用于调节肠道免疫的新型益生菌组合物的制作方法

mediates chronic intestinal inflammation by promoting the accumulation of il-17a secreting innate lymphoid cells and cd4(+)th17 cells.j exp med 2012；209:1595-1609。
11.(非专利文献3)：wang y,wang k,han gc,et al.:neutrophil infiltration favors colitis-associated tumorigenesis by activating the interleukin-1(il-1)/il-6axis.mucosal immunol 2014；7:1106-1115。
12.发明详述
13.技术问题
14.因此，结果是，本发明人为开发安全有效的炎症性肠病的治疗剂进行了深入的研究工作，证实了通过使用本发明独特的三种类型的乳酸菌的组合显著提高炎症性肠病的预防和治疗效果，具体而言，通过证实该效果优于通常用作炎症性肠病治疗药物的柳氮磺胺吡啶的效果完成本发明。
15.因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
16.本发明的另一目的是提供一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
17.本发明的另一目的是提供一种用于抗炎的(药物或食品)组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
18.本发明的另一目的是提供一种包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物用于制备预防或治疗炎症性肠病的配制物的用途。
19.本发明的另一目的是提供一种治疗炎症性肠病的方法，包括向有需要的对象施用有效量的包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物。
20.本发明的另一目的是提供一种包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物用于配制制备抗炎剂的配制物的用途。
21.本发明的另一目的是提供一种抑制炎症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物。
22.技术方案
23.为了实现上述目的，本发明提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
24.此外，本发明提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其由约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分组成。
25.此外，本发明提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其基本上由约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分组成。
26.为了实现另一目的，本发明提供一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
27.此外，本发明提供一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其由约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分组成。
28.此外，本发明提供一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其基本上由约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分组成。
29.为了实现另一目的，本发明提供一种用于抗炎的(药物或食品)组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
30.此外，本发明提供一种用于抗炎的(药物或食品)组合物，其由约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分组成。
31.此外，本发明提供一种用于抗炎的(药物或食品)组合物，其基本上由约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分组成。
32.为了实现另一目的，本发明提供一种包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物用于制备预防或治疗炎症性肠病的配制物的用途。
33.为了实现另一目的，本发明提供一种治疗炎症性肠病的方法，包括向有需要的对象施用有效量的包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物。
34.为了实现另一目的，本发明提供一种包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物用于配制制备抗炎剂的配制物的用途。
35.为了实现另一目的，本发明提供一种抑制炎症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物。
36.以下将对本发明进行详细描述。
37.在本发明中，术语“包含”与“包括”或“特征为”的使用相同，并且在组合物或方法中，不排除未提及的附加组成要素或方法步骤。术语“由
……
组成”与“由
……
构成”的使用相同，表示排除未具体描述的附加要素、步骤或成分。在组合物或方法的范围内，术语“基本上由
……
组成”或“基本上由
……
