)
m
或bi(r7)
m
或它们的组合。在一些实施方案中，m是0或1。在一些实施方案中，r1、r2、r3、r4、r5和r6可以各自独立地包括、但不限于
−
h、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、
−
or8、
−
nr
10
r
11
、
−
c(o)r8、
−
c(o)or8、
−
oc(o)r8、
−
c(o)nr
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r
11
、
−
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−
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−
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p
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−
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p
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−
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p
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−
nr9s(o)
p
r8、
−
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p
nr
10
r
11
、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，r7可以包括、但不限于
−
h、
−
or8、
−
nr
10
r
11
、
−
c(o)r8、
−
c(o)or8、
−
oc(o)r8、
−
c(o)nr
10
r
11
、
−
nr9c(o)r8、
−
op(o)(or8)2、
−
sp(o)(or8)2、
−
sr8、
−
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p
r8、
−
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p
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−
s(o)
p
or8、
−
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p
r8、
−
s(o)
p
nr
10
r
11
、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，p是1或2。在一些实施方案中，r8、r9、r
10
和r
11
可以各自独立地包括、但不限于
−
h、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，r
10
和r
11
中的至少一个与它们所连接的氮一起形成杂环基或杂芳基。
16.本发明的一个实施方案涉及用于治疗铜代谢病症的化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物由图12中所示结构表示。
17.附图简要说明通过结合附图参考下面的详细描述可以获得对本公开内容的方法和组合物的更完整的理解，在附图中：图1说明了伊来司莫的半数有效剂量(ed
50
)的确定。在有递增浓度(0.01 nm至1
µ
m)的伊来司莫(es)存在下在37℃在ypge培养基中培养酵母coa6δ细胞。在生长58小时以后，通过分光光度计法在600 nm测量细胞密度。数据代表来自三次独立测量的平均值
±
sd。
18.图2a、2b、2c、2d和2e说明了伊来司莫补充通过恢复酵母酿酒酵母（s. cerevisiae）coa6δ细胞的线粒体铜水平而拯救cco组装缺陷。图2a
‑
2c说明了在yp半乳糖培养基中培养野生型(wt)、coa6δ和补充了20 nm es的coa6δ细胞的生物能量参数，直到静止生长期早期。图2a显示了耗氧率(ocr)测量值。图2b显示了超级复合物的定量。图2c显示了cco活性的定量。图2d显示了线粒体铜水平。图2e显示了总细胞铜含量。误差条代表平
均值
±
sd (n = 3, 双尾未配对student氏t
‑
检验*p < 0.05, **p < 0.005)。
19.图3a和3b说明了coa6δ细胞的呼吸生长的伊来司莫拯救依赖于铜可用性。在有10 nm es、20
µ
m铜螯合剂浴铜灵二磺酸(bcs)或二者的组合存在下在ypge培养基中在37℃培养by4741 wt（图3a）和coa6δ（图3b）细胞。在指定的时间点在600 nm通过分光光度计法测量细胞密度。数据是两个独立实验的代表。
20.图4a和4b说明了es补充在增加ctrl1
‑
/
‑ꢀ
h9c2大鼠心肌细胞中的铜水平(a)和细胞色素c氧化酶亚基cox1和超氧化物歧化酶sod1水平(b)中的作用。atp5a是线粒体atp合酶的亚基，并被用作蛋白质印迹法实验的负载对照。
