修饰的溶瘤病毒、其组合物和用途的制作方法

本公开大体上涉及修饰的溶瘤病毒、包含修饰的溶瘤病毒的组合物和其在肿瘤治疗中的用途。
背景技术：
：全世界每年在超过1400万人中诊断出肿瘤。尽管医疗研究中取得众多进展，但肿瘤占所有死亡的大致16％。恶性肿瘤通常对常规疗法具有抗性并且代表重大治疗挑战。举例来说，微转移可在原发性肿瘤发展中的极早期产生。因此，在诊断时，许多肿瘤患者已具有显微转移。肿瘤反应性t细胞可寻找并破坏这些微转移，并且不伤害周围健康组织。然而，针对恶性肿瘤的天然存在t细胞应答通常不足以引起原发性或转移性肿瘤消退。溶瘤病毒已显示作为抗肿瘤剂的潜力。不同于常规基因疗法，溶瘤病毒能够借助于病毒复制和伴随的细胞溶解而在肿瘤组织中传播。然而，溶瘤病毒自身也不足以治疗原发性或转移性肿瘤。因此，尤其迫切需要增强溶瘤病毒的效力和清除转移性肿瘤细胞。技术实现要素：在一个方面，本公开涉及一种修饰的溶瘤病毒，其包含病毒基因组，所述病毒基因组具有编码免疫检查点抑制剂的第一异源多核苷酸和编码免疫激活剂的第二异源多核苷酸。在某些实施例中，溶瘤病毒选自下组：牛痘病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)、委内瑞拉马脑炎(venezuelanequineencephalitis)、细小病毒、鸡贫血病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、水泡性口炎病毒、塞内加谷病毒(senecavalleyvirus)、马拉巴病毒(marabavirus)和新城疫病毒(newcastlediseasevirus)。在某些实施例中，溶瘤病毒衍生自西储病毒株(westernreservestrain)。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒是减毒的并且能在肿瘤细胞中复制。在某些实施例中，病毒基因组包含至少一种使所述病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制的缺失或破坏。在某些实施例中，缺失或破坏处于编码酶的至少一部分的开放阅读框(orf)中，所述酶既是所述病毒的复制所必需的，又与非肿瘤细胞相比优先在肿瘤细胞中表达。在某些实施例中，酶是激酶。在某些实施例中，酶是胸苷激酶。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是能够特异性结合免疫检查点蛋白的第一抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，免疫检查点蛋白选自下组：pd-1、pd-l1/2、ctla-4、b7-h3/4、lag3、tim-3、vista和cd160。在某些实施例中，第一抗体或其抗原结合片段特异性结合seqidno:1。在某些实施例中，第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链，所述第一重链包含seqidno:2、3和4。在某些实施例中，第一重链包含具有seqidno:5或与其具有至少80％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，第一重链包含seqidno:6的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第一异源多核苷酸包含seqidno:7的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第一异源多核苷酸包含seqidno:8的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第一抗体或其抗原结合片段进一步包含第一轻链，所述第一轻链包含seqidno:9、10和11。在某些实施例中，第一轻链包含具有seqidno:12的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，第一轻链包含seqidno:13的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第一异源多核苷酸进一步包含seqidno:14的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第一异源多核苷酸进一步包含seqidno:15的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，免疫激活剂是共刺激激活剂。在某些实施例中，免疫激活剂是结合共刺激分子的第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，共刺激分子选自下组：cd137(4-1bb)、cd27、cd70、cd86、cd80、cd28、cd40、cd122、tnfrs25、ox40、gitr、神经纤毛蛋白(neutrophilin)和icos。在某些实施例中，其中第二抗体或其抗原结合片段特异性结合seqidno:16。在某些实施例中，第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链，所述第二重链包含seqidno:17、18和19。在某些实施例中，第二重链包含具有seqidno:20的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，第二重链包含seqidno:21的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第二异源多核苷酸包含seqidno:22的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第二异源多核苷酸包含seqidno:23的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第二抗体或其抗原结合片段进一步包含第二轻链，所述第二轻链包含seqidno:24、25和26。在某些实施例中，第二轻链包含具有seqidno:27的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，第二异源多核苷酸进一步包含seqidno:28的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第二轻链包含seqidno:29的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，第二异源多核苷酸进一步包含seqidno:30的核酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，免疫激活剂是刺激nk细胞活性的nk激活剂。在某些实施例中，nk激活剂是结合nk分子的第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，nk分子选自下组：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglec)、tigit、kir和nkg2a/d。在某些实施例中，免疫激活剂是刺激巨噬细胞活性的巨噬细胞激活剂。在某些实施例中，巨噬细胞激活剂是结合巨噬细胞分子的第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，巨噬细胞分子选自下组：csf1r、csf1激酶、ps和cd47。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段，并且免疫激活剂是特异性结合cd137的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸在缺失的位置插入。在某些实施例中，第一异源多核苷酸紧接在第二异源多核苷酸的上游或紧接在第二异源多核苷酸的下游。在某些实施例中，第一异源多核苷酸编码第一抗体的第一重链和第一轻链。在某些实施例中，第一异源多核苷酸进一步包含能够驱动第一重链表达的第一启动子和能够驱动第一轻链表达的第二启动子，其中第一启动子和第二启动子呈头对头方向。在某些实施例中，第二异源多核苷酸编码第二抗体的第二重链和第二轻链。在某些实施例中，第二异源多核苷酸进一步包含能够驱动第二重链表达的第三启动子和能够驱动第二轻链表达的第四启动子，其中第三启动子和第四启动子呈头对头方向。在某些实施例中，第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸被配置成使得其在修饰的溶瘤病毒的复制周期的相同或不同阶段中表达。在某些实施例中，第一启动子和第二启动子相同或不同。在某些实施例中，第一启动子和第二启动子都是晚期启动子。在某些实施例中，晚期启动子是psl。在某些实施例中，第三启动子和第四启动子相同或不同。在某些实施例中，第三启动子和第四启动子都是早期和晚期启动子。在某些实施例中，早期和晚期启动子是pse/l。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒在有义链的5′到3′方向上在框中包含以下元件：编码结合cd137的抗体的轻链的多核苷酸-第一早期和晚期启动子-第二早期和晚期启动子-编码结合cd137的抗体的重链的多核苷酸-编码结合pd-1的抗体的重链的多核苷酸-第一晚期启动子-第二晚期启动子-编码结合pd-1的抗体的轻链的多核苷酸。在某些实施例中，由第一异源多核苷酸表达的免疫检查点抑制剂和由第二异源多核苷酸表达的免疫激活剂表达为单独的蛋白质。在另一方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含本公开的修饰的溶瘤病毒和药学上可接受的载剂。在另一方面，本公开涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的修饰的溶瘤病毒或本公开的药物组合物。在某些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，肿瘤是实体肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌或肝细胞癌。在某些实施例中，施用途径是局部施用。在某些实施例中，施用途径是瘤内注射。附图说明图1显示wr-gs-600中胸苷激酶(tk)缺失、抗pd-1和抗4-1bb抗体插入的结构。图2显示wr-gs-620中tk缺失和抗pd-1抗体插入的结构。图3是wr-gs-600的重组步骤的示意图。图4是wr-gs-620的重组步骤的示意图。图5显示相对于gs-600病毒基因组的引物位置。图6显示相对于gs-610病毒基因组的引物位置。图7显示相对于gs-620病毒基因组的引物位置。图8显示wr-gs-600与wr野生型病毒株的比对。图9显示wr-gs-610与wr野生型病毒株的比对。图10显示wr-gs-620与wr野生型病毒株的比对。图11显示人igg表达的免疫荧光检测的结果。图11a显示u2os细胞的相衬图像。图11b显示背景染色。图11c显示经wr-gs-600感染的u2os细胞的图像。图11d显示经wr-gs-620感染的u2os细胞的图像。图12显示使用细胞溶解产物，由重组病毒(wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620)表达的人抗体的蛋白质印迹结果，其中p600、p610和p620分别是指wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620。这一蛋白质印迹实验检测到分子量为约50kda和25kda的两个条带，其分别与人抗体重链和轻链对应。图13显示使用上清液，由重组病毒(wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620)表达的人抗体的蛋白质印迹结果，其中p600、p610和p620分别是指wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620。这一蛋白质印迹实验检测到分子量为约50kda和25kda的两个条带，其分别与人抗体重链和轻链对应。图14显示使用wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620病毒dna由pcr扩增产生的条带。图15显示抗hupd-1的重链的氨基酸序列和其编码序列。图16显示抗hupd-1的轻链的氨基酸序列和其编码序列。图17显示抗hu4-1bb的重链的氨基酸序列和其编码序列。图18显示抗hu4-1bb的轻链的氨基酸序列和其编码序列。图19显示经wr-gs-620感染的上清液的pd-1结合分析的elisa结果。图20显示经wr-gs-600感染的上清液和经wr-gs-610感染的上清液的4-1bb结合分析的elisa结果。