构成”意味着除了所描述的组成要素或步骤之外还包括实质上不影响其基本性质的组成要素或步骤等。
38.在本文的整个公开内容中，可以以范围格式提出与本发明相关的各个方面或条件。在本说明书中，对范围值的描述包括相应的边界值，即除非另有说明，包括所有高于下限值和低于上限值的值。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的陈述应被视为具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围的陈述(比如7至170)是指该范围内的各个数字，比如9、27、35、101和155，以及诸如10至127、23至35、80至100、50至169等子范围被认为是具体公开的。无论范围的宽度如何，这都适用。
39.在本发明中，术语“益生菌”定义为当适量给药时有益宿主健康的微生物。它们对人类健康的既定安全性和有益影响导致了益生菌作为药物的替代品或补充品的出现。益生菌的优点是副作用很少。
40.本发明人针对从婴儿粪便、泡菜和奶酪中分离的各种乳酸菌菌株，从各个方面筛选每种菌株的个体功效，此外，使用各种菌株以各种组合进行了各个方面的功效评价。结果，本发明人明确证实了当使用约氏乳杆菌idcc9203(kctc 10923bp)、植物乳杆菌idcc3501(kctc 13586bp)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(kctc 13587bp)三种菌株的组合时在抗炎功效方面的意想不到的协同作用，此外，还证实了在药理学方面对于炎症性肠病的显著治疗效果。具体而言，本发明的治疗效果优于已知的炎症性肠病治疗药物柳氮磺胺吡啶。考虑到即使在相同种类的细菌中益生菌特性也是菌株依赖性的，并且难以制备对于所有益生菌要求都表现出优异性能的组合物，本发明的三种类型的乳酸菌组合物和本
发明人证实的显著效果具有重大技术意义。此外，相比于v公司的以前在韩国仅被认为用于肠道免疫的8种类型的乳酸菌混合配制物，本发明的3种类型菌株混合物即使在较小的剂量下也显示出优异的治疗效果。
41.因此，本发明提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分，此外，本发明还提供一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其包含这三种菌株作为活性成分。
42.此外，本发明提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物或一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其由这三种菌株组成。
43.此外，本发明提供一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物或一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其基本上由这三种菌株组成。
44.优选地，本发明提供一种益生菌组合物，其包含(以有效量)约氏乳杆菌idcc9203菌株、植物乳杆菌idcc3501菌株和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301菌株，本发明还提供一种由这三种菌株(以有效量)组成的益生菌组合物，此外，本发明还提供一种基本上由这三种菌株(以有效量)组成的益生菌组合物。
45.在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其包含约氏乳杆菌idcc9203菌株、植物乳杆菌idcc3501菌株和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301菌株作为活性成分，此外，本发明还提供了一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其包含这三种菌株作为活性成分。
46.在另一实施方式中，本发明提供了一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其由约氏乳杆菌idcc9203菌株、植物乳杆菌idcc3501菌株和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301菌株组成，此外，本发明还提供了一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其由这三种菌株组成。
47.在另一实施方式中，本发明提供了一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物，其基本上由约氏乳杆菌idcc9203菌株、植物乳杆菌idcc3501菌株和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301菌株组成，此外，本发明还提供了一种用于预防或改善炎症性肠病的食品组合物，其基本上由这三种菌株组成。
48.如果“炎症性肠病”是本领域已知的以肠道中的炎症性病症为主要病理的疾病，则其类型没有特别限制，但是例如，它可以优选地选自克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠白塞病和缺血性肠炎。
49.本发明的组合物不限于此，而是可以配制成使得三种类型的乳酸菌(约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种)以混合物的形式存在于一个容器中，或者，这三种类型的乳酸菌均包装在单独的容器中，但可以配制成在使用时同时或顺序给药。
50.在一个实施方式中，本发明的三种类型的乳酸菌可以以混合物的形式提供，作为这种实施方式的实例，本发明提供了一种用于预防或治疗炎症性肠病的药物组合物(或用于预防或改善该疾病的食品组合物)，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