21.图5a和5b说明了用递增浓度的伊来司莫处理过的永生化的和原代的人成纤维细胞细胞系的细胞生存力。图5a显示了永生化的对照(mch46)和sco2患者成纤维细胞。图5b显示了在dmem含葡萄糖的培养基中培养的原代人皮肤成纤维细胞(mw28)，其用递增浓度的es处理36小时。通过cell
‑
titre glo测定(promega)定量总细胞atp水平，从而测量细胞生存力。将数据表示为平均值
±
sd (n = 3)。
22.图6a、6b、6c和6d说明了伊来司莫处理改善在coa6敲低胚胎中观察到的形态学缺陷。图6a显示了用指示浓度的es处理过的斑马鱼胚胎。图6b显示了在受精后3小时(hpf)用指示浓度的es、铜和二者的组合处理过的斑马鱼胚胎。在指定的时间点计数存活下来的鱼(对于每种处理，n≥30)。图6c显示了在指定的时间点(hpf)未处理的和es处理过的coa6敲低斑马鱼胚胎的表型评分。在3 hpf用或不用100 nm es处理50个受精胚胎的批次，所述受精胚胎注射了翻译阻断或错配对照吗啉代试剂（morpholinos），然后在指定的时间点做出观察(对于每个时间点和处理，n≥30)。图6d显示了在指定的时间点用es处理过的注射了错配对照吗啉代试剂或coa6翻译阻断吗啉代试剂的斑马鱼胚胎的心率(n≥30/组；数据代表平均值
±
sem)。nt，无处理；es，伊来司莫。
23.图7说明了伊来司莫
‑
cu的2次注射阻止门克斯病(mo
‑
br)小鼠的早期死亡。在出生后第7和10天皮下注射es
‑
cu(ii)以后小鼠的kaplan
‑
meier存活。进行log
‑
rank统计分析以评估在mo
‑
br小鼠组群中的存活的显著性。用3.625 mg/kg/剂处理mo
‑
br小鼠。es
‑
cu(ii)经历了81.5%的10周存活率，具有63.4
±
15.8天的平均存活时间，与此相比，仅媒介物为14.2
±
0.2天，cu(ii)
‑
2组氨酸盐的等同cu
2+
剂量为18.2
±
1.1天，且3.15 mg/kg/剂的等同仅伊来司莫剂量为17.0
±
0.9天(p < 0.0001)。
24.图8说明了在出生后第7和10天皮下注射以后小鼠的平均体重增加。组群和小鼠数目/组群如下命名：wt媒介物(n = 13)，wt cu(ii)
‑
es (n = 12)，mo
‑
br媒介物(n = 9)，mo
‑
br cu(ii)
‑
es (n = 27)，mo
‑
br cu(ii)
‑
2his (n = 6)，和mo
‑
br es (n = 6)。将生长曲线报告为每周测量的每个组群的平均值
±
sd。属于媒介物或es处理组群的mo
‑
br小鼠没有存活过第2周时间点(未显示)。所有mo
‑
br cu(ii)
‑
2his处理的小鼠在第3周之前死亡。
25.图9说明了在5、10、15和20周评估时在存活小鼠组群中肌肉强度的倒置金属丝网测试。将小鼠放在具有1 mm直径金属丝的12 mm长度正方形的43 cm2网中并180
°
倒置60秒。在中光线（mid
‑
light）周期中每5周记录间隔15分钟休息期的三个试验中的最佳者。具有dunnett氏(双侧)事后检验的anova用于评估显著性。
26.图10说明了在10周龄的存活小鼠组群中通过加速旋转杆评估的运动性能。在测试之前将小鼠在旋转杆(ugo basile 7650型)上以4 rpm的恒定转速训练三期。为了评估运动
性能，将小鼠放在加速旋转杆(4 rpm至40 rpm 300秒，随后恒定转速120秒)上最大420秒。记录跌落或被动旋转的等待时间，并取每只小鼠在三个试验中的平均值。以随机次序在中光线（mid
‑
light）周期中评估所有小鼠。将数据报告为平均组群平均值
±
sem。具有dunnett氏事后检验的anova用于确定显著性。
27.图11a说明了伊来司莫的化学结构。
28.图11b说明了根据本公开内容的方面的伊来司莫的类似物的通用化学结构。
29.图12说明了根据本公开内容的方面的伊来司莫的实例类似物。
30.详细描述应当理解，为了实现各个实施方案的不同特征，下述公开内容提供了许多不同的实施方案或实例。下面描述了组分和安排的具体实例来简化本公开内容。当然，这些仅仅是实例且无意意图进行限制。在本文中使用的段落标题是用于组构目的，并且不应解释为限制描述的主题。
31.铜是细胞色素c氧化酶(cco)的组装和活性所需的基本微量营养物，该酶是线粒体呼吸链的末端酶，其催化分子氧的还原并驱动线粒体能量产生。cco是高度保守的多聚体线粒体内膜蛋白复合物，其具有两个含铜亚基cox1和cox2，它们一起形成其催化核心。铜向线粒体递送并插入到这些含铜亚基中是一个复杂的过程，其需要多种金属伴侣蛋白和辅助蛋白。铜向cox1和cox2的递送失败破坏cco组装并导致呼吸不足。
32.细胞溶质的铜通过最近鉴定的酵母蛋白pic2递送至线粒体基质，其以配体结合形式存储在那里。该线粒体基质铜库是插入到线粒体膜间空间(ims)内的cco亚基中的铜离子的主要来源。为了将铜递送到cco亚基中的铜位点从线粒体基质到ims的铜动员需要许多进化上保守的蛋白。除了金属伴侣蛋白cox17、sco1、sco2和cox11（它们已被显示以连串接力（bucket
‑
brigade）方式将铜转移到cco亚基）外，这些蛋白的精确分子功能尚未得到解决。具体而言，cox17从线粒体基质接收铜并将其转移至cox11和sco1/sco2，它们然后分别对cox1和cox2上的铜位点金属化。最近，还已经显示另外两种蛋白coa6和cox19是ims中该铜递送途径的一部分。