图21-23显示经wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620感染的hct-116、ht-29、mc-38和ct-26细胞的活力。图24显示用于病毒滴度测定的培养板设置。图25显示wr-gs-610病毒滴度测定的代表性培养板扫描结果。图26显示wr病毒滴度测定的代表性培养板扫描结果。图27显示wr-gs-620病毒滴度测定的代表性培养板扫描结果。图28显示wr-gs-600病毒滴度测定的代表性培养板扫描结果。图29显示经配制缓冲液(fb)处理的对照组的代表性培养板扫描结果。图30显示瘤内注射后肿瘤中的体内病毒分布。图31显示瘤内注射后卵巢中的体内病毒分布。图32显示瘤内注射后脑、脾、肝和肺中的体内病毒分布。整合光子发射(1.928e10对1.554e10)视为与肿瘤细胞的数目成比例。基于数据，gs-600控制肿瘤生长。图33显示瘤内注射(it)fb、wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620后同基因型ct-26鼠类肿瘤模型的肿瘤体积变化。图34显示经不同病毒处理的同基因型小鼠模型中的功效模型。图35和36显示经人pbmc静脉内注射的人源化ht-29-luc皮下肿瘤模型的流式细胞术结果。图37和38显示瘤内注射(it)fb、wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620后人源化ht-29皮下肿瘤模型的肿瘤体积变化。图39显示肿瘤经染色的人源化ht-29-luc皮下肿瘤模型，其中小鼠未经hpbmc注射。图40显示肿瘤经染色的人源化ht-29-luc皮下肿瘤模型，其中小鼠经hpbmc注射。2笼中的小鼠经wr-gs-600感染。3笼中的小鼠经wr感染。4笼中的小鼠经fb感染。5笼中的小鼠经wr-gs-610感染。在6笼中，第一小鼠经wr-gs-600感染，第二小鼠经wr-gs-620感染，第三小鼠经wr-gs-610感染，第四小鼠经wr感染，并且第五小鼠经fb感染。7笼中的小鼠经wr-gs-620感染。图41显示肿瘤经染色的人源化ht-29-luc腹膜内肿瘤模型。图42显示一周内用不同病毒处理后的化学发光强度变化百分比。具体实施方式在一个方面，本公开涉及一种修饰的溶瘤病毒，其包含病毒基因组，所述病毒基因组插入有编码免疫检查点抑制剂的第一异源多核苷酸和编码免疫激活剂的第二异源多核苷酸。溶瘤病毒如本文所用，术语“溶瘤病毒”是指能够在体外或体内在肿瘤细胞中选择性复制并且减缓肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞死亡，同时对正常细胞无影响或影响极小的病毒。在某些实施例中，溶瘤病毒含有包装到病毒粒子(或病毒颗粒)中的病毒基因组，并且具有感染性(即，能够感染并且进入宿主细胞或受试者)。在某些实施例中，溶瘤病毒可以是dna病毒或rna病毒，并且可呈任何合适形式，如dna病毒载体、rna病毒载体或病毒粒子。如本文所用，术语“选择性复制”是指与非肿瘤细胞(例如健康细胞)相比，溶瘤病毒在肿瘤细胞中的复制速率显著更高。在某些实施例中，与非肿瘤细胞(例如健康细胞)相比，溶瘤病毒在肿瘤细胞中显示高至少50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或1000倍的溶解速率。在某些实施例中，本公开的溶瘤病毒可在以下中选择性复制：肝肿瘤细胞(例如hepal-6细胞、hep3b细胞、7402细胞和7721细胞)、乳腺肿瘤细胞(例如mcf-7细胞)、舌肿瘤细胞(例如tca8113细胞)、腺样囊性肿瘤细胞(例如acc-m细胞)、前列腺肿瘤细胞(例如lncap细胞)、人胚肾细胞(例如hek293细胞)、肺肿瘤细胞(例如a549细胞)或宫颈肿瘤细胞(例如海拉细胞(helacell))。本公开的溶瘤病毒可衍生自痘病毒(例如牛痘病毒)、腺病毒(例如delta-24、delta-24-rgd、icovir-5、icovir-7、onyx-015、coloadl、h101和ad5/3-d24-gmcsf)、呼肠孤病毒(例如瑞奥素(reolysin))、麻疹病毒、单纯疱疹病毒(例如hsv、oncovexgmcsf)、新城疫病毒(例如73-tpv701和hdv-huj病毒株以及以下文献中所描述的那些：phuangsab等人,2001,《癌症快报(cancerlett.)》172(1):27-36；lorence等人,2007,《癌症药靶研究最新进展(curr.cancerdrugtargets)》7(2):157-67；和freeman等人,2006,《分子治疗(mol.ther.)》13(1):221-8)、逆转录病毒(例如流感病毒)、粘液瘤病毒、弹状病毒(例如水泡性口炎病毒；以下文献中所描述的那些：stojdl等人,2000,《自然·医学(nat.med.)》6(7):821-5和stojdl等人,2003,《癌细胞(cancercell)》4(4):263-75)、小核糖核酸病毒(例如塞内加谷病毒；sw-001和ntx-010)、柯萨奇病毒或细小病毒。在某些实施例中，本公开的溶瘤病毒衍生自痘病毒。如本文所用，术语“痘病毒”是指属于痘病毒科(poxviridae)亚科的病毒。在某些实施例中，痘病毒是属于脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxviridae)的病毒。在某些实施例中，痘病毒是属于正痘病毒亚科(orthopoxvirus)的病毒。各种痘病毒的基因组，例如痘苗病毒(vacciniavirus)、牛痘病毒(cowpoxvirus)、金丝雀痘(canarypox)病毒、鼠痘(ectromelia)病毒、粘液瘤病毒基因组的序列可在本领域和专用数据库，如基因库(genbank)(登录号分别为nc_006998、nc_003663、nc_005309、nc_004105、nc_001132)中获得。在某些实施例中，本公开的溶瘤病毒衍生自牛痘病毒。牛痘病毒是痘病毒家族成员，其特征为编码使得病毒能够独立于宿主细胞机构复制的大量病毒酶和因子的大致190kb双链dna基因组。在某些实施例中，本公开的牛痘病毒衍生自埃尔斯特里(elstree)、哥本哈根(copenhagen)、西储或惠氏(wyeth)病毒株。在某些实施例中，本公开的牛痘病毒是西储病毒株。西储病毒株已得到很好表征，并且其完整序列可在ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上获得，登录号为ay243312。如本文所用，术语“修饰的溶瘤病毒”是指已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质修饰的溶瘤病毒。在某些实施例中，本文所提供的修饰的溶瘤病毒通过核酸序列的缺失和/或添加而遗传改变。在某些实施例中，本文所提供的修饰的溶瘤病毒包含胸苷激酶(tk)基因的缺失。在某些实施例中，本文所提供的修饰的溶瘤病毒包含编码抗人pd-1和/或抗人4-1bb抗体的核酸序列的添加。在某些实施例中，本公开的修饰的溶瘤病毒是减毒的。在某些实施例中，在正常细胞(例如健康细胞)中，修饰的溶瘤病毒与其野生型对应物相比，具有降低(例如低至少90％、80％、70％、60％、50％)或不可检测的毒力。本公开的修饰的溶瘤病毒可衍生自本领域中已知溶瘤的任何溶瘤病毒，所述病毒因其选择性复制和与非肿瘤细胞相比杀死肿瘤细胞的倾向而被已知为溶瘤。溶瘤病毒可以天然溶瘤，或可通过基因工程，如通过修饰一种或多种基因以便提高肿瘤选择性和/或优先在肿瘤细胞中复制而使得其溶瘤。供修饰的这类基因的实例包含dna复制、核酸代谢、宿主嗜性、表面连接、毒力、宿主细胞溶解和病毒传播中涉及的那些基因(参见例如kirn等人,2001,《自然·医学》7:781；wong等人,2010,《病毒(viruses)》2:78-106)。在某些实施例中，本公开的修饰的溶瘤病毒的病毒基因组包含至少一种使所述病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制的缺失或破坏。举例来说，缺失或破坏可降低病毒复制所必需的酶的表达或功能，使得在不存在这种酶情况下病毒的复制能力变得较弱。在一些实施例中，病毒复制取决于细胞中这种酶的存在和/或水平，所述酶的水平越高，病毒的复制能力或速率越高。在某些实施例中，缺失或破坏处于开放阅读框(orf)中。如本文所用，术语“开放阅读框”或“orf”或“编码序列”是指能够被翻译成氨基酸序列的dna序列。orf通常以起始密码子(例如atg)开始，后接氨基酸编码密码子，并且以终止密码子(例如tga、taa、tag)结束。在某些实施例中，orf编码病毒复制所必需并且与非肿瘤细胞相比优先在肿瘤细胞中表达的酶的至少一部分。如本文所用，术语“表达”是指蛋白质或肽序列由其编码dna或rna序列产生的过程。在某些实施例中，酶是激酶。在某些实施例中，orf中的缺失占orf全长的100％、大于99％、大于98％、大于95％、大于90％、大于85％、大于80％、大于75％、大于70％、大于65％、大于60％、大于55％、大于50％、大于45％、大于40％、大于35％、大于30％、大于25％、大于20％、大于15％或大于10％。在某些实施例中，orf中的缺失占至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、500、800、1000、1200、1500、1800、2000、2200、2400、2500个或更多个核苷酸(任选地连续)。在某些实施例中，胸苷激酶(tk)的orf经缺失或破坏。tk在脱氧核糖核苷酸的合成中涉及。tk是正常细胞中的病毒复制所需的，因为这些细胞一般具有低浓度核苷酸，而tk在含有高核苷酸浓度的肿瘤细胞中非必需。在痘病毒中，胸苷激酶编码基因位于基因座j2r。在某些实施例中，tk完全缺失。在某些实施例中，核糖核苷酸还原酶(rr)的orf经缺失或破坏。rr催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，这是dna生物合成中的关键步骤。病毒酶由命名为rl和r2的两个异源亚基构成，所述亚基分别由i4l和f4l基因座编码。i4l和f4l基因的序列和其在各种痘病毒的基因组中的位置可在公共数据库中获得，例如通过基因库登录号dq437594、dq437593、dq377804、ah015635、ay313847、ay313848、nc_003391、nc_003389、nc_003310、m-35027、ay243312、dq011157、dq011156、dq011155、dq011154、dq011153、y16780、x71982、af438165、u60315、af410153、af380138、u86916、l22579、nc_006998、dq121394和nc_008291。在本发明的情形下，i4l基因(编码rl大亚基)或f4l基因(编码r2小亚基)中任一者或两者可经缺失或干扰。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒的病毒基因组进一步包含额外缺失或破坏，其进一步提高病毒的肿瘤特异性。在某些实施例中，额外缺失或破坏处于编码在肿瘤细胞中优先或特异性表达的肿瘤特异性蛋白的至少一部分的orf中。肿瘤特异性蛋白的代表性实例是vgf。vgf是在细胞受病毒感染后早期表达的分泌性蛋白，并且其功能似乎对病毒在正常细胞中传播很重要。另一实例是编码血凝素的a56r基因(zhang等人,2007,《癌症研究(cancerres.)》67:10038-46)。另一实例是f2l基因，其编码在维持dna复制保真度和为由胸苷酸合酶产生tmp提供前体两者中涉及的病毒脱氧尿苷三磷酸酶(dutpase)(broyles等人,1993,《病毒学(virol.)》195:863-5)。牛痘病毒f2l基因的序列可在基因库中通过登录号m25392获得。免疫检查点抑制剂本文所提供的修饰的溶瘤病毒包含具有编码免疫检查点抑制剂的第一异源多核苷酸的病毒基因组。如本文所用，术语“异源”意指序列对于野生型病毒来说不是内源性的。如本文所用，术语“编码(encode/encodingfor)”是指能够被转录成mrna和/或翻译成肽或蛋白质。如本文所用，术语“免疫检查点蛋白”是指对于防止不受控免疫反应来说重要，并且因此对于维持自身耐受和/或组织保护来说重要的免疫路径中直接或间接涉及的蛋白质。如本文所用的一种或多种免疫检查点调节剂可独立地在t细胞介导的免疫的任何步骤处起作用，所述步骤包括抗原特异性细胞的克隆选择、t细胞激活、增殖、运输到抗原和炎症部位、执行直接效应功能和通过细胞因子和膜配体进行信号传导。如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指能够以负方式调节免疫检查点蛋白功能的分子。免疫检查点抑制剂可以是本领域中已知的分子模态中的任一种，包含但不限于适体、mrna、sirna、微小rna、shrna、肽、抗体、球形核酸、talen、锌指核酸酶和crispr/cas9。