51.在本发明的组合物中，各菌株的集落形成单位(colony forming unit，cfu)的有效量可以由本领域技术人员根据需要(疾病预防、健康或治疗)或必要来确定，也可以根据最终配制物来确定。
52.例如，在本发明的三种菌株的活细胞或死细胞的食品或药物的生产中，每1g(或ml)的总组合物中可以添加1
×
105至1
×
10
15
个细菌(细菌数或cfu)，并且可以优选以1
×
106至1
×
10
13
的量添加，但不限于此。
53.此外，含有上述活细胞或其死细胞的组合物的日摄入量基于细胞总数为1
×
105至1
×
10
10
cfu/kg，优选为1
×
106至1
×
109cfu/kg，作为实例，其优选可以为1
×
106至1
×
109cfu/kg，并且摄入量可以每天摄入一次，或者可以分数次摄入，但不限于此。
54.在本发明的组合物中，提供三种类型的乳酸菌的相对比例(例如组合比例)没有特别限制，只要其在本发明中表现出期望的效果(抗炎效果或炎症性肠病预防/治疗/改善效果)即可。例如，约氏乳杆菌idcc9203、植物乳杆菌idcc3501和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301的组成比例为(基于cfu/g单位)1-100：1-100：1-100cfu/g(或cfu/ml)，优选其可以以基于cfu/g(或cfu/ml)单位的1至30：1至30：1至30的比例，更优选地，以基于cfu/g(或cfu/ml)单位的1至10：1至10：1至10的比例配制。
55.在一个实施方式中，约氏乳杆菌idcc9203、植物乳杆菌idcc3501和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301的组成比例为基于cfu/g(或cfu/ml)单位的1：7：2的比例。
56.在一个优选的实施方式中，这三种类型的乳酸菌的组成比例可以是基于cfu/g(或cfu/ml)单位的1：1：1的比例。
57.此外，在本发明中，这三种类型的乳酸菌可以分别以活细胞或死细胞的形式提供。
58.本领域中处理细菌以提供活制剂的方法是本领域公知的，如果细菌是活的形式，则提供它们的形式没有特别限制。例如，在培养菌株后，可以回收细胞团块，按原样使用，或通过所需手段处理，比如通过浓缩和/或冷冻干燥处理，以添加到药物或可食用产品的制造中。有时，益生菌配制物可以经过固定或封装过程以延长保质期。本领域已知有数种细菌固定或封装技术。
59.在本发明中，术语“死细胞”是指通过加热、加压、药物处理等灭菌的细胞。死细胞的制备方法没有特别限制，只要是通过本领域已知的乳酸菌杀灭方法即可，例如，本发明的死细胞可以通过包括热处理(通过热处理)的杀灭方法制备。热处理可以仅对从培养基中分离和获得的活细胞进行，或者可以对含有活细胞的培养基进行。热处理温度没有特别限制，只要保持细胞的性质并对其他一般细菌进行灭菌即可，其可以在80℃至150℃下进行，优选在80℃至110℃下进行。
60.热处理时间没有特别限制，只要本领域技术人员考虑到温度条件能够获得期望的制备质量即可，例如，可以进行5分钟至15分钟。
61.在产生死细胞的热处理过程中，本领域技术人员可以在不影响本发明的死细胞的固有功能的情况下在生产线中添加任何预处理或附加条件以提高生产效率。例如，可以在热处理之前将蒸馏水加入活细胞并与活细胞混合。
62.可以对死细胞进行任何用于制备死细胞制剂(配制物)的附加过程，例如，可以进行浓缩、干燥等。干燥方法没有特别限制，只要它是本领域中用于干燥乳酸菌的方法即可，但是可以是例如热(空气)干燥或冷冻干燥方法。
63.在另一实施方式中，本发明提供了一种用于抗炎的药物组合物或食品组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
64.优选地，本发明提供了一种用于抗炎的药物组合物或食品组合物，其包含约氏乳
杆菌idcc9203菌株、植物乳杆菌idcc3501菌株和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301菌株作为活性成分。
65.本发明的药物组合物可以仅包括上述三种类型乳酸菌的活细胞或死细胞，或可以另外包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在上文中，“药学上可接受的”是指生理上可接受的、当施用于人时不抑制活性成分的作用并且通常不引起过敏反应如胃肠道疾病、头晕或类似反应的无毒组合物。药学上可接受的载体还可以包括例如用于口服给药的载体或用于非肠道给药的载体。
66.用于口服给药的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。
67.本发明的药物组合物可以通过任何方法施用于哺乳动物包括人。例如，它可以口服或非肠道给药(例如涂抹方法等)。此外，本发明的药物组合物可以按照上述给药途径配制成口服给药或非肠道给药的制剂。
68.例如，在用于口服给药的配制物的情况下，本发明的组合物可以使用本领域已知的方法配制成冻干粉末、胶囊、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸、液体配制物、凝胶、糖浆、膏剂、混悬剂、薄片剂等。例如，口服制剂可以通过将活性成分与固体赋形剂混合，向其中加入合适的佐剂，然后将其加工成胶囊等来制得。合适的赋形剂的实例包括：糖类，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇等；淀粉，包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；填料如明胶、聚乙烯吡咯烷酮等。此外，本发明的药物组合物还可以包括抗聚集剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂和防腐剂等，但不限于此。