33.在人类中，sco1、sco2和coa6中的遗传性部分功能缺失突变导致cco缺陷，并与受影响患者的肝病、代谢性酸中毒、心肌病和神经学缺陷有关。铜补充从具有sco2中的突变的患者中拯救成肌细胞的cco缺陷，并恢复coa6缺陷型酵母和人类患者细胞系中的cco活性，从而提示，铜向线粒体的有效递送可通过绕过sco2和coa6功能来恢复cco活性。为了在临床场合转化这些观察结果，给具有sco2突变的患者皮下注射铜
‑
组氨酸。尽管铜补充改善患者的肥厚型心肌病，但其没有改善其它临床结果或存活。因此，人类疗法将需要更有效的机制来恢复铜稳态。本公开内容使用酵母coa6δ细胞来鉴定可以在宽浓度范围内有效地跨生物膜转运铜并恢复线粒体呼吸链功能的化合物。该方法鉴定出了伊来司莫(es)，其被显示重建铜缺乏细胞中的亚细胞铜稳态，突出了其对人类铜代谢疾病的治疗潜力。
34.atp7a是在人类健康中起重要作用的atp驱动的铜转运蛋白。atp7a至关重要地参与从肠道的饮食铜摄取。此外，atp7a将铜递送至分泌途径内的许多铜依赖性酶，并促进铜向大脑的转移。atp7a中的失活突变与严重且经常致命的病理(诸如门克斯病、枕骨角综合征和x
‑
连锁的远侧遗传性运动神经病)相关。遗传和生化研究已经证实，致病突变以多种方式破坏atp7a，包括生物合成的破坏、稳定性的损害、铜转运活性的失活以及atp7a转运。伊
来司莫是用于治疗由atp7a中的突变引起的铜代谢病症的可行疗法。
35.工作实施例现在将参考本公开内容的更具体实施方案以及为这样的实施方案提供支持的数据。但是，应当指出，下面的公开内容仅仅用于说明性目的且无意以任何方式限制所要求保护的主题的范围。
36.试剂. 除了购自selleckchem的伊来司莫(es)以外，所有的铜结合化合物均购自sigma
‑
aldrich。将酵母
‑
人杂合(hycoa6)基因构建体针对酵母进行了密码子优化，并使用geneart
®
gene synthesis (life technologies)进行了合成。将杂合基因hycoa6克隆进prs416质粒在酵母coa6天然启动子的控制下。通过使用hycoa6作为模板的定位诱变(agilent technologies quikchange lightning)引入了coa6患者突变。在本公开内容中使用的所有引物列于如下所示的表1中。对所有构建体进行测序验证。
37.酵母菌株和培养条件. 在本公开内容中使用的酿酒酵母菌株列于如下所示的表2中。通过pcr以及通过在脱离（dropout）平板上的影印铺板，证实酵母菌株可靠性。在包括ypd (1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖)、ypgal (2%半乳糖)、ypge (3%甘油+ 1%乙醇)的标准yp生长培养基或合成培养基(sc葡萄糖)中培养酵母细胞。关于定性生长测量，将过夜培养物的10倍系列稀释物印迹在ypd或ypge平板上并在30℃和37℃温育指定的阶段。通过分光光度计法在600 nm测量在液体培养基中的生长。
38.哺乳动物细胞培养. 在补充了10%胎牛血清(sigma)和1 mm丙酮酸钠(life technologies)的高葡萄糖dulbecco氏改良的伊格尔培养基(dmem)中培养人对照mch46和sco2患者成纤维细胞以及大鼠h9c2对照和ctr1
‑
/
‑ꢀ
心肌细胞。在dmem 10%fbs、1 mm丙酮酸钠、1x最低基础培养基非必需氨基酸(mem neaa; life technologies 11140)、50 μg/ml尿苷和1x pen strep谷氨酰胺(life technologies 10378)中培养小鼠胚胎成纤维细胞。将所有细胞系在5%co2下在37℃培养，并用指示浓度的es处理3
‑
6天，然后收获。在补充了蛋白酶抑制剂混合物（roche diagnostics）的裂解缓冲液(bp
‑
115, boston bioproducts)中提取全细胞蛋白，并通过bca测定（thermo scientific）确定蛋白浓度。
39.ctr1敲除的大鼠h9c2细胞系的构建. 通过使用lenticrispr v2质粒(addgene, #52961)产生了crispr/cas9介导的ctr1敲除的大鼠h9c2细胞系。使用在线crispr设计工具
鉴定靶向ctr1基因的外显子1的指导rna (grna)序列。将正向(5’caccgtggtgatgttgtcgtccgtg 3’) (seq id no: 7)和反向(5’aaaccacggacgacaacatcaccac 3’) (seq id no: 8)寡核苷酸插入lenticrispr v2质粒中。使用polyjet (signagen laboratories)进行转染。在转染后2天，将细胞铺板在含有5
ꢁꢀ
μg/ml嘌呤霉素选择培养基的96
‑
孔板上。分离从单个细胞形成的每个集落，并在不含嘌呤霉素的培养基中建立。通过基因组dna测序证实了ctr1基因的破坏。
40.氧耗量测量. 为了测量呼吸率，将细胞在ypgal培养基中生长至对数期后期，且然后洗涤，计数，并以108个细胞/ml重新悬浮在新鲜ypgal培养基中。然后使用oxytherm (hansatech, norfolk, uk)在30℃测量耗氧率。添加1 mm kcn后计算对氰化物敏感的呼吸，并从总呼吸中减去对氰化物不敏感的呼吸。
