佛手柑内酯在制备治疗结直肠癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及佛手柑内酯在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

背景技术：

近年来结直肠癌(crc)发病率和死亡率均呈上升趋势，特别是近四分之一的患者在初诊时已发生转移，其中一半的患者最终发展成为不能切除的转移癌。对于这部分患者，基于5-氟尿嘧啶(5-fu)、奥沙利铂(l-ohp)和伊立替康(irinotecan)的化疗是其主要的治疗方式。

目前，5-fu的单药有效率仅为12％，l-ohp单药有效率为12％，irinotecan的单药有效率为18％，也就是说crc患者存在对化疗药物的耐药性。长期以来本研究团队一直从事crc的耐药及免疫病理机制研究，本研究团队发现eb病毒诱导基因3(ebi3)介导的stat3信号通路参与了crc细胞对卡铂(carboplatin)和5-fu的耐药过程，提示ebi3可作为crc细胞5-fu化疗增敏的一个有效靶点。中药是一个巨大的药物分子宝库，寻找、筛选安全有效的靶向调节ebi3的药物是本发明的研究重点。因此，提供佛手柑内酯在制备治疗结直肠癌药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了佛手柑内酯在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

佛手柑内酯在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

进一步，佛手柑内酯在制备增强结直肠癌对5-fu化疗敏感性药物中的应用。

进一步，佛手柑内酯联合ebi3阻断肽在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

佛手柑内酯(bergapten，bg)，是一种呋喃香豆素类天然产物，又称5-甲氧基补骨脂素。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了佛手柑内酯在制备治疗结直肠癌药物中的应用，本发明通过在人结直肠癌sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu中给与不同浓度的佛手柑内酯进行干预，观察佛手柑内酯对人结直肠癌细胞5-fu耐药性和对ebi3/stat3信号通路的影响，为佛手柑内酯作为抗肿瘤药物用于肝癌的治疗提供实验依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明bg对crc细胞(sw1116、lovo)耐药性的影响；

图2附图为本发明bg对crc细胞(sw1116/5-fu和lovo/5-fu)耐药性的影响；

图3附图为本发明westernblot检测bcl-2、bax表达情况；

图4附图为本发明bcl-2和bax在sw1116/5-fu细胞中的相对表达量；*：与对照组(0μmol/lbg)比较，*:p<0.05；**:p<0.01；

图5附图为本发明bcl-2和bax在lovo/5-fu细胞中的相对表达量；*：与对照组(0μmol/lbg)比较，*:p<0.05；**:p<0.01；

图6附图为本发明westernblot检测cypib1、mekk2表达情况；

图7附图为本发明cypib1和mekk2在sw1116/5-fu细胞中的相对表达量；*：与对照组(0μmol/lbg)比较，*:p<0.05；**:p<0.01；

图8附图为本发明cypib1和mekk2在lovo/5-fu细胞中的相对表达量；*：与对照组(0μmol/lbg)比较，*:p<0.05；**:p<0.01；

图9附图为本发明westernblot检测crc细胞ebi3、stat3和p-stat3表达情况；

图10附图为本发明ebi3、stat3和p-stat3在sw1116/5-fu细胞中的相对表达量；*：与对照组(0μmol/lbg)比较，*:p<0.05；**:p<0.01；

图11附图为本发明ebi3、stat3和p-stat3在lovo/5-fu细胞中的相对表达量；*：与对照组(0μmol/lbg)比较，*:p<0.05；**:p<0.01。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

人结直肠癌sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞株、ebi3阻断肽(sc-26797p，santacruz公司)由广东医科大学东莞市医学活性分子开发与转化重点实验室惠赠。其中，sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞株是实验室建立的能在6.0mg/l的5-fu中稳定生长的细胞系。ripa裂解液(强)、青霉素-链霉素溶液(100×)、bca蛋白浓度检测试剂盒(增强型)和cck-8试剂盒购自碧云天生物公司；dmem完全培养基、胎牛血清(fbs)和胰蛋白酶(0.25％)购自美国gibco公司；氟尿嘧啶(5-fu)购自sigma公司；bcl-2、bax、ebi3、stat3、p-stat3、cypib1和mekk2抗体购自santacruz公司。

实施例1细胞耐药性检测

分别将1×10³个sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞接种于96孔板，37℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养48h后；分别将不同浓度佛手柑内酯(0μmol/l、1μmol/l、10μmol/l和100μmol/l)作用于以上细胞48h后；然后将sw1116和lovo细胞用不同浓度5-fu(0mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l和8mg/l)的dmem完全培养液持续培养48h，将sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞用不同浓度5-fu(0mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l和80mg/l)的dmem完全培养液持续培养48h。然后采用cck-8试剂盒和酶标仪检测450nm处的最佳吸光度值，并计算ic50值评价细胞耐药性。