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是抑制性免疫检查点分子的天然或工程化拮抗剂，包含例如ctla-4的配体(例如b7.1、b7.2)、tim3的配体(例如半乳糖凝集素-9)、a2a受体的配体(例如腺苷、瑞加德松(regadenoson))、lag3的配体(例如mhci类或mhcii类分子)、btla的配体(例如hvem、b7-h4)、kir的配体(例如mhci类或mhcii类分子)、pd-1的配体(例如pd-l1、pd-l2)、ido的配体(例如nktr-218、吲哚莫德(indoximod)、nlg919)。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是选自下组的抗体(例如拮抗剂抗体)：抗pd-1(例如纳武单抗(nivolumab)、匹立珠单抗(pidilizumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、bms-936559、bms-936558、阿特珠单抗(atezolizumab)、兰利珠单抗(lambrolizumab)、mk-3475、amp-224、amp-514、sti-a1110、tsr-042或anb011)、抗pd-l1(例如ky-1003、mcla-145、阿特珠单抗、medi-4736、msb0010718c、sti-a1010、mpdl3280a、达匹利珠单抗(dapirolizumab)cdp-7657、medi-4920，或pct/us2001/020964中所述的那些)、抗pd-l2、抗(pd-l1和pd-l2两者)(例如aur-012和amp-224)、抗ctla-4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美单抗(tremelimumab)或kahr-102)、抗ido(例如d-l-甲基-色氨酸(鲁纳特(lunate)))、抗kir(例如利瑞鲁单抗(lirilumab)、iph2101或iph4102)、抗lag3(例如bms-986016、imp701、imp321或c9b7w)、抗tim3(例如f38-2e2或enum005)、抗vista(例如va.f6)抗btla(例如af3354)、抗cd73(例如osu-hdac42或medi-9447)、抗b7-h3(例如mga271、ds-5573a或8h9)、抗a2ar、抗b7-1、抗b7-h3(例如mga271)、抗b7-h4、抗(b7-h3和b7-h4两者)、抗cd52(例如阿仑单抗(alemtuzumab))、抗il-10、抗il-35、抗mica(例如iph43)和抗cd39。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是能够特异性结合选自下组的免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段：pd-1、pd-l1/2、ctla-4、b7-h3/4、lag3、tim-3、vista和cd160。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗pd-l1或抗pd-l2抗体，或pd-l1和pd-l2两者的抑制剂。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗b7-h3或抗b7-h4抗体，或b7-h3和b7-h4两者的抑制剂。pd-1抑制剂在某些实施例中，本公开的第一异源多核苷酸编码pd-1抑制剂。如本文所用，术语“pd-1”是指程序性细胞死亡蛋白，其属于免疫球蛋白超家族并且充当共抑制性受体以负向调控免疫系统。pd-1是cd28/ctla-4家族成员，并且具有两种已知配体，包含pd-l1和pd-l2。人pd-1的代表性氨基酸序列以基因库登录号：np_005009.2公开，并且编码人pd-1的代表性核酸序列以基因库登录号：nm_005018.2显示。pd-1负向调节t细胞激活，并且这一抑制性功能与其细胞质结构域的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(itim)有关(parry等人,2005,《分子与细胞生物学(mol.cell.biol.)》25:9543-53)。破坏pd-1的这一抑制性功能可引起自身免疫。由pd-1产生的持续负信号在许多病理性情况，如肿瘤免疫逃避和慢性病毒感染中的t细胞功能障碍中牵涉。pd-1抑制剂可以是抑制pd-1活性的任何药剂，如使pd-1活性降低至少5％、10％、20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多的那些药剂。活性(例如pd-1的活性)可由于例如功能蛋白与其配体之间的结合(例如pd-1与pd-l1之间的结合)的抑制、其生物激活(例如pd-1的激活)的抑制和/或水平(例如pd-1水平)降低而降低。在某些实施例中，pd-1抑制剂是能够特异性结合pd-1的抗体(例如拮抗性抗体)。如本文所用，术语“特异性结合(specificbinding/specificallybinds)”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。在某些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段特异性结合人和/或猴pd-1，其结合亲和力(kd)≤10-6m(例如≤5×10-7m、≤2×10-7m、≤10-7m、≤5×10-8m、≤2×10-8m、≤10-8m、≤5×10-9m、≤2×10-9m、≤10-9m、≤10-10m)。如本文所用，kd是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)，其可以使用表面等离子体子共振方法，例如使用如biacore的仪器来确定。在某些实施例中，pd-1抑制剂是针对pd-1的全长单克隆抗体。在某些实施例中，pd-1抗体特异性结合seqidno:1。在某些实施例中，pd-1抗体或其抗原结合片段包含第一重链，所述第一重链包含seqidno:2、3和4。如本文相对于氨基酸序列(或核酸序列)所用，术语“同一性”是指在比对候选序列与参照序列并在必要时引入空位以获得最大数目的相同氨基酸(或核酸)后，候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代不视为相同残基。出于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的进行的比对可例如使用可公开获得的工具，如blastn、blastp(可在美国国家生物技术信息中心(u.s.nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的网站上获得，另参见altschuls.f.等人,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,215:403-410(1990)；stephenf.等人,《核酸研究(nucleicacidsres.)》,25:3389-3402(1997))、clustalw2(可在欧洲生物信息研究所(europeanbioinformaticsinstitute)网站上获得，另参见higginsd.g.等人,《酶学方法(methodsinenzymology)》,266:383-402(1996)；larkinm.a.等人,《生物信息学(bioinformatics)》(英格兰牛津(oxford,england)),23(21):2947-8(2007)))和align或megalign(dnastar)软件实现。本领域的技术人员可使用所述工具提供的默认参数，或可自定义适于比对的参数，例如通过选择合适算法进行。在某些实施例中，重链包含具有seqidno:5或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，重链包含seqidno:6的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸包含seqidno:7的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸包含seqidno:8的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，pd-1抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链，所述轻链包含seqidno:9、10和11。在某些实施例中，轻链包含具有seqidno:12的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，轻链包含seqidno:13的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸进一步包含seqidno:14的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸进一步包含seqidno:15的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。免疫激活剂本文所提供的修饰的溶瘤病毒包含具有编码免疫激活剂的第二异源多核苷酸的病毒基因组。如本文所用，术语“免疫激活剂”是指能够增强免疫系统的任何药剂。如本文所用，术语“增强免疫系统”是指药剂刺激t细胞活性、b细胞活性、巨噬细胞活性和/或nk细胞活性产生的能力。在某些实施例中，免疫激活剂是共刺激激活剂、nk激活剂或巨噬细胞激活剂。共刺激分子激活剂在某些实施例中，免疫激活剂是共刺激分子激活剂。如本文所用，术语“共刺激分子”是指除抗原受体或fc受体以外的细胞表面分子，其在结合抗原时提供t淋巴细胞的有效激活和功能所需的第二信号。这类共刺激分子的实例包含cd137(即4-1bb)、cd27、cd70、cd86、cd80、cd28、cd40、cd122、tnfrs25、ox40(cd134)、gitr、神经纤毛蛋白和icos(即cd278)。在某些实施例中，共刺激激活剂可以是可增强细胞免疫系统的肽、多肽(例如抗体)。在某些实施例中，共刺激激活剂是结合共刺激分子并且因此刺激共刺激分子的活性的抗体或这种抗体的抗原结合片段，如cd137抗体(例如bms-663513或pf-05082566)、cd28抗体(例如tgn-1412)、cd40抗体(例如cp-870,893、cdx1140、bi-655064、bms-986090、apx005或apx005m)、ox40(cd134)抗体(例如medi6383、medi6469、medi0562，或美国专利号7,959,925中所描述的那些)、抗gitr(例如trx518、inbrx-110或nov-120301)、cd70抗体、cd86抗体、cd80抗体、cd122抗体、tnfrs25抗体、神经纤毛蛋白抗体和cd27抗体(例如cdx-1127、bion-1402或hcd27.15)。cd137激活剂在某些实施例中，本公开的第二异源多核苷酸编码cd137激活剂。cd137，也称为4-1bb，是肿瘤坏死因子受体(tnfr)基因家族成员，所述家族包含调控细胞增殖、分化和程序性细胞死亡中涉及的蛋白质(a.ashkenazi,《自然(nature)》,2:420-430,(2002))。cd137主要在激活的t细胞(包含cd4+和cd8+细胞两者)、nk细胞和nkt细胞上表达(参见b.kwon等人,《分子细胞(mol.cell)》10:119-126,(2000)；j.hurtado等人,《免疫学杂志(j.immunol.)》155:3360-3365,(1995)；和l.melero等人,《细胞免疫学(cell.immunol.)》190:167-172,(1998))。cd137激活剂可以是增强pd-1活性的任何药剂，如使cd137活性增强至少5％、10％、20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多的那些药剂。在某些实施例中，cd137激活剂是特异性结合cd137的抗体。在某些实施例中，cd137激活剂是全长抗体。在某些实施例中，cd137抗体或其抗原结合片段特异性结合seqidno:16。在某些实施例中，cd137抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含seqidno:17、18和19。在某些实施例中，重链包含具有seqidno:20的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，重链包含seqidno:21的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸包含seqidno:22的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸包含seqidno:23的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链，所述轻链包含seqidno:24、25和26。