41.免疫印迹法和凝胶中活性. 分别进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)和blue native page (bn
‑
page)以分离变性的和天然的蛋白复合物。对于sds
‑
page，在nupage 4
‑
12% bis
‑
tris凝胶(life technologies, carlsbad, ca)上分离线粒体裂解物(20 μg)。对于bn
‑
page，通过在4℃温育15分钟，将酵母线粒体溶解在含有1%洋地黄皂苷(life technologies)的缓冲液中。20,000
×
g (30 min, 4℃)旋转后收集透明的上清液，添加50x g
‑
250样品添加剂，并将20 μg蛋白加载至3
‑
12%天然page bis
‑
tris凝胶(life technologies)上。湿转移后，用下述第一抗体探测膜：对于酵母蛋白
‑ꢀ
cox2, 1:50,000 (110 271; abcam)和孔蛋白, 1:50,000 (110 326; abcam)，对于哺乳动物蛋白
‑ꢀ
cox1 (14705; abcam), cox2 (110258; abcam), ctr1, cox4 (a21348; thermo fisher scientific), ccs (fl
‑
274; santa cruz biotechnology), gapdh (g9545, sigma), atp5a (14748; abcam),和β
‑
肌动蛋白(a2228; sigma)。使用western lightning plus
‑
ecl (perkinelmer, waltham, ma)开发了蛋白质印迹。进行了针对线粒体呼吸链复合物iv的凝胶中活性测定。
42.细胞和线粒体铜测量. 使用perkin elmer drc ii电感耦合等离子体
‑
质谱仪(icp
‑
ms)测量细胞和线粒体铜水平。将完整的酵母细胞和分离的线粒体沉淀物用含有100 μm edta的水洗涤，称重，并在90℃用40%硝酸(traceselect, sigma)消化18 h。将样品在超纯无金属水(traceselect, sigma)中稀释，并通过icp
‑
ms分析。通过适当稀释商购可得的混合金属标准品(bdh aristar plus)，制备铜标准溶液。还通过icp
‑
ms测量了哺乳动物细胞中的铜浓度。
43.斑马鱼实验. 斑马鱼研究经海洋生物实验机构动物护理和使用委员会(#16
‑
38)批准。使用标准方法维持并杂交野生型ab品系和ctr1杂合的斑马鱼。在28.5℃在egg water中将胚胎分期和培养。对于药物处理，在受精后3小时（hpf）开始，将来自ctr1杂合杂交的胚胎在以egg water稀释的10 nm es中温育。为了在48 hpf对活胚胎成像，在tricaine中麻醉每个样品的代表性胚胎，并在olympus szx12立体显微镜上进行成像。对于免疫印迹，从受精后10天(dpf)幼虫制备斑马鱼线粒体蛋白。通过在4
‑
15%mini
‑
protean tgx gels (bio
‑
rad)上的sds
‑
page分离线粒体裂解物，然后使用1:5000的抗
‑
cox1 (抗
‑
mtco1; abcam; ab14705)和1:5000的抗
‑
atp5a (abcam; ab110273)进行蛋白质印迹分析。进行了基于吗啉代试剂的实验。
44.铜结合剂的有针对性搜索将伊来司莫鉴定为拯救酵母coa6δ细胞的呼吸缺陷的
最有效的药理剂. 关于铜结合药理剂的拯救coa6δ细胞的呼吸缺陷生长的能力，测试了许多铜结合药理剂。在所有测试的化合物中，es的独特之处在于，它在低纳摩尔浓度拯救呼吸生长，而在宽浓度范围内都没有表现出明显的毒性。es以0.8 nm的ed
50
拯救了coa6δ细胞的呼吸生长(图1)。在含有不可发酵碳的固体生长培养基上也观察到了es介导的coa6δ细胞的生长拯救。与呼吸生长的拯救一致，es补充使coa6δ细胞的耗氧率恢复至野生型细胞的耗氧率（图2a）。为了确定观察到的coa6δ细胞的呼吸拯救的生化基础，分别通过天然
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹法和凝胶中活性测定法测量了含cco的线粒体呼吸链超级复合物的组装和活性。es补充使含有cco的超级复合物的丰度和活性恢复到接近野生型水平(图2b
‑
图2c)。接下来，通过在酵母coa6δ细胞中异源表达具有患者突变(w26c、w33r和e54x)的酵母
‑
人嵌合蛋白，测试了es在拯救人类患者中观察到的coa6突变方面的效力。与coa6δ细胞相似，10 nm es或10μm铜补充拯救了表达患者突变的酵母coa6δ细胞。这些结果显示，在拯救酵母coa6δ细胞的呼吸生长缺陷方面，es的效力至少是铜的1000倍。
45.es从培养基中清除铜，以es
‑