采用graphpadprism5.0软件进行统计学分析，采用正态概率转化法计算ic50值，imagej软件进行图片条带灰度值分析。以上每次实验均重复三次，所得数据以均数±标准方差表示，两组间比较采用t检验，检验水准α＝0.05，以p<0.05为差异具有统计学意义。

bg对crc细胞(非耐药细胞：sw1116、lovo)耐药性的影响结果见图1；图1结果显示，随着bg作用浓度的增加，5-fu在非耐药的sw1116细胞的ic50值由原来的(1.55±0.21)mg/l下降到(0.75±0.14)mg/l，在lovo细胞的ic50值由原来的(1.78±0.26)mg/l下降到(0.66±0.16)mg/l，差异均有统计学意义(t＝3.170,p<0.05；t＝3.669,p<0.05)。

bg对crc细胞(耐药细胞：sw1116/5-fu和lovo/5-fu)耐药性的影响结果见图2；图2结果显示，随着bg作用浓度的增加，5-fu在耐药的sw1116/5-fu细胞的ic50值由原来的(22.4±3.17)mg/l下降到(5.17±1.33)mg/l，在lovo/5-fu细胞的ic50值由原来的(36.2±5.12)mg/l下降到(8.3±3.45)mg/l，差异均有统计学意义(t＝5.012,p<0.01；t＝4.519,p<0.05)。

图1-图2结果表明，bg能有效增加结直肠癌细胞(sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu)对化疗药物5-fu的敏感性。

实施例2westernblot检测

1×10⁵个sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞接种于6孔板，37℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养24h后，将不同浓度佛手柑内酯(1μmol/l、10μmol/l和100μmol/l)作用于以上细胞48h后，经pbs洗涤，加入适量ripa裂解液，置于冰上裂解后提取总蛋白质并采用bca蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白质浓度。采用10％sds-page凝胶电泳(120v，1h)分离蛋白质，pvdf膜转膜(90v，2h)后，10％脱脂牛奶封闭1h。然后，分别采用bcl-2(1:200)、bax(1:200)、ebi3(1:200)、stat3(1:100)、p-stat3(1:100)、cypib1(1:200)和mekk2(1:200)摇床孵育过夜，以β-actin作为内参。tbst洗涤后辣根过氧化物酶标记二抗(goatantimouseigg-hrp)(1：1000)室温孵育2h，tbst洗膜三次，最后采用ecl显色液显色，化学发光成像系统(chemidocxrs)拍照。

westernblot检测细胞凋亡相关蛋白质(bcl-2、bax)表达情况，结果见图3。bcl-2和bax在sw1116/5-fu细胞中的相对表达量结果见图4，结果显示，随着bg作用浓度的增加，bcl-2相对表达量显著降低，bax相对表达量显著增加。bcl-2和bax在lovo/5-fu细胞中的相对表达量结果见图5，结果显示，随着bg作用浓度的增加，bcl-2相对表达量显著降低，bax相对表达量显著增加。以上结果说明bg能有效促进结直肠癌耐药细胞株发生凋亡。

westernblot检测5-fu耐药相关蛋白质(cypib1、mekk2)表达情况，结果见图6。cypib1和mekk2在sw1116/5-fu细胞中的相对表达量结果见图7，结果显示，随着bg作用浓度的增加，cypib1和mekk2相对表达量显著降低。cypib1和mekk2在lovo/5-fu细胞中的相对表达量结果见图8，结果显示，随着bg作用浓度的增加，cypib1和mekk2相对表达量显著降低。以上结果说明bg能有效抑制结直肠癌细胞中介导5-fu耐药的cypib1和mekk2蛋白质的表达。

westernblot检测crc细胞ebi3、stat3和p-stat3表达情况，结果见图9。ebi3、stat3和p-stat3在sw1116/5-fu细胞中的相对表达量结果见图10，结果显示，随着bg作用浓度的增加，ebi3、stat3和p-stat3相对表达量显著降低。ebi3、stat3和p-stat3在lovo/5-fu细胞中的相对表达量结果见图11，结果显示，随着bg作用浓度的增加，ebi3、stat3和p-stat3相对表达量显著降低。以上结果说明bg能有效抑制结直肠癌细胞ebi3/stat3信号通路的活性。

实施例3佛手柑内酯联合ebi3阻断肽对crc细胞耐药性的影响

分别将1×10³个sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞接种于96孔板，37℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养48h后，进行分组：对照组仅用dmem完全培养液培养；ebi3bp组用含1μg/mlebi3阻断肽的dmem完全培养液培养；bg组用含10μmol/l佛手柑内酯的dmem完全培养液培养；bg联合ebi3bp组用含1μg/mlebi3阻断肽和10μmol/l佛手柑内脂的dmem完全培养液培养。然后将sw1116和lovo细胞用不同浓度5-fu(0mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l和8mg/l)的dmem完全培养液持续培养48h，将sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞用不同浓度5-fu(0mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l和80mg/l)的dmem完全培养液持续培养48h。然后采用cck-8试剂盒和酶标仪检测450nm处的最佳吸光度值，并计算ic50值评价细胞耐药性。

佛手柑内酯(bg)联合ebi3阻断肽(ebi3bp)对sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞耐药性的影响，结果见表1。

表1bg联合ebi3bp对crc细胞耐药性的影响[ic50(mg/l)]

注：*：与对照组比较，p<0.05；#：与ebi3bp组比较，p<0.05；&：与bg组比较，p<0.05。

表1结果显示，bg组sw1116、sw1116/5-fu、lovo和lovo/5-fu细胞5-fu的ic50值低于对照组(p<0.05)；bg联合ebi3bp组5-fu的ic50值分别低于对照组、ebi3bp组和bg组，差异均有统计学意义(p<0.05)。结果显示ebi3信号阻断肽联合佛手柑内酯能显著增加sw1116、lovo、sw1116/5-fu和lovo/5-fu细胞对5-fu化疗敏感性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。