在某些实施例中，轻链包含具有seqidno:27的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列的可变区。在某些实施例中，多核苷酸进一步包含seqidno:28的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，轻链包含seqidno:29的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，多核苷酸进一步包含seqidno:30的核酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源序列。nk激活剂在某些实施例中，免疫激活剂是刺激nk细胞活性的nk激活剂。在某些实施例中，nk激活剂是结合nk分子的第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，nk激活剂选自下组：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglec)抗体、tigit抗体、kir抗体和nkg2a/d抗体(例如莫那力单抗(monalizumab))。巨噬细胞激活剂在某些实施例中，免疫激活剂是刺激巨噬细胞活性的巨噬细胞激活剂。在某些实施例中，巨噬细胞激活剂是结合巨噬细胞分子的第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，巨噬细胞激活剂选自下组：csf1r抗体(例如fpa008)、csf1激酶抗体、ps抗体和cd47抗体(例如cc-90002、tti-621或vlst-007)。抗体如本文所用，术语“抗体”包含结合特异性抗原的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(二价)抗体。天然完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区和第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，并且哺乳动物轻链分类为λ或κ。抗体呈“y”形，其中y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。y的每条臂包含与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区，其中重链的第一恒定区通过铰链区连接到第二恒定区。轻链和重链的可变区是产生抗原结合特异性的原因。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(cdr)(轻(l)链cdr包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，重(h)链cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可以通过kabat、chothia或al-lazikani的惯例来定义或鉴别(详情参见al-lazikani,b.,chothia,c.,lesk,a.m.,《分子生物学杂志》,273(4),927(1997)；chothia,c.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；chothia,c.和lesk,a.m.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；chothia,c.等人,《自然》12月21日-28日；342(6252):877-83(1989)；kabate.a.等人,马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.)(1991))。三个cdr插入在称为框架区(fr)的侧翼片段之间，框架区比cdr更高度保守，并形成支撑可变区的结构的支架。重链和轻链的恒定区与抗原结合特异性不相关，但展现各种效应功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，分别以存在α、δ、ε、γ和μ重链为特征。若干主要的抗体类别分为亚类，如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个cdr的抗体的一部分形成的抗体片段，但不包含完整抗体结构。抗原结合片段的实例包含但不限于fab、fab′、f(ab′)2、fv片段、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体、骆驼化单结构域抗体和纳米抗体(nanobody)。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。如本文所用，术语“fab”是指抗体的由通过二硫键结合单一重链的可变区和第一恒定区的单一轻链(可变区和恒定区两者)组成的部分。如本文所用，术语“fab′”是指包含铰链区的一部分的fab片段。如本文所用，术语“f(ab′)2”是指fab′的二聚体。如本文所用，术语“fv”是指由单一轻链的可变区和单一重链的可变区组成的fv片段。如本文所用，术语“单链fv抗体”或“scfv”是指由轻链可变区和重链可变区直接或通过肽接头序列彼此连接组成的工程化抗体(参见例如hustonjs等人《美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)》,85:5879(1988))。如本文所用，术语“scfv二聚体”是指由两个scfv形成的聚合物。术语“骆驼化单结构域抗体”，也称为“重链抗体”或“hcab”(仅重链抗体)是指含有两个重链可变区但不含轻链的抗体(参见例如riechmannl.和muyldermanss.,《免疫学方法杂志(jimmunolmethods.)》12月10日；231(1-2):25-38(1999)；muyldermanss.,《生物技术杂志(jbiotechnol.)》6月；74(4):277-302(2001)；wo94/04678；wo94/25591；和美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初衍生自骆驼科(camelidae)(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。虽然不含轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱系(参见hamers-castermanc.等人,《自然》363(6428):446-8(1993)；nguyenvk.等人,“骆驼科重链抗体：进化创新案例(heavy-chainantibodiesincamelidae；acaseofevolutionaryinnovation),”《免疫遗传学(immunogenetics.)》54(1):39-47(2002)；和nguyenvk.等人,《免疫学(immunology.)》109(1):93-101(2003)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。如本文所用，术语“纳米抗体”是指由来自重链抗体的重链可变区与两个恒定区ch2和ch3组成的抗体。在某些实施例中，本文所提供的抗体是完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体或兔抗体。在某些实施例中，本文所提供的抗体是多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体。在某些实施例中，本文所提供的抗体是单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在某些实施例中，本文所提供的抗体可进一步经标记。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是完全人抗体，其任选地由转基因大鼠，例如内源性大鼠免疫球蛋白基因表达失活，并且携带具有j基因座缺失和c-κ突变的重组人免疫球蛋白基因座的转基因大鼠产生，并且所述抗体也可由工程化细胞(例如cho细胞)表达。如本文所用，关于抗体或抗原结合片段，术语“完全人”是指抗体或抗原结合片段的氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞产生的抗体，或衍生自非人源，如利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的转基因非人动物的抗体的氨基酸序列。如本文所用，关于抗体或抗原结合片段，术语“人源化”是指包含衍生自非人动物的cdr、衍生自人的fr区和在适用时衍生自人的恒定区的抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，人源化抗体或抗原结合片段适用作人治疗剂，因为其具有降低的免疫原性。在某些实施例中，非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。在某些实施例中，人源化抗体或抗原结合片段除cdr序列为非人序列外，基本上全部由人序列构成。如本文所用，关于抗体或抗原结合片段，术语“嵌合”是指具有衍生自一种物种的一部分重链和/或轻链和衍生自不同物种的其余重链和/或轻链的抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，嵌合抗体可包含衍生自人的恒定区和来自非人物种，如来自小鼠或兔的可变区。如本文所用，关于氨基酸序列，术语“保守取代”是指用具有相似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如met、ala、val、leu和ile)间、具有中性亲水性侧链的残基(例如cys、ser、thr、asn和gln)间、具有酸性侧链的残基(例如asp、glu)间、具有碱性侧链的氨基酸(例如his、lys和arg)间或具有芳香族侧链的残基(例如trp、tyr和phe)间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。多核苷酸在某些实施例中，本公开的修饰的溶瘤病毒含有编码特异性结合pd-1的抑制性抗体或其抗原结合片段的第一异源多核苷酸，和编码特异性结合cd137的激活抗体或其抗原结合片段的第二异源多核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)或混合型核糖核酸-脱氧核糖核酸，如dna-rna杂交体。多核苷酸或核酸可以是单链或双链dna或rna或dna-rna杂交体。多核苷酸或核酸可以是线性或环形。在某些实施例中，其中当病毒是dna病毒时，第一和第二异源多核苷酸都是dna；或当病毒是rna病毒时，第一和第二异源多核苷酸都是rna。在某些实施例中，第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸都是双链dna。第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸可使用本领域中已知的常规方法引入到修饰的溶瘤病毒中，例如通过由聚合酶链反应(pcr)合成和与具有相容性限制端的病毒基因组连接。关于更多细节，参见例如sambrook等人《分子克隆：实验指南(molecularcloning:alaboratorymanual)》(纽约冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory,n.y.)(1989))，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸在orf中缺失的位置引入。在某些实施例中，第一异源多核苷酸紧接在第二异源多核苷酸的上游或紧接在第二异源多核苷酸的下游。如本文所用，术语“紧接在上游或紧接在下游”意指第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸在病毒基因组上足够接近地定位，使得其彼此间隔不超过0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。举例来说，如果上游多核苷酸的3′端与下游多核苷酸的5′端间隔不超过0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，则上游多核苷酸的3′端紧邻下游多核苷酸的5′端。在某些实施例中，第一异源多核苷酸与第二异源多核苷酸之间不存在orf。在某些实施例中，第一异源多核苷酸与第二异源多核苷酸之间存在限制位点。在某些实施例中，第一异源多核苷酸编码第一抗体的第一重链和第一轻链。在某些实施例中，第一异源多核苷酸进一步包含能够驱动第一重链表达的第一启动子和能够驱动第一轻链表达的第二启动子，其中第一启动子和第二启动子呈头对头方向。