铜络合物的形式进入细胞，并选择性地积累在线粒体中，在那里它从铜解离。与该概念一致，观察到在补充了es的coa6δ细胞中线粒体铜水平的几乎完全拯救（图2d）。es补充还适度增加了总细胞铜水平（图2e）。为了进一步证实es通过将细胞外铜主动转运到细胞中而增加了线粒体铜水平，通过将es与已知的铜螯合剂浴铜灵二磺酸酯(bcs)共同处理降低了细胞外区室中的铜可用性。如预期的，bcs处理导致野生型细胞的呼吸生长降低，其通过与es共同处理得以拯救，从而提示，es还能够通过竞争得过bcs来克服药理学铜缺乏（图3a）。此外，在有bcs存在下，es介导的coa6δ的拯救减少（图3b）。为了确定es是否能够绕过线粒体铜转运蛋白pic2，在pic2δ和coa6δpic2δ细胞中进行了es补充。尽管在测试条件下未观察到pic2δ细胞的呼吸生长缺陷，但es确实拯救了coa6δpic2δ细胞，从而提示，该化合物可以将铜递送到线粒体，而与pic2功能无关。这些结果暗示，es介导的cco功能拯救是由其将细胞外铜转运到coa6δ细胞的线粒体的能力驱动。
46.es拯救许多不同的具有受损铜代谢的酵母突变体. 为了测试es介导的拯救的特异性，入选了维持细胞和线粒体铜稳态所需的基因的许多酵母突变体。基于基因的进化保守性、致病性突变在人类中的存在和/或相关小鼠表型的存在，对基因进行优先排序（表3，如下所示）。这些酵母突变体在生长两天后在37℃在非发酵培养基中显示显著的呼吸缺陷生长表型，其在生长四天后变得不太明显。尽管程度不同，但大多数酵母突变体通过es补充得到拯救，这反映了它们在细胞和线粒体铜稳态中的独特作用。es无法拯救sco1δ细胞，可能是由于sco1作为金属伴侣蛋白在将铜插入到cco的cox2亚基中的特殊作用。注意到需要更高浓度的es以拯救ctr1δ细胞，这与缺乏ctr1的细胞中铜水平的严重降低是一致的。总体而言，这些结果提示es在改善细胞和线粒体铜稳态缺陷中的广泛适用性。
47.es补充拯救具有铜代谢遗传缺陷的哺乳动物细胞系中的cco亚基水平. 为了扩展在酵母中的发现并测试es在铜缺乏的哺乳动物细胞培养模型中的效力，构建了ctr1敲除的大鼠h9c2心肌细胞细胞系。通过证明ctr1蛋白的丢失来验证ctr1
‑
/
‑ꢀ
细胞系。如所预期的，ctr1的损失导致细胞内铜水平的约4倍降低（图4a）以及cco亚基cox1和超氧化物歧化酶sod1的水平的伴随降低（图4b）。该经过验证的ctr1
‑
/
‑ꢀ
细胞系用于测试es在拯救cox1(cco的含铜亚基)和sod1（超氧化物歧化酶，另一种含铜酶sod1）方面的效力。如在图4a中所示，ctr1
‑
/
‑ꢀ
细胞显示出铜水平降低，其通过补充5 nm es得到恢复。图4b显示，ctr1
‑
/
‑ꢀ
细胞的5nm es处理也恢复了cox1和sod1的水平。类似地，在ctr1
‑
/
‑ꢀ
小鼠胚胎成纤维细胞(mef)中观察到了cox1水平的剂量依赖性拯救。但是，在较高剂量时注意到es毒性，这反映为在对照mef中降低的cox1水平。最后，测试了es在拯救先前被显示具有cox2缺陷的sco2患者成纤维细胞中拯救cco缺陷方面的效力。与铜补充不同，es处理能够以剂量和时间依赖性方式部分地拯救cox2的稳态水平。值得注意的是，es毒性发生在比拯救cox2水平的剂量高20倍的浓度（图5a）。与es的已知抗癌活性一致，当与相同细胞类型的原代培养物（图5b）对比时，在永生化细胞系（图5a）中观察到更显著得多的毒性。总之，这些结果提示，低纳摩尔浓度的es在
具有铜稳态遗传缺陷的哺乳动物细胞系中可有效拯救线粒体铜缺乏和恢复cco水平。
48.es补充拯救斑马鱼模型中的铜缺乏表型. 为了确定es是否可以拯救在完整的发育中的脊椎动物模型中与铜缺乏相关的表型，使用了在编码质膜铜输入蛋白ctr1的基因中具有无效突变的斑马鱼胚胎。选择斑马鱼的原因是，能够快速监测由于酪氨酸酶对铜的需求而产生的色素沉着缺陷，所述酪氨酸酶是一种催化黑色素生物合成中的关键步骤的酶。野生型斑马鱼胚胎具有特征性的黑色素色素沉着模式，在48 hpf时可见。为了确定es是否可以拯救斑马鱼中的铜缺乏表型，将在10 nm es中来自杂合ctr1杂交的斑马鱼胚胎进行温育，并与未处理的胚胎对比。发现预期的约25%的来自ctr1杂合杂交的未处理胚胎缺乏黑色素沉积，而来自相同杂交的所有es处理的胚胎均被着色。类似地，观察到在100 nm es的色素沉着缺陷的拯救，但是等剂量的铜未能拯救该缺陷。ctr1
‑
/
‑ꢀ
突变体也可能由于线粒体铜缺乏而表现出cco组装缺陷。为了确定es是否可以拯救观察到的cco组装缺陷，在有es存在下从杂合ctr1杂交生长出了胚胎批（clutch）直到10 dpf，并测量了它们的线粒体提取物中的cox1水平。与野生型胚胎相比，ctr1
‑
/
‑ꢀ
突变体表现出coxl水平的严重降低，其通过用es处理几乎完全拯救。
49.为了进一步建立es用于治疗涉及铜向线粒体的缺陷递送的代谢疾病的潜力，测试了es在拯救与斑马鱼胚胎中的coa6敲低相关的表型方面的效力。首先，确定对于斑马鱼胚胎的es的最大耐受剂量为100 nm (图6a)。与es的作用机理一致，观察到100 nm es与100 nm铜的共同补充导致100%致死率(图6b)。注射了zfcoa6翻译阻断吗啉代试剂的斑马鱼胚胎表现出显著的形态学缺陷，其特征在于心包水肿、较小的头和眼以及弯曲的尾巴。在四个不同的时间点24、48、72和96 hpf对这些表型的严重程度进行了评分（在下表4中所示），并且在早至48 hpf观察到用100 nm es处理的拯救（图6c）。鉴于在该模型中coa6缺陷的最显著特征之一是显著的心脏水肿和降低的心律，接下来确定了es处理是否能够拯救这些表型。实际上，100 nm es处理预防了心包水肿，并在72和96 hpf显著提高了coa6敲低斑马鱼胚胎的心率，而没有改变对照胚胎的心率（图6d）。这些结果证明了es在拯救完整的活脊椎动物中与铜缺乏相关的表型方面的效力。