69.本发明的食品组合物包括常规意义上的所有食品，包括所有种类的功能食品、营养补充剂、健康食品和食品添加剂等。这种类型的食品组合物可以根据本领域已知的常规方法以各种形式制备。
70.本发明的食品组合物可以包括健康功能食品。本发明中使用的术语“健康功能食品”是指使用对人体有用的原料或成分以片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、液体配制物和丸剂的形式制造和加工的食品。这里，术语“功能”是指获得用于健康目的的有用效果，比如调节营养素或对人体结构和功能的生理效果。本发明的健康功能食品可以通过本领域中常用的方法制备，并且在制造时，可以通过添加本领域中常用的原料和组分来制备。
71.此外，如果健康功能食品的配制物也被认为是健康功能食品，则其可以无限制地制造。本发明的用于食品的组合物可以以各种形式制备，并且与一般药物不同，其优点在于，由于其使用食品作为原料，因此在长时间服用药物时不会出现副作用，并且其是便携式的，可以作为补充剂服用。
72.例如，作为健康功能食品，可以将本发明的三种类型的乳酸菌的活细菌或其死细胞包封或粒化然后摄取。此外，本发明的食品组合物可以含有各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂等。此外，它可以含有水果的果肉。这些组分可以独立使用或组合使用。虽然这些添加剂的比例不是非常重要，但相对于100重量份本发明的食品组合物，通常在0.01至0.3重量份的范围内选择，但不限于此。
73.此外，本发明的食品组合物可以含有各种调味剂或天然碳水化合物作为附加成分。碳水化合物包括单糖(如葡萄糖、果糖)、二糖(如麦芽糖、蔗糖)、多糖(如糊精和环糊精)
以及糖醇(如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇)。作为甜味剂，可以使用天然甜味剂(如索马甜和甜叶菊提取物)、合成甜味剂(如糖精和阿斯巴甜)等。天然碳水化合物的比例通常为每100ml本发明的组合物约0.01至0.04g，优选约0.02至0.03g，但不限于此。
74.本发明的食品组合物还可以以发酵食品的形式提供。本发明的三种类型的乳酸菌可以包含在各种可食用产品中，例如乳制品和酸奶、凝乳、奶酪(例如，夸克干酪、奶油、加工过的奶酪、软质和硬质奶酪)、发酵乳、奶粉、奶基发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、奶基配方奶粉)、饮料、调味料和宠物食品。如本文所使用的，“可食用产品”在本文中以其最广泛的意义使用，包括除药物产品和兽用产品以外，可以供动物消耗的以任何形式呈现的所有类型的产品。其他可食用产品的实例包括肉制品(例如肝酱、香肠、萨拉米香肠或肉酱)和巧克力酱、填料(例如松露、奶油)和糖霜、巧克力、糖果(例如焦糖、软糖或太妃糖)、烘焙食品(蛋糕、点心)、酱汁和汤类、果汁和咖啡奶油(调咖啡白油)。尤其受关注的可食用产品是膳食补充剂和婴儿配方。在本发明的一方面，膳食补充剂还包括已知为对人类健康具有药用效果的食用提取物的健营养品。供动物消耗的饲料也包括在本发明的范围内。本发明的组合物还可用作其它食品的组分。
75.此外，本发明提供了一种包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物用于制备预防或治疗炎症性肠病的配制物的用途。
76.此外，本发明提供了一种由这三种菌株作为活性成分组成的组合物用于制备预防或治疗炎症性肠病的配制物的用途，本发明提供了一种基本上由这三种菌株作为活性成分组成的组合物用于制备预防或治疗炎症性肠病的配制物的用途。
77.此外，本发明提供了一种治疗炎症性肠病的方法，包括向有需要的对象施用有效量的包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物。
78.此外，本发明提供了一种包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物用于制备抗炎剂的用途。
79.此外，本发明提供了一种由这三种菌株作为活性成分组成的组合物用于制备抗炎剂的用途。
80.本发明提供了一种基本上由这三种菌株作为活性成分组成的组合物用于制备抗炎剂的用途。
81.此外，本发明提供了一种抑制炎症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分的组合物。
82.本发明中的“抗炎”是指抑制分子和细胞炎症反应，如免疫细胞浸润、促炎细胞因子、前列腺素和一氧化氮(no)等促炎因子的分泌，预防、减轻或改善诸如红斑、角质化、皮肤厚度增加、发红、发热和疼痛等症状。
83.本发明的“炎症抑制”是指抑制分子和细胞炎症反应，如免疫细胞浸润、促炎细胞因子、前列腺素和一氧化氮(no)等促炎因子的分泌(如上述抗炎)，预防、减轻或改善诸如红斑、角质化化、皮肤厚度增加、发红、发热和疼痛等症状。
84.本发明的“有效量”是指当施用于对象时表现出改善、治疗、预防、检测、诊断或抑制或减少炎症和/或炎症性肠病的效果的量，“对象”可以是动物，优选动物包括哺乳动物，特别是人，并且可以是动物来源的细胞、组织、器官等。对象可以是需要该效果的患者。
85.本发明的“治疗”是指全面改善炎症和/或炎症性肠病或炎症和/或炎症性肠病的
症状，这可以包括治愈、基本上预防或改善炎症和/或炎症性肠病的状况，并且包括减轻、治愈或预防由该疾病引起的一种或大部分症状，但不限于此。
86.有益效果
87.本发明的包含三种类型乳酸菌的独特组合的组合物对炎症性肠病具有显著的预防和治疗效果，具体而言，该效果在药理学上优于已知的炎症性肠病治疗药物(例如柳氮磺胺吡啶)。此外，由于益生菌组合物的性质，本发明的组合物作为安全组合物具有很大的优势，且副作用风险很小。
附图说明