在某些实施例中，第一异源多核苷酸编码第一抗体的第一重链的可变区、接头和第一抗体的第一轻链的可变区。在某些实施例中，第一异源多核苷酸编码第一抗体的第一重链，但不编码第一抗体的第一轻链。如本文所用，术语“头对头方向”意指两个启动子在病毒基因组上彼此紧邻并且其在相反方向上驱动蛋白质表达。说明性实例显示于图2中。在某些实施例中，第二异源多核苷酸编码第二抗体的第二重链和第二轻链。在某些实施例中，第二异源多核苷酸进一步包含能够驱动第二重链表达的第三启动子和能够驱动第二轻链表达的第四启动子，其中第三启动子和第四启动子呈头对头方向。如本文所用，术语“启动子”是指可控制编码序列的转录的多核苷酸序列。启动子序列包含对于rna聚合酶识别、结合和转录起始来说足够的特定序列。另外，启动子序列可包含调节rna聚合酶的这一识别、结合和转录起始活性的序列。启动子可影响与自身位于同一核酸分子上的基因或与自身位于不同核酸分子上的基因的转录。取决于调控的性质，启动子序列的功能可以是组成性或可被刺激诱导的。如本文所用，“组成性”启动子是指用于不断地激活宿主细胞中的基因表达的启动子。如本文所用，“诱导性”启动子是指在某种刺激或某些刺激存在下激活宿主细胞中的基因表达的启动子。在某些实施例中，本公开的启动子是真核启动子，如来自cmv的启动子(例如cmv即刻早期启动子(cmv启动子))、埃-巴二氏病毒(epsteinbarrvirus；ebv)启动子、人类免疫缺陷病毒(hiv)启动子(例如hiv长末端重复序列(ltr)启动子)、莫洛尼病毒(moloneyvirus)启动子、小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)启动子、劳斯肉瘤病毒(roussarcomavirus；rsv)启动子、sv40早期启动子、来自人基因的启动子(如人肌球蛋白启动子、人血红素启动子、人肌肉肌酸启动子、人金属硫蛋白β-肌动蛋白启动子、人泛素c启动子(ubc))、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(pgk)、人胸苷激酶启动子(tk)、人延伸因子1α启动子(ef1a)、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、e2f-1启动子(e2f1转录因子1的启动子)、α-胎蛋白的启动子、胆囊收缩素的启动子、癌胚抗原的启动子、c-erbb2/neu致癌基因的启动子、环加氧酶的启动子、cxc-趋化因子受体4(cxcr4)的启动子、人附睾蛋白4(he4)的启动子、ii型己糖激酶的启动子、l-网素的启动子、粘蛋白样糖蛋白(muc1)的启动子、前列腺特异性抗原(psa)的启动子、存活素的启动子、酪氨酸酶相关蛋白(trp1)的启动子和酪氨酸酶的启动子。在某些实施例中，本公开的启动子可以是肿瘤特异性启动子。如本文所用，术语“肿瘤特异性启动子”是指用以优先或排他地在肿瘤细胞中激活基因表达，并且在非肿瘤细胞或非肿瘤细胞中不具有活性或具有降低的活性的启动子。肿瘤特异性启动子的说明性实例包含但不限于e2f-1启动子、α-胎蛋白的启动子、胆囊收缩素的启动子、癌胚抗原的启动子、c-erbb2/neu致癌基因的启动子、环加氧酶的启动子、cxcr4的启动子、he4的启动子、ii型己糖激酶的启动子、l-网素的启动子、muc1的启动子、psa的启动子、存活素的启动子、trp1的启动子和酪氨酸酶的启动子。在某些实施例中，第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸被配置成使得其在修饰的溶瘤病毒的复制周期的相同或不同阶段中表达。举例来说，两种多核苷酸可都由在病毒复制早期诱导的早期启动子驱动，或替代地，都由在病毒复制晚期诱导的晚期启动子驱动，或替代地，一种由早期启动子驱动，并且另一种由晚期启动子驱动。在某些实施例中，第一启动子和第二启动子相同或不同。在某些实施例中，第一启动子和第二启动子都是晚期启动子。在某些实施例中，晚期启动子是psl。在某些实施例中，第三启动子和第四启动子相同或不同。在某些实施例中，第三启动子和第四启动子都是早期和晚期启动子。在某些实施例中，早期和晚期启动子是pse/l。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒在有义链的5′到3′方向上在框中包含以下元件：编码结合cd137的抗体的轻链的多核苷酸-第一早期和晚期启动子-第二早期和晚期启动子-编码结合cd137的抗体的重链的多核苷酸-编码结合pd-1的抗体的重链的多核苷酸-第一晚期启动子-第二晚期启动子-编码结合pd-1的抗体的轻链的多核苷酸。在某些实施例中，由第一异源多核苷酸表达的免疫检查点抑制剂和由第二异源多核苷酸表达的免疫激活剂表达为单独的蛋白质。换句话说，其不表达为融合蛋白，且彼此不连接(无论是共价连接还是通过接头)。在某些实施例中，由第一异源多核苷酸表达的免疫检查点抑制剂不与任何其它蛋白质融合，并且由第二异源多核苷酸表达的免疫激活剂不与任何其它蛋白质融合。在某些实施例中，除第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸以外，修饰的溶瘤病毒不包含编码免疫检查点抑制剂或免疫激活剂的任何其它异源多核苷酸。在某些实施例中，除第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸以外，修饰的溶瘤病毒不包含任何编码其它蛋白质的异源多核苷酸。药物组合物在另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含本公开中所描述的修饰的溶瘤病毒和药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内，适用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在某些实施例中，药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型是指被管理机构(如美国食品和药物管理局(u.s.foodanddrugadministration)、中国国家食品药品监督管理总局(chinafoodanddrugadministration)或欧洲药物管理局(europeanmedicinesagency))批准或公认药典(如美国药典(u.s.pharmacopoeia)、中国药典(chinapharmacopoeia)或欧洲药典(europeanpharmacopoeia))中所列的可用于动物且特别是人的那些。用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载剂可包含但不限于例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂(例如氯化钠注射液、林格氏注射液(ringer′sinjection)、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或林格氏葡萄糖和乳酸盐注射液)、非水性媒剂(例如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抗微生物剂、等渗剂(如氯化钠或右旋糖)、缓冲液(如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、抗氧化剂(如硫酸氢钠)、麻醉剂(如盐酸普鲁卡因(procainehydrochloride))、悬浮/分散剂(如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸))、乳化剂(如聚山梨醇酯80(吐温(tween)-80))、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其它组分，或其各种组合。合适的组分可包含例如填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。在某些实施例中，药物组合物是口服配制物。口服配制物包含但不限于胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、糖衣锭(对于味道基质，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末剂、颗粒剂、或水性或非水性溶液或悬浮液、或油包水或水包油乳液、或酏剂或糖浆、或糖果口含锭(对于惰性基料，如明胶和甘油或蔗糖或阿拉伯胶)和/或漱口水和其类似物。在某些实施例中，药物组合物可以是可注射配制物，包含无菌水性溶液或分散液、悬浮液或乳液。在所有情况下，可注射配制物应是无菌且应是液体以便于注射。其在制造和存储条件下应是稳定的，且应对微生物(如细菌和真菌)感染具有抗性。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物和/或植物油。可注射配制物应维持适当流动性，所述流动性可通过多种方式维持，例如使用包衣(如卵磷脂)、使用表面活性剂等。可通过添加各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现抗微生物污染。在某些实施例中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。用于肠胃外施用的所有制剂都应是无菌且无热原质的，正如本领域中已知和实践的那样。治疗方法在另一方面，本公开提供一种治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的修饰的溶瘤病毒或本公开的药物组合物。如本文所用，术语“受试者”是指人和非人动物。非人动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。“受试者”也可以是家畜动物(例如牛、猪、山羊、鸡、兔或马)、或啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、或灵长类(例如大猩猩或猴)或家养动物(例如狗或猫)。“受试者”可以是雄性或雌性，且还可以处于不同年龄。在某些实施例中，受试者是人。人“受试者”可以是高加索人、非洲人、亚洲人、苏美尔人或其它种族，或不同种族的混血。人“受试者”可以是老年人、成年人、少年、儿童或婴儿。如本文所用，术语“肿瘤”是指由赘生性或恶性细胞生长、增殖或转移介导的任何医学病况，并且包含实体肿瘤和如白血病的非实体肿瘤两者。在本公开中，“肿瘤”可与术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“过度增殖”和“赘生物”互换使用。除非另外明确指示，否则术语“肿瘤细胞”可与术语“癌细胞”、“恶性细胞”、“过度增殖性细胞”和“赘生性细胞”互换。在某些实施例中，肿瘤选自下组：头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、肝肿瘤、胰腺癌、胆囊和胆管肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、小细胞肺肿瘤、非小细胞肺肿瘤、肾细胞癌、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、骨肿瘤、间皮瘤、脑肿瘤、软组织肉瘤、子宫肿瘤、甲状腺肿瘤、鼻咽癌和黑色素瘤。在某些实施例中，肿瘤是实体肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌或肝细胞癌。在某些实施例中，肿瘤难以用先前疗法(例如分开施用溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂和/或免疫激活剂)治疗。如本文所用，术语病况的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或结束与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况或其某一组合。关于肿瘤，“治疗”可以指抑制或减缓赘生性或恶性细胞生长、增殖或转移，预防或延迟赘生性或恶性细胞发展、增殖或转移的发展或其某一组合。关于肿瘤，“治疗”包括根除肿瘤的全部或部分，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延迟肿瘤的发展或其某一组合。修饰的溶瘤病毒和药物组合物可通过本领域中已知的任何合适途径施用，包含但不限于肠胃外、口服、肠内、颊内、经鼻、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、经皮、真皮、经眼、经肺和皮下施用途径。在某些实施例中，施用途径是局部施用。在某些实施例中，施用途径是瘤内注射。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒和药物组合物以治疗有效剂量施用。