50.铜代谢的线粒体病症代表目前尚无疗法的线粒体能量代谢的先天性缺陷的子集。先前使用直接铜补充作为治疗方案的尝试未成功，可能是由于全身性铜水平的严格调节。因此，存在未得到满足的开发更好铜递送剂的需求。考虑到这一目标，在coa6缺陷的酵母线粒体疾病模型上测试了许多临床上使用的药理剂，并将es鉴定为能够恢复线粒体功能的最有效的且最好耐受的化合物。随后在其它酵母、鼠、人和斑马鱼模型上的实验建立了es在治疗线粒体、细胞和生物体铜缺乏中的广泛适用性。es已经经历了多个人类临床试验，其中它已经表现出有利的毒性概况。因此，本文提出的发现提供了重新使用该抗癌药物治疗铜代谢病症的可能性。
51.以靶向方式改变金属的亚细胞浓度和分布的药理干预可能具有治疗益处。例如，铜与双硫仑（食品和药品管理局批准的一种药物）的共同施用增加门克斯病（一种以全身性铜缺乏为特征的遗传性病症）的小鼠模型的脑中的cco活性。类似地，已经显示cu
ii
‑
atsm在肌萎缩性侧索硬化的转基因小鼠模型中是有效的。但是，缺少在铜缺乏模型中对这些临床上使用的铜复合物的效力的比较研究。因此，在许多临床上使用的铜螯合剂和离子载体中将es鉴定为最有效的药理剂的本公开内容代表了一个重要进步。es的物理化学性质，包括其结合亲和力、其对铜的特异性以及es
‑
铜复合物的氧化还原电位，允许它模仿铜金属伴侣蛋白。与铜(i)相比，es对铜(ii)的亲和力更高，这允许它从铜更可能以氧化状态存在的细胞外环境中清除铜。es不太可能从细胞内蛋白剥夺铜，因为在细胞内环境中处于还原状态的铜的普遍性较高。
52.虽然在线粒体中有es
‑
铜复合物的选择性富集，但酵母atx1δ和ccc2δ（其在高尔基隔室中具有受损的铜稳态）的拯救提示，es也能够将铜递送至其它亚细胞隔室。实际上，在ctr1
‑
/
‑ꢀ
斑马鱼中观察到的由分泌途径酶缺陷引起的色素沉着缺陷的拯救也指示，es可以增加其它细胞器中的铜水平。最后，ccs1δ细胞（其缺少细胞溶质蛋白sod1的金属伴侣蛋白）的呼吸生长缺陷的拯救提示，es还能够提高细胞溶质铜水平。虽然es能够将铜递送到不
同的亚细胞隔室的机制尚不完全清楚，但一些es
‑
铜复合物可能在到达线粒体之前解离，从而在细胞质中释放游离铜。可替换地，过量的线粒体铜可能从线粒体“漏”出并且使得其它细胞器可获得。尽管有该机制，但这种有趣的观察结果提示，es可以有效治疗更常见的铜缺乏病症，包括门克斯病，如下面进一步讨论的。
53.人铜缺乏的小鼠模型证实cu
‑
伊来司莫复合物[cu(ii)
‑
es]的效力的体内小鼠模型数据. 为了评价cu(ii)
‑
es在人铜缺乏病症的小鼠模型中的潜力，选择了紧密模仿门克斯病的临床和生化表型的充分表征的有花斑斑纹的(mo
‑
br)小鼠模型(c57bl/6
‑
atp7a
mo
‑
br
/j, jackson laboratory stock # 002566)。像在人类中一样，这些小鼠的特征是atp7a中的突变，atp7a是一个x连锁基因且因此其突变仅影响雄性。重要的是，与人类门克斯病患者一样，不能通过注射cu盐来拯救mo
‑
br小鼠。受门克斯病影响的小鼠通常到近似第14天死亡，且在出生后第10天，它们开始显示神经学缺陷，例如，癫痫发作、正向反射丧失等。在出生后第7天和第10天施用3.625 mg/kg/剂的cu(ii)
‑
es的两个皮下剂量足以拯救mo
‑
br小鼠免于死亡（图7）。值得注意的是，媒介物、组氨酸
‑
铜或单独的伊来司莫处理的mo
‑
br小鼠在出生的20天内死亡，而81.5%的cu(ii)
‑
es处理的mo
‑
br小鼠存活直到第70天(图7)。用媒介物或cu(ii)
‑
es处理的所有野生型都存活至第70天，而无不良影响，提示当前给药和处理方案对小鼠无毒。
[0054]
为了测试mo
‑
br小鼠的cu(ii)
‑
es处理是否仅改善存活或还促进生长，监测了cu(ii)
‑
es的两次注射后的体重增加。用cu(ii)
‑
es处理的mo
‑
br小鼠表现出与野生型小鼠相似的体重增加模式，但是，在所有评估的时间点，体重增加略低(p < 0.001), 如在图8中所示。在评估的第2、3和4周，与媒介物处理的野生型小鼠相比，在用cu(ii)
‑
es处理的野生型小鼠中注意到轻度的生长缺陷(p = 0.0004、0.0003和0.026)，但是这些小鼠到第5周恢复(p > 0.05，第5
‑
10周)，如在图8中所示。这些数据显示，cu(ii)
‑
es处理的mo
‑
br小鼠不仅存活，而且茁壮成长，并且cu(ii)
‑
es处理对野生型小鼠没有任何长期的生长迟缓作用。
[0055]
除了存活和生长测量以外，还进行了许多神经学试验以评价es介导的铜向大脑的递送的效力以及动物的整体健康。如前所述，在仅处理两次（第7天和第10天）的小鼠上进行这些测试，下面进行更详细的描述。
[0056]
金属丝悬挂测试. 该测试评价动物的运动功能和肌肉强度。用媒介物或cu(ii)
‑
es处理的野生型小鼠在它们的悬挂时间方面没有区别，从而暗示cu(ii)
‑
es的施用不会引起任何肌肉或运动功能毒性(图9)。就药物效力而言，cu(ii)
‑
es处理的mo
‑
br小鼠表现出的悬挂时间与用媒介物处理的野生型小鼠的悬挂时间在统计学上相似，直到第15周，但在第20周时肌肉强度明显下降(*p = 0.01)（图9）。mo
‑
br小鼠在第15周后肌肉功能的这种下降提示，在生命的15周以后铜水平可能正在下降。