88.图1示出了通过分别处理约氏乳杆菌idcc9203(6号)、植物乳杆菌idcc3501(7号)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(14号)单独菌株、这三种类型乳酸菌的混合物(以mix表示)、相同的典型菌株混合物(约氏乳杆菌kctc 3801
t
、植物乳杆菌kctc 3108
t
、动物双歧杆菌乳酸亚种idcc kctc 3219
t
)比较对通过lps处理在raw264.7细胞中增加的tnf-α的抑制作用的结果(dex：地塞米松)。
89.图2示出了确定通过lps处理在raw264.7细胞中增加的il-6被本发明的三种乳酸菌制剂的处理抑制的结果。
90.图3示出了在将与本发明的组合物具有同类关系的典型菌株混合物(约氏乳杆菌kctc 3801
t
、植物乳杆菌kctc 3108
t
、动物双歧杆菌乳酸亚种idcc kctc 3219
t
)施用于lps处理的raw264.7细胞后确定il-6水平的变化程度的结果。
91.图4示出了证实通过lps处理在raw264.7细胞中增加的il-1β被本发明的三种乳酸菌制剂的处理抑制的结果。
92.图5示出了在将与本发明的组合物具有同类关系的典型菌株混合物(约氏乳杆菌kctc 3801
t
、植物乳杆菌kctc 3108
t
、动物双歧杆菌乳酸亚种idcc kctc 3219
t
)施用于lps处理的raw264.7细胞后确定il-1β水平的变化程度的结果。
93.图6示出了通过将各种单独的乳酸菌株(包括约氏乳杆菌idcc9203(6号)、植物乳杆菌idcc3501(7号)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(14号)菌株)施用于lps处理的raw264.7细胞来确定no(一氧化氮)抑制能力的结果。
94.图7示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌配制物施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时每个给药剂量的dai评分。
95.图8是在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时观察结肠长度的图像。
96.图9是在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂按每种剂量施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时测量结肠长度的结果。
97.图10是在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时结肠横截面的图像。
98.图11示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型并使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时结肠组织损伤的相对组织学评分。
99.图12示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂按每种剂量施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时测量结肠中tnf-α水平
的结果。
100.图13示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂按每种剂量施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时测量结肠中il-1β水平的结果。
101.图14示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂按每种剂量施用于动物结肠炎模型并且使用已知的治疗炎症性肠病的柳氮磺胺吡啶作为对照组时测量结肠中il-6水平的结果。
102.图15示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时的dai评分。
103.图16示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时观察结肠长度的图像。
104.图17示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时测量结肠长度的结果。
105.图18示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时结肠组织损伤的组织学评分。
106.图19示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时测量结肠中tnf-α水平的结果。
107.图20示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时测量结肠中il-1β水平的结果。
108.图21示出了在将本发明的三种类型的乳酸菌制剂或v公司的乳酸菌制剂施用于动物结肠炎模型时测量结肠中il-6水平的结果。
109.实施发明的方式
110.以下将对本发明进行详细描述。
111.然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的内容不限于以下实施例。
112.实施例1：发现菌株混合物的新组合
113.对于从婴儿粪便、泡菜和奶酪中分离的各种乳酸菌菌株，从各个方面筛选每种菌株的个体功效。此外，作为使用各种菌株以各种组合在各个方面进行功效评价的结果，本发明人证实了关于约氏乳杆菌idcc9203(从婴儿粪便中分离/登录号kctc 10923bp)、植物乳杆菌idcc3501(从泡菜中分离/登录号kctc 13586bp)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(从婴儿粪便中分离/登录号kctc 13587bp)三种菌株的组合在抗炎功效上意想不到的协同作用，并证实在炎症性肠病的药理学方面具有显著的实际治疗效果。下面给出的数据证明了本发明的三种乳酸菌制剂的菌株组合的意外发现。