如本文所用，术语“治疗有效剂量”是指能够改善或消除受试者的疾病或症状，或预防性抑制或预防疾病或症状发生的药物的量。治疗有效量可以是在一定程度上改善受试者的一种或多种疾病或症状的药物的量；能够使与疾病或症状的起因相关的一种或多种生理或生化参数部分或完全恢复回到正常的药物的量；和/或能够降低疾病或症状发生的可能性的药物的量。修饰的溶瘤病毒和药物组合物的治疗有效剂量取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、预先存在的医学病况、当前接受的疗法、健康状况，和药物相互作用的强度、过敏、超敏和副作用，和施用途径以及疾病发展的程度。本领域的技术人员(例如医师或兽医)可根据这些或其它条件或要求减少或增加剂量。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒和药物组合物可以约104pfu到约1014pfu的治疗有效剂量施用(例如约104pfu、约2*104pfu、约5*104pfu、约105pfu、约2*105pfu、约5*105pfu、约106pfu、约2*106pfu、约5*106pfu、约107pfu、约2*107pfu、约5*107pfu、约108pfu、约2*108pfu、约5*108pfu、约109pfu、约2*109pfu、约5*109pfu、约1010pfu、约2*1010pfu、约5*1010pfu、约1011pfu、约2*1011pfu、约5*1011pfu、约1012pfu、约2*1012pfu、约5*1012pfu、约1013pfu、约2*1013pfu、约5*1013pfu或约1014pfu)。在某些实施例中，修饰的溶瘤病毒和药物组合物以约1011pfu或更小的剂量施用。在这些实施例中的某些中，剂量是5*1010pfu或更小、2*1010pfu或更小、5*109pfu或更小、4*109pfu或更小、3*109pfu或更小、2*109pfu或更小或109pfu或更小。特定剂量可划分并按时间间隔多次施用，例如每天一次、每天两次或更多次、每月两次或更多次、每周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次或每两个月或更长时间一次。在某些实施例中，施用剂量可以在治疗过程中改变。举例来说，在某些实施例中，最初施用剂量可高于随后施用剂量。在某些实施例中，取决于施用受试者的反应，在治疗过程中调整施用剂量。如本文所用，术语“pfu”是指噬菌斑形成单位，其为能够形成噬菌斑的粒子的数目的量度。可以调整剂量方案以提供最优的期望反应(例如治疗反应)。举例来说，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。组合在某些实施例中，药物组合物可与一种或多种其它药物组合使用。在某些实施例中，组合物包含至少一种其它药物。在某些实施例中，其它药物是抗肿瘤剂。已知具有抗肿瘤活性的任何药剂可用作抗肿瘤剂。在某些实施例中，抗肿瘤剂选自下组：化学剂、多核苷酸、肽、蛋白质或其任何组合。在某些实施例中，抗肿瘤剂是化学剂。抗肿瘤化学剂的说明性实例包含但不限于丝裂霉素(mitomycin)c、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、他莫昔芬(tamoxifen)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和雷帕霉素(rapamycin)。在某些实施例中，抗肿瘤剂是多核苷酸。抗肿瘤多核苷酸的说明性实例包含但不限于反义寡核苷酸，如bcl-2反义寡核苷酸、丛生蛋白(clusterin)反义寡核苷酸和c-myc反义寡核苷酸；和能够进行rna干扰的rna(包含小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)和微干扰rna(mirna))，如抗vegfsirna、shrna或mirna，抗bcl-2sirna、shrna或mirna和抗紧密连接蛋白(claudin)3sirna、shrna或mirna。在某些实施例中，抗肿瘤剂是肽或蛋白质。抗肿瘤肽或蛋白质的说明性实例包含但不限于抗体，如曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、依决洛单抗(edrecolomab)、阿仑单抗、达利珠单抗(daclizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)和依决洛单抗，蛋白质治疗剂，如内皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)k1-3、亮丙瑞林(leuprolide)、性激素结合球蛋白和比库蛋白(bikunin)。医学用途在另一方面，本公开提供本公开的修饰的溶瘤病毒或本公开的药物组合物在制造用于治疗肿瘤的药剂中的用途。在另一方面，本公开提供用于治疗肿瘤的本公开的修饰的溶瘤病毒或本公开的药物组合物。实例阐述以下实例以帮助理解本公开，并且以下实例不应理解为以任何方式限制如随后的权利要求书中所限定的本发明范围。实例1：病毒构建牛痘病毒的起始wr病毒株获自atcc(www.atcc.org:vr-1354)。由于涉及多个基因，因此用逐步工程化方法建立wr-gs-600。简单来说，在第一步骤中，将wrdna与修饰的psem-1载体(rintoul等人,2011)重组以将标记/选择基因插入到tk基因座中。这使得可容易与野生型亲本区别以便进一步工程化。之后，将具有j1r和j3r的侧接序列并且编码抗人pd-1(抗人pd-1的氨基酸序列和编码抗人pd-1的核酸序列分别显示于图15和16中)和抗人4-1bb(抗人4-1bb的氨基酸序列和编码抗人4-1bb的核酸序列分别显示于图17和18中)的重组质粒转染到经wr感染的u2os细胞中，以完全缺失tk并且插入抗体序列。图1显示wr-gs-600中胸苷激酶(tk)缺失、抗pd-1和抗4-1bb抗体插入的结构，并且图3显示产生wr-gs-600的重组步骤的示意图。使用来自表征主工作细胞库的u2os细胞进行重组反应。使用u2os细胞进行三轮噬菌斑纯化，并且使用海拉细胞进行一轮噬菌斑纯化。之后，并入使用0.65μm过滤器的过滤步骤以确保挑选的最终噬菌斑是克隆的。详细信息描述于以下表1中。表1：wr-gs-600噬菌斑产生和纯化程序在进一步噬菌斑纯化后，通过免疫荧光和流式细胞术监测抗体表达。u2os和海拉细胞分别地经模拟感染(即经不含病毒的对照溶液感染)、经具有抗体表达的对照病毒感染或经wr-gs-600的纯化克隆株感染。最后，在两个滚瓶(1700cm2)中扩增具有经验证的dna序列和高水平抗体表达的一个独特克隆株。使细胞沉淀且随后再悬浮于1mmtrisph9.0中。在一轮冻融(-80/37度)后，再次使混合物沉淀。将上清液等分到12个低温试管中，每个试管1ml(预制主病毒库)。使沉淀细胞再悬浮于3ml1mmtrisph9.0中，并且经历另一轮冻/融。在沉淀后收集上清液，且随后使其经历过夜全能核酸酶(benzonase)处理和蔗糖纯化。使用u2os细胞确定预制mvb和纯化全能核酸酶的滴度。对于总共5ml储备液，发现滴度在1.0-2.1*109pfu/ml范围内，其类似于亲本wr病毒的滴度。wr-gs-610(插入编码抗人4-1bb的基因)和wr-gs-620(插入编码抗人pd-1的基因)通过与wr-gs-600相同的方案制造，不同之处在于wr-gs-600由编码抗人pd-1的基因和编码抗人4-1bb的基因两者插入。图2显示wr-gs-620中tk缺失和抗4-1bb抗体插入的结构，并且图4显示wr-gs-620的重组步骤的示意图。实例2：wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620的表征在这些新病毒的工程化过程期间，密切监测其基因组完整性和蛋白质表达。pcr、测序和限制消化从通过用全能核酸酶核酸内切酶处理病毒制剂，通过蔗糖沉淀，接着进行蛋白酶k和清洁剂处理纯化的蔗糖垫分离病毒的基因组dna，随后使用苯酚/氯仿/异戊醇萃取和乙醇沉淀来萃取并回收dna。为了确保病毒基因组具有携带设计的抗体序列的预期序列，已设计一系列引物，包含重组区内的引物和工程化区段外的引物。通过qpcr(塔克曼(taqman))确认病毒(wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620)身份。pcr中所使用的引物显示于表2中。病毒基因组中引物的位置显示于图5到7中，其中pcr条带的预测大小显示于图5到7中。wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620的基因组dna的pcr扩增的结果显示于图14中。还通过桑格测序(sangersequencing)验证tk缺失。图8、9和10显示在插入抗体编码基因后wr的基因变化。进行wr-gs-600病毒基因组相对于用于在wr-gs-600中表达抗hu4-1bb和抗hupd-1的设计的dna序列的桑格测序比对。比对显示wr-gs-600的病毒基因组与设计的dna序列相同。表2：用于pcr和测序的引物限制酶hindiii在wr的tk区附近切割并且产生5004bp的条带。当wr-gs-600中缺失tk并且插入抗hupd-1和/或抗hu4-1bb抗体时，引入两个额外hindiii限制位点，这产生分别1638、2548和4666bp的三个条带。对于wr-gs-620，野生型wr的5004bp条带由1922和4666bp的两个条带置换。限制消化模式中的这些不同可用于快速鉴别这些病毒。结果显示于表3中。表3：病毒基因组的hindiii消化免疫荧光通过针对人igg的免疫荧光验证人抗体的转基因表达(参见图11)。使用fitc缀合山羊抗人igg(h+l)(英杰公司(invitrogen)，目录号62-8411)来对病毒感染的u2os细胞进行染色。流式细胞术分析分别经模拟感染、经对照wr病毒(wr-mcherry)感染、经wr-gs-600感染和经wr-gs-620感染的海拉细胞的流式细胞术分析证实受wr-gs-600和wr-gs-620感染时人抗体的特异性表达。在蛋白质印迹中检测到的来自受感染上清液的人igg提供人抗体表达的进一步证据。蛋白质印迹从受感染上清液检测人igg的蛋白质印迹提供抗体表达的进一步证据。图12和13显示使用蛋白质印迹，由重组病毒(wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620)进行的抗pd-1和抗41-bb抗体表达，其中分别使用细胞溶解产物和上清液。使用pd-1结合elisa对表达的抗pd-1抗体进行功能表征将重组人pd-1fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯安迪生物公司(r&dsystems,minneapolis,mn))用含有0.1％牛血清白蛋白(bsa)的杜氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco′sphosphatebufferedsaline，dpbs)再悬浮到0.2mg/ml，并且用dpbs稀释到0.03μg/ml的最终浓度。将nunc-immunomaxisorp96孔培养板用每孔0.1ml重组pd-1fc嵌合体涂布，留下空孔用于非特异性结合对照，并且在4℃下培育过夜。去除涂布溶液并且用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20的dpbs，每次每孔200μl)洗涤培养板。将封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉，0.05％吐温-20的dpbs，每次每孔200μl)添加到所有孔中，并且在4℃下伴随混合培育1小时。去除封闭缓冲液并且用洗涤缓冲液洗涤培养板。在dpbs中制备wr-gs-620和wr-gs-600上清液的连续稀释液，并且将稀释的上清液(每孔100μl)添加到培养板中。将培养板室温下培育1.5小时。去除含抗体的上清液溶液，并且用洗涤缓冲液洗涤培养板。将辣根过氧化物酶标记的山羊抗人igg、f(ab′)2特异性f(ab′)2抗体(宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa))用dpbs稀释，并且每孔100μl添加到培养板中。将培养板在室温下培育1小时并且用洗涤缓冲液洗涤。添加每孔100μlsurebluetmb微孔过氧化酶底物(马里兰州盖瑟斯堡柯克加德和佩里实验室(kirkegaard&perrylabsgaithersburg,md))，并且在室温下培育20分钟。通过添加相同体积的2mh2so4来停止反应，并且在moleculardevicesspectramax340(加利福尼亚州森尼韦尔分子仪器公司(moleculardevices,sunnyvale,ca))上在450nm下读取吸光度。来自经moi0.05感染48小时的u2os的上清液用于分析，并且结果显示于图19中。