[0057]
转杆测试. 该测试评价神经运动功能，包括平衡、耐力、抓力和运动协调。它涉及将成年小鼠放在悬挂于笼子地板上方的水平定向旋转杆上，并监测直到它们跌落的时间。如在图10中所示，与用媒介物处理的野生型小鼠相比，用cu(ii)
‑
es处理拯救的mo
‑
br小鼠表现出显著降低的跌落等待时间，平均跌落时间为222.0
±
34.5秒，与此相比，前者为379.0
±
51.5秒(***p < 0.0001)。与媒介物处理的野生型小鼠相比，用cu(ii)
‑
es处理的野生型小鼠没有显示显著差异，平均跌落时间为326.3
±
37.8秒(p = 0.182)。该数据提示，es
‑
cu的当前剂量和治疗方案(在出生后第7天和第10天的2次注射各14.5 μg es
‑
cu)对神经运动
功能的部分拯救。
[0058]
人铜缺乏小鼠模型结果和讨论体内小鼠模型数据提示，cu(ii)
‑
es制剂在以铜代谢的调节异常为特征的许多人病症中是有效的。例如，cu(ii)
‑
es制剂对枕骨角综合征和x
‑
连锁的远侧遗传性运动神经病(它们两者均由atpa7a基因中的突变引起，并且是门克斯病的“较轻”版本)是有效的。另外，cu(ii)
‑
es制剂可能对肌萎缩性侧索硬化或lou gehrig病是有效的。肌萎缩性侧索硬化是由cu/zn
‑
超氧化物歧化酶(sod1)中的突变引起，且增加铜向sod1的递送是治疗有益的。
[0059]
此外，cu(ii)
‑
es制剂可能对阿尔茨海默氏病是有效的。阿尔茨海默氏病的显著特征是细胞外β
‑
淀粉样蛋白(aβ)斑块在大脑中的积聚。已经显示，通过饮食或药理学方式的铜递送可以减少间质性αβ并改善阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型中的认知功能。并且，cu(ii)
‑
es制剂可能对huppke
‑
brendel综合征是有效的。该综合征是由编码内质网膜乙酰辅酶a转运蛋白的at
‑
1基因中的突变引起，该转运蛋白是一种或多种铜蛋白的乙酰化所需的。at
‑
1中的突变导致较低的血清铜水平和严重的神经学缺陷，因此cu(ii)
‑
es在这种情况下可能是治疗有益的。此外，cu(ii)
‑
es制剂可能对mednik综合征是有效的。该综合征是由ap1s1基因中的突变引起，且其特征是铜代谢紊乱，其中细胞色素c氧化酶和铜依赖性酶sod1的表达降低。
[0060]
因此，可以预见，cu(ii)
‑
es制剂在以铜代谢的调节异常为特征的许多人病症中可以是有效的，所述人病症包括、但不限于枕骨角综合征、x
‑
连锁的远侧遗传性运动神经病、肌萎缩性侧索硬化、lou gehrig病、阿尔茨海默氏病、huppke
‑
brendel综合征、mednik综合征或它们和相似病症的组合。
[0061]
上面已经证明，在出生后第7天和第10天通过皮下途径施用的cu(ii)
‑
伊来司莫的共两次注射各3.635 mg/kg是有效的。基于小鼠的预期全身铜含量选择该剂量。预期7日龄的4克幼崽具有约4 μg的全身铜。因此，选择两剂3.635 mg/kg cu(ii)
‑
伊来司莫，其中每剂含2 μg当量的铜，总剂量为4 μg。基于这些实验，在出生的前10天内施用的3
‑
14.5 mg/kg总cu(ii)
‑
伊来司莫的剂量范围可能有效改善mo
‑
br小鼠中的门克斯病相关表型。
[0062]
鉴于前述内容，在一些实施方案中，本公开内容进一步涉及在具有以铜代谢的调节异常为特征的病症的人类受试者中的治疗有效剂量。这样，可以基于上述数据外推人剂量，并且本领域技术人员容易想到。
[0063]
例如，在一些实施方案中，伊来司莫
‑
cu(ii)在人类中的治疗剂量为近似约0.589 mg/kg体重。因此，对于重达4 kg的人类儿童，剂量为近似2.36 mg。在一些实施方案中，伊来司莫在人类中的治疗剂量范围是0.243
ꢀ‑ꢀ
1.17 mg/kg。按照nair和jacob (2016) journal of basic and clinical chemistry, 第7卷(2): 27
‑
31计算人剂量。
[0064]
尽管已经显示最有效的伊来司莫制剂是溶解于20%captisol
®
溶液中的cu(ii)
‑
伊来司莫，但容易设想其它实施方案。例如，在一些实施方案中，可以将伊来司莫类似物、模拟物、及其衍生物用作伊来司莫的替代物。图11a说明了伊来司莫的化学结构。
[0065]
在一些实施方案中，伊来司莫类似物、模拟物或衍生物可以具有在图11b中描绘的化学结构。参考图11b，在一些实施方案中，x1、x2、x3和x4可以各自独立地包括o、s、se、te、po、n(r7)
m
、p(r7)
m
、as(r7)
m
、sb(r7)
m
或bi(r7)
m
或它们的组合。在一些实施方案中，m可以包括、但不限于0或1。
[0066]
仍然参考图11b，在一些实施方案中，r1、r2、r3、r4、r5和r6可以各自独立地包括
−
h、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、
−
or8、
−
nr
10
r
11
、
−
c(o)r8、
−
c(o)or8、
−
oc(o)r8、
−
c(o)nr
10
r
11
、
−
nr9c(o)r8、
−
op(o)(or8)2、
−
sp(o)(or8)2、
−
sr8、
−
s(o)
p
r8、
−
os(o)
p
r8、