114.实施例2：证实本发明的三种类型的乳酸菌制剂(混合物)的抗炎协同作用以及比较其菌株组合特异性
115.2-1.证实本发明的三种乳酸菌制剂(混合物)的组合物的特异性以及比较抗炎效果
116.约氏乳杆菌idcc9203(图1中的6号)、植物乳杆菌idcc3501(图1中的7号)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(图1中的14号)各自在37℃的mrs肉汤中培养2小时，然后10,000
×
g离心15分钟收集细胞。细胞用1
×
pbs缓冲液洗涤两次后，在100℃下加热10分钟杀灭样
品(加热灭活)，然后用于抗炎效果分析。三种类型的乳酸菌的死细胞混合物通过以1：1：1的比例的cfu标准混合每种死细胞菌株来制备。
117.使用相同种类的其它乳酸菌作为本发明的三种乳酸菌制剂(混合物)的组成菌株，以与本发明相同的方式制备各种混合物(即，相同种类但具有不同特定菌株的混合物)，并比较评价功效。作为代表性实施例，图1、图3和图5示出了本发明相同的典型菌株混合物(约氏乳杆菌kctc 3801
t
、植物乳杆菌kctc 3108
t
、动物双歧杆菌乳酸亚种idcc kctc 3219
t
)的实验结果。
118.使用含10％胎牛血清(fbs，美国科罗拉多州柯林斯堡的阿特拉斯(atlas)公司)和1％青霉素(美国密苏里州圣路易斯的sigma-aldrich公司)的无酚红杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem，美国马里兰州盖瑟斯堡的gibco-brl公司)在37℃和5％的co2条件下培养raw264.7细胞(即小鼠巨噬细胞)。
119.为了证实本发明的三种乳酸菌制剂(混合物)对炎性细胞因子产生的效果，使用刮刀或胰蛋白酶消化回收培养的raw264.7细胞，放入15ml的离心管中，并以500rpm的转速离心5分钟。除去上清液后，加入1ml完全培养基并重新悬浮，并计数每ml细胞数。向6孔板的每个孔中加入2ml稀释的细胞溶液，并过夜培养24小时。在吸取6孔板中每个孔中的培养基后，用pbs洗涤。分配2ml新培养基后，在所有孔中处理4ul的lps(最终lps浓度为2ul/ml)，在第一孔中，用20ul(最终浓度为10um/ml)处理1mm地塞米松作为阳性对照。pbs作为阴性对照处理，剩余的孔用lps处理，本发明的三种乳酸菌制剂以1
×
105至1
×
107个细胞/ml的浓度处理，然后过夜孵育24小时。将每个孔的培养液转移到15ml的离心管中，并以9,500rpm的转速离心5分钟。分别回收每个管中的上清液用于细胞因子实验。作为炎性细胞因子，用elisa试剂盒(r&d systems公司)证实是否能抑制tnf-α、il-6和il-1β的产生。
120.作为实验的结果，证实当处理本发明的三种类型的乳酸菌制剂(混合物)时，与单独使用构成其的单个菌株相比，炎性细胞因子产生抑制效果(即抗炎效果)显著提高。作为示出这一点的代表性实例，如图1所示，通过本发明的三种乳酸菌制剂的处理得到的tnf-α水平(如图1中的mix所示)显示出将水平降低到与地塞米松处理组相同水平的效果，并且证实与单独处理单个菌株时相比，降低效果显著提高。
121.此外，代表性地，如图1、图3和图5所示，当使用相同种类的其它菌株的混合物时，tnf-α、il-6、il-1β产生抑制效果显著低于使用本发明的三种类型的乳酸菌制剂(混合物)的情况，明显显示出剂量依赖性抗炎效果，特别是在1x107个细胞/ml给药组中，发现抗炎效果与地塞米松相当或相似(见图1、图2和图4)。
122.2-2.比较各组成菌株对no产生的抑制能力
123.作为对从婴儿粪便、泡菜和奶酪中分离的各种乳酸菌菌株在不同方面比较每种菌株的个体功效的结果，代表性地，图6示出了比较单个菌株抑制no(一氧化氮)产生的功效的实验结果，并且示出了包括本发明中使用的约氏乳杆菌idcc9203(图1和图6中的6号)、植物乳杆菌idcc3501(图1和图6中的7号)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(图1和图6中的14号)在内的若干代表性菌株的比较实验结果。
124.简言之，实验方法如下。通过上述一般培养方法培养各乳酸菌，在培养完成后，通过离心获得细胞，并通过在100℃下加热灭活15分钟来杀灭细胞。将raw264.7细胞(1
×
105/ml)在dmem中培养，用lps(2μl/ml)处理,加热灭活细胞(1
×
105个细胞/ml),然后孵育24小
时。根据制造商的方案，通过使用格利斯(griess)试剂(美国sigma公司)测量细胞培养上清液中亚硝酸盐的量来研究no的浓度。将从如上处理并孵育24小时的raw264.7细胞培养基中获得的150μl细胞培养上清液与150μl的格利斯试剂混合后，1,000
×
g离心10分钟，然后室温下孵育10分钟。使用酶标仪在595nm处测量吸光度，并且基于通过亚硝酸钠形成的校准曲线来比较吸光度。
125.本发明的成分约氏乳杆菌idcc9203(图1和图6中的6号)、植物乳杆菌idcc3501(图1和图6中的7号)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(图1和图6中的14号)对no产生的抑制能力显著优于其它乳酸菌菌株(参见图6)。
126.实施例3.证实本发明的三种乳酸菌益生菌制剂的体内炎症性肠病疗效&与治疗炎症性肠病的化合物柳氮磺胺吡啶比较疗效
127.实验方法
128.1)制备本发明的三种乳酸菌益生菌制剂