这些结果表明表达的gs-620的抗pd-1抗体可特异性结合pd-1并且结合是浓度依赖性的。使用4-1bb结合elisa对表达的抗4-1bb抗体进行功能表征将人4-1bbigg1fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯安迪生物公司)用含有0.1％牛血清白蛋白(bsa)的杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)再悬浮到0.2mg/ml，并且用dpbs稀释到0.03μg/ml的最终浓度。将nunc-immunomaxisorp96孔培养板用每孔0.1ml重组4-1bb嵌合体涂布，留下空孔用于非特异性结合对照，并且在4℃下培育过夜。去除4-1bb溶液并且用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20的dpbs)洗涤培养板。将封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉，0.05％吐温-20的dpbs)添加到所有孔中，并且在4℃下伴随混合培育1小时。去除封闭缓冲液并且用洗涤缓冲液洗涤培养板。在dpbs中制备wr-gs-610和wr-gs-600上清液的连续稀释液，并且将稀释的上清液添加到培养板中。将培养板室温下培育1.5小时。去除含抗体的上清液溶液，并且用洗涤缓冲液洗涤培养板。将辣根过氧化物酶标记的山羊抗人igg、f(ab′)2特异性f(ab′)2抗体(宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究)用dpbs稀释，并且添加到培养板中。将培养板在室温下培育1小时并且用洗涤缓冲液洗涤。添加surebluetmb微孔过氧化酶底物(马里兰州盖瑟斯堡柯克加德和佩里实验室)，并且在室温下培育20分钟。通过添加相同体积的2mh2so4来停止反应，并且在moleculardevicesspectramax340(加利福尼亚州森尼韦尔分子仪器公司)上在450nm下读取吸光度。来自经moi0.05感染48小时的u2os的上清液用于分析，并且结果显示于图20中。这些结果表明表达的gs-600和gs-610的抗4-1bb抗体可特异性结合4-1bb并且结合是浓度依赖性的。以上测试显示wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620得到良好构建，并且可表达功能性对应抗体(对于wr-gs-600和wr-gs-620，抗pd1抗体，并且对于wr-gs-600和wr-gs-610，抗4-1bb抗体)。实例3：wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620重组病毒的体内研究进行以下研究以确定wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620重组病毒对于小鼠是否安全，和重组病毒是否可靶向并穿透小鼠的肿瘤。递送途径可以是静脉内(iv)或腹膜内(ip)。所有动物实验遵循当地动物护理委员会的指导进行。ct26、mc38、ht-29和hct-116细胞系中wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620的细胞毒性(细胞杀死数据)的测量结直肠癌细胞系ct26-lacz(鼠类)、mc38-luc(鼠类)、ht-29-luc(人)和hct-116-luc(人)用于体外细胞毒性测试。分别以三种不同moi，即0.01moi(3e2pfu)、0.1moi(3e3pfu)和1.0moi(3e4pfu)制备wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620。在三个不同时间点，即24小时、48小时和72小时进行测量。细胞制备：首先将每一细胞系接种在两个15cm组织培养皿中并且培育直到近汇合在75-90％之间。使用本领域普通技术人员已知的常规方法对细胞进行洗涤和计数。96孔平底培养板的每个孔用约3e4个细胞接种。每种细胞类型需要9个培养板用于9种不同实验条件。病毒稀释液制备：将病毒在冰上融化，接着在37℃水浴中融化以确保完全解冻。使融化病毒经历最大速度下涡旋两次，并且每次持续20秒。以三种不同浓度，即moi1.0、moi0.1和moi0.01制备wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620病毒。将50μl病毒添加到对应孔中，接着在4个象限中轻缓摇动96孔平底培养板以便混合。将培养板在37℃下补充有5％co2的情况下培育。moi1.0对应于3e4pfu/50μl或600pfu/μl或6e5pfu/ml。moi0.1对应于3e3pfu/50μl或60pfu/μl或6e4pfu/ml。moi0.01对应于3e2pfu/50μl或6pfu/μl或6e3pfu/ml。使用本领域普通技术人员已知的常规方法，使用阿尔玛蓝(alamarblue)来检测上文所提及的四种细胞系中病毒的细胞毒性。对于每种条件，以6次重复计算细胞活力。图21-23显示在三种不同浓度和三个不同时间点下，wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620处理的上文所提及的四种细胞类型的细胞活力无显著差异。这表明将检查点抑制剂抗体的多核苷酸序列并入到牛痘病毒(wr)基因组中不改变病毒的细胞毒性性质。图21-23进一步显示在病毒处理后，ht-29和hct-116细胞系的细胞活力降低比ct-26和mc-38更显著，指示人癌细胞对病毒感染和杀死更敏感。病毒载体的生物分布的测量组织均质化：将5个不同组中的25只balb/c小鼠(杰克逊实验室(jacksonlab))一次一个地处死。消毒喷雾后，切开小鼠，从其中切除50到100mg肿瘤、肺、脾、肝、脑或卵巢。将其余组织用oct速冻。将切除的组织称重并且放置到2.0ml艾本德管(eppendorftube)中。将组织样品在-80℃下冷冻过夜。第二天以本领域普通技术人员已知的方式将组织样品均质化。简单来说，将两个高压灭菌的5mmtissuelyser珠粒分配到每个管中。总共48个管装载到tissuelyser中。均质化在28hz下进行1分钟。然后，将转接器的插入物转向180°，并且均质化再运作1分钟以实现均匀均质化。此后，将500μldmem添加到每个样品中。将管在3500g下离心2分钟。将上清液转移到1.5ml艾本德管中并且在-80℃下存储，随后进行滴度测定。用于滴度测定的24孔格式：u2os细胞用于病毒滴度测定，并且制备10e2pfu/mljx594储备液(a)和31.0pfu/mljx594储备液(b)并用作阳性对照。对于5种组织，即脑(b)、肝(v)、肺(l)、卵巢(o)和脾(s)，对wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620的每种病毒制备三种浓度：(1)纯150μl用于感染；(2)来自(1)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染；和(3)来自(2)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染。对于对照(c)，将u2os细胞用以下处理：(1)150μl10e2pfu/mljx594储备液(a)；(2)150μl31.0pfu/mljx594储备液(b)；或(3)150μldmem。对于肿瘤(t)，对wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620的每种病毒制备六种浓度：(1)纯150μl用于感染；(2)来自(1)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染；(3)来自(2)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染；(4)来自(3)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染；(5)来自(4)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染；和(6)来自(5)的98μl在212μldmem中，混合，取150μl用于感染。如图24所示设置24孔培养板。用使用如组织均质化章节中所描述的方法从一只小鼠制备的肿瘤、肺、脾、肝、脑和卵巢细胞接种每个培养板。如上文所提及，将25只小鼠分成5组，每组具有5只小鼠，即5个培养板。第1组中的肿瘤、肺、脾、肝、脑和卵巢细胞经wr-gs-610感染，第2组中的所述细胞经wr感染，第3组中的所述细胞经wr-gs-620感染，第4组中的所述细胞经wr-gs-600感染，并且第5组中的所有细胞(除阳性对照孔中的细胞外)经配制缓冲液(fb)处理作为阴性对照，其中配制缓冲液包含30mmtris、10％蔗糖和150mmnacl，ph值为7。图25显示wr-gs-610病毒噬菌斑仅存在于肿瘤细胞孔中。图26显示wr病毒噬菌斑存在于肿瘤细胞孔和卵巢细胞孔两者中。图27显示wr-gs-620病毒噬菌斑存在于肿瘤细胞孔和卵巢细胞孔两者中。图28显示wr-gs-600病毒噬菌斑仅存在于肿瘤细胞孔中。图29显示第5组中的肿瘤细胞孔中不存在病毒噬菌斑。这些数据表明，与wr-gs-620和wr相比，wr-gs-600和wr-gs-610可更特异性靶向肿瘤。注射皮下肿瘤和其它组织中的体内病毒分布：目标：病毒载体的安全性和生物分布研究方案i.订购35只balb/c小鼠(查尔斯河(charlesriver))。将小鼠分配在5个处理组，pbs对照(fb)和wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620组中。ii.当肿瘤组的肿瘤到达5mm大小时开始处理。iii.通过尾静脉注射进行三次病毒注射(排程第1天、第4天、第7天)。iv.监测小鼠体重和健康状况。v.在第9天，处死小鼠并且收集来自脑、肺、肝、卵巢、脾的组织。通过对u2os细胞进行噬菌斑分析测定不同组织中的牛痘滴度。以下表3-5概述处理组、处理排程和麻醉、终点和安乐死。表3.处理组：组号组大小第1次注射剂量排程15对照-配制缓冲液n/a第1天、第4天、第7天25p6001e7pfu第1天、第4天、第7天35p6101e7pfu第1天、第4天、第7天45p6201e7pfu第1天、第4天、第7天75wr1e7pfu第1天、第4天、第7天表4.处理排程：日期第几天程序2019年7月26日-11称重和剪耳2019年7月26日sc右胁腹注射ct26细胞(#)2019年8月6日1注射it50μl(1e7pfu)病毒2019年8月9日4注射it50μl(1e7pfu)病毒2019年8月12日7注射itμl(1e7pfu)病毒2019年8月14日9心脏出血，颈脱位。收集脾、肝、卵巢、肺和脑表5.麻醉、终点和安乐死：通过对每组5只小鼠取平均来呈现数据。图30-32显示wr-gs-600和wr-gs-610优先存在于肿瘤中，并且在卵巢、脑、脾、肝和肺中观察到极少wr-gs-600和wr-gs-610病毒。相比之下，在瘤内注射后，在肿瘤、卵巢、脑、脾、肝和肺中观察到大量wr-gs-620病毒。这些数据证实wr-gs-600和wr-gs-610具有比wr-gs-620更高的肿瘤靶向特异性。此外，图30-32的条形图中的第二和第三条显示尽管wr-gs-600和wr-gs-610的每克组织pfu数在卵巢(wr-gs-610略高于wr-gs-600)、脑、脾、肝和肺中类似，但wr-gs-600的每克肿瘤组织的pfu数比wr-gs-610高约三倍。这表明在其它组织由wr-gs-600和wr-gs-610类似地感染时，与wr-gs-610相比，肿瘤可由wr-gs-600更严重感染。先前研究已显示牛痘西储病毒株可感染正常小鼠器官，尤其卵巢(zhaoy.等人,《病毒免疫学(viralimmunology)》,2011,24,387)，其与图31中呈现的结果一致。总体来说，这些数据表明，将编码免疫检查点抑制剂的第一异源多核苷酸和编码免疫激活剂的第二异源多核苷酸并入到溶瘤病毒，如wr中引起肿瘤靶向和感染的协同效应，这无法以其它方式通过野生型溶瘤病毒或仅具有第一异源多核苷酸或仅具有第二异源多核苷酸的修饰的溶瘤病毒来实现。不同病毒感染后ct-26鼠类肿瘤模型的肿瘤大小变化的测量将25只balb/c小鼠(杰克逊实验室)植入ct26肿瘤(ct-26lacz5e6细胞sg右胁腹)。将小鼠进一步分配在5个处理组中：配制缓冲液(fb)、wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620。当肿瘤组的肿瘤到达5mm大小时开始处理。在第1天、第4天和第7天瘤内注射1e7pfu的不同病毒，并且监测小鼠体重和健康状况。肿瘤生长，接着用卡尺测量肿瘤大小。记录肿瘤大小变化并且结果概述于图33中，其中第x天的肿瘤体积变化％通过将第x天的肿瘤体积与第1天的肿瘤体积进行比较来计算。