−
s(o)
p
or8、
−
nr9s(o)
p
r8、
−
s(o)
p
nr
10
r
11
、芳族基团或它们的组合。
[0067]
仍然参考图11b，在一些实施方案中，r7可以各自独立地包括
−
h、
−
or8、
−
nr
10
r
11
、
−
c(o)r8、
−
c(o)or8、
−
oc(o)r8、
−
c(o)nr
10
r
11
、
−
nr9c(o)r8、
−
op(o)(or8)2、
−
sp(o)(or8)2、
−
sr8、
−
s(o)
p
r8、
−
os(o)
p
r8、
−
s(o)
p
or8、
−
nr9s(o)
p
r8、
−
s(o)
p
nr
10
r
11
、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，p可以包括、但不限于1或2。
[0068]
仍然参考图11b，在一些实施方案中，r8、r9、r
10
和r
11
可以各自独立地包括
−
h、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、卤素、硝基、氰基、胍基(guanadino)、芳族基团或它们的组合。在一些实施方案中，r
10
和r
11
可以各自独立地与它们所连接的氮一起形成杂环基或杂芳基。
[0069]
在一些实施方案中，上面描述的化合物可以是具有图11b中所描绘的化学结构的药物组合物、或其互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物、笼形化合物或前药。在一些实施方案中，所述化合物还可以包括盐、溶剂、缓冲剂、稀释剂、粘合剂、压缩助剂、造粒剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、片剂包衣或薄膜、着色剂或它们的组合。
[0070]
在本公开内容中预想的伊来司莫类似物、模拟物和衍生物的化学结构的其它例子在图12中描绘。
[0071]
鉴于前述内容，在一些实施方案中，本公开内容涉及一种恢复细胞中的细胞色素c氧化酶(cco)活性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的伊来司莫接触。在一些实施方案中，所述接触增加细胞和线粒体铜含量。在一些实施方案中，所述接触重建铜缺乏细胞中的亚细胞铜稳态。在一些实施方案中，所述接触拯救coa6、sco2、cox6b1、ctr1、atox1、ccs、gsx1、atp7a、atp7b、clcn5和clcn7缺陷的细胞的呼吸缺陷。在一些实施方案中，所述接触改善细胞和线粒体铜稳态的缺陷。在一些实施方案中，所述治疗有效量的伊来司莫可以通过模仿缺失的铜转运蛋白或伴侣蛋白的功能来恢复细胞内铜稳态。在一些实施方案中，所述治疗有效量的伊来司莫跨生物膜有效地转运铜和恢复线粒体呼吸链功能。
[0072]
在另外的实施方案中，本公开内容涉及治疗有此需要的受试者中的细胞或线粒体铜缺乏的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的伊来司莫。在其它实施方案中，本公开内容涉及一种拯救来自具有sco2突变的受试者的成纤维细胞中的cco缺陷和恢复coa6缺陷型酵母中的cco活性的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的伊来司莫，其中所述伊来司莫允许铜向线粒体的有效递送以通过绕过sco2和coa6功能而恢复cco活性。
[0073]
在其它实施方案中，本公开内容涉及一种治疗铜代谢的人病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括单独地或在有铜存在下施用治疗有效量的伊来司莫。在一些实施方案中，所述病症由atp7a基因的突变造成。在一些实施方案中，所述病症是门克斯病、枕骨角综合征或x
‑
连锁的远侧遗传性运动神经病。
[0074]
尽管已经在附图中说明了本公开内容的各个实施方案并且在前面的详细描述中进行了描述，但是应该理解，本公开内容不限于本文公开的实施方案，而是能够在不脱离本文阐述的本公开内容的精神的前提下进行许多重排、修改和替换。
[0075]
如本领域普通技术人员所理解的，术语“基本上”被定义为在很大程度上但不一定完全是所指定的。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”、“近似”、“通常”和“约”可以被指定的“在
…
的[百分比]内”置换，其中百分比包括0.1％、1％、5％和10％。
[0076]
前述内容概述了几个实施方案的特征，使得本领域技术人员可以更好地理解本公开内容的方面。本领域技术人员应当理解，他们可以容易地将本公开内容用作设计或修改其它方法和组合物的基础，所述其它方法和组合物用于实现本文所介绍的实施方案的相同目的和/或达到相同优点。本领域技术人员还应该认识到，这样的等效构造不脱离本公开内容的精神和范围，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的前提下，它们可以在本文中做出不同的变化、置换和改变。本发明的范围应当仅由所附权利要求的措辞确定。在权利要求中的术语“包含”意指“至少包括”，使得在权利要求中所列举的要素列表是一个开放的组。除非明确地排除，否则术语“一个/种(a)”、“一个/种(a)”和其它单数术语意图包括其复数形式。