129.通过以cfu(集落形成单位)标准1：1：1的比例混合约氏乳杆菌idcc9203(kctc 10923bp)、植物乳杆菌idcc3501(kctc 13586bp)和动物双歧杆菌乳酸亚种idcc4301(kctc 13587bp)三种活菌株来制备实验中使用的本发明的三种乳酸菌益生菌制剂。每种活菌株含有2x1012cfu/g。每种细菌在37℃下在生长培养基中培养16小时直到指数期，然后将细菌团块储存在冷冻干燥机中冷冻干燥(真空下-80℃条件，过夜)。将本发明的冻干的三种乳酸菌制剂在4℃下储存直至使用。
130.2)实验动物
131.雌性balb/c小鼠(8周龄)购自orient bio公司(韩国城南市)。将每个笼子5只动物关在环境控制设施中(温度22℃
±
2℃，湿度55％
±
5％)，光暗循环为12/12小时。
132.动物护理和处理按照美国国立卫生研究院动物研究与护理制定的指南进行，并经日东制药株式会社(ildong pharmaceutical co.,ltd.)的动物实验伦理委员会(机构动物护理和使用委员会，批准号：a1611-2)批准。
133.3)小鼠结肠炎模型
134.在本研究中使用由dss(分子量36-50kda/美国加利福尼亚州圣安娜的mp biochemicals公司)诱导的小鼠结肠炎模型。经过7天的适应期后，如表1所示，将小鼠分成7组(每组10只小鼠)，同样地调整初始体重(bw)的平均值。将dss以3.5％(w/v)的浓度溶解在饮用水中，从第0天到第8天供应给除正常对照组外的所有小鼠。动物自由取水和取食。
135.载体对照组小鼠口服200μl蒸馏水(dw)。本发明的三种乳酸菌制剂的剂量范围为106cfu/小鼠/天至109cfu/小鼠/天，而作为阳性对照的柳氮磺胺吡啶(日本东京的东京化成工业株式会社(tokyo chemical industry))浓度为500mg/kg(bw)/天，悬浮于蒸馏水中后，以与载体对照组相同的体积和相同的方式给药。下表1汇结了各实验组和对照组的材料处理条件。
136.表1
[0137][0138]
bw：体重；cfu：集落形成单位；dss：葡聚糖硫酸钠；dw：蒸馏水
[0139]
对每只小鼠每天观察一次bw(体重)和粪便状态，并且按照之前已知的方法，根据下表2中描述的标准计算dai(疾病活动指数)评分。根据下面的表2可以计算出的最大值是12。在用二氧化碳气体安乐死后，取出从回盲部到肛门的大肠(结肠)并测量其长度，并用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤以除去肠残余物。远端结肠的三分之一用10％甲醛溶液固定并用于组织病理学分析。其余三分之二的远端结肠组织用于蛋白质提取，以测量促炎细胞因子水平，并在-80℃下储存直至使用。
[0140]
表2
[0141][0142][0143]
4)组织学分析
[0144]
结肠组织用10％中性甲醛缓冲溶液固定，石蜡包埋按常规方法进行。将石蜡包埋的组织切片切成4μm的厚度并用苏木精&伊红(h&e)染色。使用尼康eclipse 50i光学显微镜(日本东京尼康公司)在100x和200x放大倍数下观察h&e染色的结肠组织，如表3(组织学评分系统)中所述，由两名病理学家根据众所周知的参数进行组织学评估。根据表3，通过将三个参数中的每一个相加计算得出的评分最大值为10。
[0145]
表3
[0146][0147]
5)测量结肠促炎细胞因子水平
[0148]
使用添加有蛋白酶抑制剂(美国密苏里州圣路易斯的sigma-aldrich公司)的ripa缓冲液(美国加利福尼亚州特曼库拉的upstate公司)提取结肠蛋白。在结肠组织中加入300μl的ripa缓冲液后，将组织在冰上匀浆1分钟，并在4℃下20,000g离心15分钟。收集上清液后，使用二喹啉甲酸(bca)法蛋白质定量试剂盒(美国伊利诺伊州罗克福德的pierce公司)进行定量。根据制造商的方案使用elisa试剂盒(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的r&d systems公司)来检测结肠组织中诸如tnf-a、il-1b和il-6等促炎细胞因子的水平。针对每种结肠蛋白样品的总量校正每种细胞因子值。
[0149]
6)统计分析
[0150]
结果表示为均值
±
标准误差，并且使用统计分析系统prism 7(美国加利福尼亚州圣迭戈的graphpad software公司)处理每个结果。所有结果代表至少三个独立实验的平均值。通过单向方差分析和随后的邓奈特检验(dunnett's test)进行载体对照组和每个处理组之间的统计比较。认为p值《0.05具有统计学意义。
[0151]
实验结果
[0152]
3-1.本发明的3种类型的乳酸菌制剂对体内结肠炎症状的影响
[0153]
为了确定结肠炎的严重程度，每天观察每只小鼠的bw和排便状态一次，并记录dai评分。随着给小鼠提供dss量的增加，血便和腹泻的发生率增加，而体重(bw)逐渐降低。在载体对照组中，从实验的第4天起，dai评分显示稳定地上升。本发明的三种乳酸菌制剂的给药剂量依赖性地降低了dai评分(参见图7)，具有防止体重减轻、改善排泄物外观、改善血便的作用。以108cfu/小鼠/天或109cfu/小鼠/天的剂量施用本发明的三种乳酸菌制剂的组的dai评分与柳氮磺胺吡啶给药组的dai评分相似。
[0154]
在结肠炎诱导的小鼠中，结肠的长度比正常对照组短。这种结肠长度缩短的症状通过本发明的三种乳酸菌制剂以剂量依赖性方式得到预防，并且在本发明的三种乳酸菌制剂的108cfu/小鼠/天或109cfu/小鼠/天剂量给药组与柳氮磺胺吡啶给药组之间显示出等同的作用模式(参见图8和9)。
[0155]
3-2.本发明的3种类型的乳酸菌制剂对结肠组织学参数的影响
[0156]
为了评估dss诱导的结肠炎的组织学损伤严重程度，用显微镜观察h&e染色的结肠组织，并测量组织学评分。如图10和图11所示，在载体对照组中观察到炎症细胞浸润在粘膜和粘膜下层组织中，严重的肠隐窝损伤，以及杯状细胞和上皮细胞的消亡。而且，组织学评分提高到7.2