图33显示在第1天、第4天和第7天病毒注射后，用wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620处理时的肿瘤体积大小增加比用配制缓冲液(fb)处理时小得多，表明上文所提及的病毒在体内的肿瘤抑制效果。同基因型小鼠模型中的功效测量制备balb/c小鼠的皮下ct-26lacz肿瘤模型。在第1天、第3天和第7天通过尾静脉注射注射1e7的不同病毒，并且监测小鼠体重和健康状况。终点设定为肿瘤>1,700mm3，并且研究在第31天结束。小鼠存活结果显示于图34中。不同病毒感染后人源化ht-29-luc皮下肿瘤模型的肿瘤大小变化的测量实验简单描述如下：第1天：订购30只rag2-/-il2rg缺陷小鼠(杰克逊实验室)并且植入ht-29肿瘤(ht-29luc5e6个细胞sq右胁腹)。第7天：ivis检查肿瘤生长。第8天：通过静脉内注射5.8e6个人pbmcip进行施用。第14天：ivis指派组。第15天：处理1e7it。第18天：ivis和处理1e7it。第24天：ivis。人外周血单核细胞移植的证实将经过处理的小鼠颌下抽血，并且获得100μl血液且将其添加到肝素钠中。溶解红细胞并且针对hcd45、cd3、cd8和cd4染色。在lsrfortessa上读取荧光结果并且其概述于图35和36中，其证实人外周血单核细胞成功移植到免疫缺陷小鼠中。病毒感染后的肿瘤体积变化概述于图37和38中。图37显示与对照组相比，用wr-gs-600处理的小鼠与用wr-gs-610、wr-gs-620或wr处理的小鼠相比展现肿瘤体积增加最小。更引起关注地，在ht-29-luc注射后第32天用wr-gs-600感染小鼠后，肿瘤大小不显著增加并且甚至从wr-gs-600处理的第8天减少。图38显示wr和wr-gs-620具有比wr-gs-600和wr-gs-610更早的终点，这是由于wr和wr-gs-620的毒性比wr-gs-600和wr-gs-610高。图38进一步显示当与配制缓冲液相比时，wr-gs-600和wr-gs-610可控制肿瘤生长。这些数据共同表明wr-gs-600和wr-gs-610的毒性比wr和wr-gs-620低，并且wr-gs-600和wr-gs-610都可控制肿瘤生长。图39和40显示通过体内成像ivis测量(ivis谱，珀金埃尔默(perkinelmer))得到的具有或不具有人pbmc的ncg小鼠中的人肿瘤ht-29生长。图41和42显示对于腹膜内注射病毒的人源化ht-29-luc腹膜内小鼠模型，wr-gs-600和wr-gs-620感染可显著降低肿瘤的化学发光强度，表明wr-gs-600和wr-gs-620的肿瘤抑制功效。与配制缓冲液相比，wr和wr-gs-610显示肿瘤的化学发光强度提高较小，表明wr和wr-gs-610的肿瘤生长控制功效。前述体外和体内结果指示wr、wr-gs-600、wr-gs-610和wr-gs-620可杀死癌细胞并且控制肿瘤生长。然而，wr和wr-gs-620展现较高毒性，这导致药物测试提早终止。wr-gs-600和wr-gs-610在肿瘤生长控制方面更有效，其中wr-gs-600的肿瘤靶向特异性比wr-gs-610高。更重要的是，在人源化ht-29腹膜内肿瘤小鼠模型中，腹膜内注射wr-gs-600减小肿瘤大小，而腹膜内注射wr-gs-610不停止肿瘤大小的增加，不过肿瘤大小增加的百分比比用wr处理时小得多。这些数据表明，并入编码免疫检查点抑制剂的异源多核苷酸和编码免疫激活剂的异源多核苷酸两者可降低毒性，提供肿瘤靶向特异性，并且改良肿瘤控制功效。关于本文中大体上任何复数和/或单数术语的使用，本领域的技术人员可在适于上下文和/或应用的情况下将复数转换成单数和/或将单数转换成复数。另外，在根据马库什(markush)群组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域的技术人员将认识到本公开也由此根据马库什群组的任何个别成员或成员子群组进行描述。虽然本文中已公开了各个方面和实施例，但本领域的技术人员应清楚其它方面和实施例。本文所公开的各个方面和实施例是出于说明的目的并且不打算是限制性的，其中真实的范围和精神是由所附权利要求书指示。序列表<110>上海锦斯生物技术有限公司<120>修饰的溶瘤病毒、其组合物和用途<130>068615-8001wo02<150>pct/cn2018/104830<151>2018-09-10<160>46<170>patentinversion3.5<210>1<211>268<212>prt<213>人类<400>1proglytrppheleuaspserproaspargprotrpasnproprothr151015pheserproalaleuleuvalvalthrgluglyaspasnalathrphe202530thrcysserpheserasnthrsergluserphevalleuasntrptyr354045argmetserproserasnglnthrasplysleualaalapheproglu505560aspargserglnproglyglnaspcysargpheargvalthrglnleu65707580proasnglyargaspphehismetservalvalargalaargargasn859095aspserglythrtyrleucysglyalaileserleualaprolysala100105110glnilelysgluserleuargalagluleuargvalthrgluargarg115120125alagluvalprothralahisproserproserproargproalagly130135140glnpheglnthrleuvalvalglyvalvalglyglyleuleuglyser145150155160leuvalleuleuvaltrpvalleualavalilecysserargalaala165170175argglythrileglyalaargargthrglyglnproleulysgluasp180185190proseralavalprovalpheservalasptyrglygluleuaspphe195200205glntrpargglulysthrprogluproprovalprocysvalproglu210215220glnthrglutyralathrilevalpheproserglymetglythrser225230235240serproalaargargglyseralaaspglyproargseralaglnpro245250255leuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu260265<210>2<211>5<212>prt<213>合成的<400>2asnserglymethis15<210>3<211>17<212>prt<213>合成的<400>3valiletrptyraspglyserlysargtyrtyralaaspservallys151015gly<210>4<211>4<212>prt<213>合成的<400>4asnaspasptyr1<210>5<211>113<212>prt<213>合成的<400>5glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleuaspcyslysalaserglyilethrpheserasnser202530glymethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alavaliletrptyraspglyserlysargtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleuphe65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser100105110ser<210>6<211>440<212>prt<213>合成的<400>6glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleuaspcyslysalaserglyilethrpheserasnser202530glymethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alavaliletrptyraspglyserlysargtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleuphe65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser100105110seralaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysser115120125argserthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasp130135140tyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthr145150155160serglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyr165170175serleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrlys180185190thrtyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasp195200205lysargvalgluserlystyrglyproprocysproprocysproala210215220proglupheleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro225230235240lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval245250255valaspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrval260265270aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln275280285pheasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln290295300asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysgly305310315320leuproserserileglulysthrileserlysalalysglyglnpro325330335arggluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthr340345350lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser355360365aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr370375380lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr385390395400serargleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphe405410415sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys420425430serleuserleuserleuglylys435440<210>7<211>339<212>dna<213>合成的<400>7cgaacttacggtcaccaatgtgccctgtccccagtaatcgtcgtttgtggcgcagtagta60tacggctgtgtcctcagcccgcagtgaattcatctgtaggaacaatgtatttttagagtt120gtccctactaatggtgaaccgtcccttcacagagtcggcgtaataacgcttggagccgtc180ataccagataactgccacccactccaagcccttgcctggcgcttgccgtacccagtgcat240cccgctgttagaaaaggtgatgccggaagccttacagtccaatcttagtgatctgcctgg300ctggacaactccgccgcctgactcaaccagctgtacttg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