±
0.6。另一方面，柳氮磺胺吡啶给药组的组织学评分急剧下降。在用本发明的三种乳酸菌制剂处理的组中，组织学评分以剂量依赖性方式降低。具体而言，本发明的三种乳酸菌制剂的108cfu/小鼠/天给药组和109cfu/小鼠/天给药组结肠损伤的组织学评分显著降低(分别为5.2
±
0.5和4.9
±
0.6)，这与柳氮磺胺吡啶给药组(4.5
±
0.5)的相似。
[0157]
3-3.本发明的三种乳酸菌制剂对结肠中促炎细胞因子表达的影响
[0158]
为了检测与炎症反应相关联的结肠细胞因子的水平，进行酶联免疫吸附试验(elisa)。代表性地研究了tnf-α、il-1β和il-6三种促炎细胞因子的表达模式，已知它们在结肠炎的病理过程中起着重要作用。如图12、图13和图14所示，尽管每种细胞因子的表达水平在结肠炎病理过程中提高，但通过施用本发明的三种乳酸菌制剂以剂量依赖性方式降低。即使与用作阳性对照的柳氮磺胺吡啶给药组相比，本发明的三种乳酸菌制剂的109cfu/小鼠/天给药组也显示出类似的抑制效果。
[0159]
实施例4：比较评价批准用于炎症性肠病的现有商用益生菌产品和本发明的三种类型的乳酸菌制剂的炎症性肠病疗效
[0160]
实验方法
[0161]
使用v公司的乳酸菌制剂(目前是韩国第一个也是唯一的已被食品和药物安全部单独确认为“通过调节肠道免疫有助于肠道健康”的益生菌产品)与本发明的三种益生菌制剂(混合物)比较改善炎症性肠病的效果。已知v公司的乳酸菌制剂在一个小袋(4.5
×
10
11
个细菌/包)中由总共约4500亿活菌组成，具体而言，已知由副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)dsm 24734、植物乳杆菌dsm 24730、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)dsm 24735、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)dsm 24734、长双歧杆菌(bipidobacterium longum)dsm 24736、短双歧杆菌(bipidobacterium breve)dsm 24732、婴儿双歧杆菌(bipidobacterium infantis)dsm 24737、唾液链球菌嗜热亚种(streptococcus salivarius subsp.thermophilus)dsm 24731这8种类型的活菌菌株混合而成。
[0162]
试验组组成如下表4所示进行，此时，实验典型地使用上文描述为本发明的三种类型乳酸菌基于cfu的1：1：1的比例的活细胞混合物的三种菌株。除了下表4中所述的条件之外，其余的实验方法以与实施例3中相同的方式进行。
[0163]
表4
[0164][0165][0166]
实验结果
[0167]
4-1.比较对体内结肠炎症状的影响
[0168]
如图15所示，实验结果，在施用本发明的三种乳酸菌制剂和v公司乳酸菌制剂的组中显示了防止体重减轻、改善排泄物外观和改善血便的效果，因此，dai评分降低。具体而言，当比较本发明的三种类型的乳酸菌制剂的108cfu给药组时，尽管与v公司乳酸菌制剂5.4
×
108cfu给药组相比以较低的cfu剂量给药，但dai评分降低到与v公司乳酸菌制剂相比相同的水平。
[0169]
此外，如图16和图17所示，证实了本发明的三种类型的乳酸菌制剂具有显著的预防或改善由结肠炎引起的结肠长度缩短的效果。
[0170]
4-2.比较结肠组织学参数
[0171]
代表性地，如图18所示，在载体对照组中，观察到粘膜和粘膜下层组织中炎性细胞的浸润、严重的肠隐窝损伤以及杯状细胞和上皮细胞的消亡，而在用本发明的三种类型的乳酸菌制剂处理的组和用v公司乳酸菌制剂给药的组中，结肠损伤的组织学评分降低，显示出修复结肠组织的效果。具体而言，当比较本发明的三种类型的乳酸菌制剂108cfu给药组时，尽管与v公司乳酸菌制剂5.4
×
108cfu给药组相比以较低的cfu剂量给药，但与v公司乳酸菌相比，其显示出相同水平的结肠损伤预防或/和治疗效果。
[0172]
4-3.比较对结肠组织中促炎细胞因子表达的影响
[0173]
代表性地，如图19、图20和图21所示，进行elisa检测与炎症反应相关的结肠细胞因子水平，证实了用本发明的三种乳酸菌制剂处理的组和用v公司乳酸菌制剂给药的组在结肠炎病理过程中tnf-α、il-1β和il-6的促炎细胞因子的增加表达显著降低。具体而言，当比较本发明的三种类型的乳酸菌制剂108cfu给药组时，尽管与v公司乳酸菌制剂5.4
×
108cfu给药组相比以较低的cfu剂量给药，但与v公司的乳酸菌相比，其显示出相同水平的结肠损伤预防或/和治疗效果。
[0174]
工业实用性
[0175]
如上所述，本发明涉及一种用于调节肠道免疫的新型益生菌组合物，更具体而言，涉及一种用于抑制炎症和/或预防、改善或治疗炎症性肠病的组合物，其包含约氏乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种作为活性成分。
[0176]
包含本发明三种类型的乳酸菌的独特组合的组合物对炎症性肠病具有显著的预防和治疗效果，具体而言，这些效果在药理学上优于已知的炎症性肠病治疗药物(例如柳氮磺胺吡啶)。此外，由于本发明的组合物是益生菌组合物，因此其作为安全组合物具有很大的优势，且副作用风险很小，因此具有较高的工业实用性。
[0177]
【登录号】
[0178]
保存机构名称：韩国生命工学研究院
[0179]
登录号：kctc10923bp
[0180]
保存日期：2006.03.15
[0181]
保存机构名称：韩国生命工学研究院
[0182]
登录号：kctc13586bp
[0183]
保存日期：2018.07.17
[0184]
保存机构名称：韩国生命工学研究院
[0185]
登录号：kctc13587bp
[0186]
保存日期：2018.07.17