一种利用自体脂肪干细胞辅助脂肪填充的臀部整形方法与流程

本发明涉及自体脂肪干细胞应用领域，尤其是涉及一种利用自体脂肪干细胞辅助脂肪填充的臀部整形方法。

背景技术：

臀部是我们展现自己青春和性感的部位，一个好的臀部形态就像自己的微笑一样，相反肥大、扁平而下坠的臀部慢慢地成为了人们老化的特征，目前针对臀部的美容方法主要包括非注射法和注射法两种。非注射法主要以系统性的长期的身体锻炼为主，同时需要注意饮食和作息，见效缓慢。如今，越来越多的想要快速获得美化臀部效果的女性们开始选择注射的方法，人体臀部肌肉浅层为阔筋膜张肌、臀大肌，中层自上而下有臀中肌、梨状肌、上孖肌等，深层有臀小肌和闭孔外肌，该区域的血管供应来源于臀上动脉和臀下动脉。臀上动脉与臀上神经通过梨状肌上方的坐骨大孔离开盆腔，分为浅支和深支。浅支进入臀大肌深部，深支位于臀中肌和臀小肌之间。臀下动脉与臀下神经通过梨状肌下的坐骨大孔从盆腔流出，向下通过臀区进入大腿后部。在对臀部进行注射操作时，有一个概念叫危险三角形。三角形的顶点是髂后上棘，下外侧点是股骨大转子，下内侧点是坐骨结节，在三角形内的为臀部大血管和坐骨神经的分布区域，虽然也有人提到更小的危险三角形，但为了臀部脂肪移植的安全性，nathaniel等人建议使用这个更大、更安全三角形区域，在这个区域的脂肪注射最深区域仅能注射至肌肉表面，与假体丰臀注射相比，自体脂肪充填丰臀注射具有更大的优势：自体脂肪充填用自身脂肪做丰臀填充物，而该材料对自身身体是无害的，不会产生排斥或免疫反应，对术后生育、工作和生活并不会有什么影响，同时丰臀后手感真实，柔软，圆润。自体脂肪充填丰臀注射在丰臀的同时，需要对腹部、腿部等脂肪过多的地方进行抽脂，使丰臀和减肥一并完成，一举两得。但是，自体脂肪移植后存在不同程度的脂肪细胞吸收的情况，根据临床观察发现就医者的年龄、移植部位、移植体积及个体差异等因素的影响，移植后的脂肪细胞吸收率达到40~60%，因此，如何减少移植后的脂肪细胞吸收，提高自体脂肪移植后的脂肪细胞成活率，成为提高臀部脂肪充填注射效果的关键。

移植的脂肪成活的关键是通过和受体部位建立的血液供应。有研究发现仅在血管化组织的边缘2mm内的脂肪移植物可以通过吸收血浆存活，因为这些脂肪移植物可以接触受体组织，重建血液供应。所以，在多个组织通道和不同平面内，每次以最小的量注射，通过这种方式，将脂肪移植物与受体部位的最大化接触，可以确保移植后血液循环的建立。2001年研究人员首次从人脂肪组织抽吸物中获取了大量成纤维样细胞群，体外培养发现其具有多向分化潜能及自我复制更新能力，符合干细胞特性，将其命名为脂肪干细胞(adipose—derivedstemcells，adscs)。在临床实验上，脂肪干细胞的首次临床应用是在2004年，主要是用于组织修复和再生研究方面。有研究表明adscs细胞可能通过以下几种机制，提高移植脂肪细胞的存活率：其一为adscs细胞可以直接分化成为脂肪细胞，有助于脂肪组织的再生；其二为adscs细胞可以分化成血管内皮细胞和血管壁细胞，促进脂肪组织内的血管再生，有助于移植脂肪组织的存活；其三为adscs细胞在缺氧刺激下可以分泌vegf、hgf和igf．1等细胞因子，促进血管的形成和脂肪细胞周围微环境的重建；其四为adscs细胞可以分裂产生更多的adscs细胞，以发挥上述作用。

技术实现要素：

针对现有利用自体脂肪进行臀部填充移植后存在一定程度的吸收率，脂肪细胞的存活率低的问题，本发明提供一种利用自体脂肪干细胞辅助脂肪填充的臀部整形方法，其主要包括自体脂肪的提取、adscs细胞的提取与浓缩及填充脂肪细胞的提取，所述自体脂肪的提取可根据实验者主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并进行标记，所述adscs细胞的提取与浓缩主要分为以下步骤：

步骤一、将抽取的脂肪组织先经无菌pbs液洗涤，去除红细胞和细胞碎片后通过冷冻离心机进行离心作业，而后去除上层液体，在脂肪组织内加入含胶原酶的无菌pbs液，并在摇床内充分混匀；

步骤二、将上一步骤中充分混均的液体经冰冻离心机离心后弃去上清，加入的生理盐水终止胶原酶的消化，并将下层的漂浮物通过冰冻离心机离心；

步骤三、将上一步骤中离心后的液体弃去上清后，以生理盐水重悬下层沉淀，并通过筛网过滤器滤掉破碎的细胞；

步骤四、将上一步骤中的滤过液再经冰冻离心机离心和重悬，得到脂肪干细胞悬液；

步骤五、将上一步骤中得到脂肪干细胞接种于培养皿内，置于培养箱内孵育，第二天换液，之后每天观察，每3天换液一次；

所述的填充脂肪细胞的提取包括如下步骤：

步骤i、通过注射器将吸出来脂肪液连同注射器放入生理盐水中直立静置，此时，混合液分为三层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；

步骤ii、然后将上步骤中的混合液取出排去底层液体，把中、上两层脂肪液及脂肪颗粒转移至离心管内，放入冷冻离心机进行离心作业，离心后离心管内呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪，底层为淡红色肿胀液，移除下层液体所得即为移植用脂肪细胞；

进一步的，在上述步骤中所得的脂肪干细胞可以继续传代扩增培养，以期能够得到足够的脂肪干细胞，也可以冷冻保存，留待二次注射使用；

进一步的，在上述步骤一中，抽取的脂肪组织先经无菌pbs液洗涤，去除红细胞和细胞碎片后通过冰冻离心机300g离心3min，去除上层液体。在100ml脂肪组织内加入含o．075％i型胶原酶的无菌pbs液80ml，在37℃下摇床内200rpm充分混匀30min；

进一步的，在上述步骤二中，充分混均的液体经冰冻离心机离心后弃去上清，加入的生理盐水终止胶原酶的消化，并将下层的漂浮物通过冰冻离心机离心500g下离心10min；

进一步的，在上述步骤三中，离心后的液体弃去上清后，以生理盐水重悬下层沉淀，并通过孔径100μm筛网过滤器滤掉破碎的细胞；

进一步的，在上述步骤四中，滤过液再经500g离心和重悬2次，得到5ml脂肪干细胞adscs悬液；

进一步的，在上述步骤五中，将得到脂肪干细胞adscs接种于培养皿内，置于37℃，5％c02培养箱内孵育，第二天换液，之后每天观察，每3天换液一次；

进一步的，上述自体脂肪的提取过程为：在常规供区肿胀麻醉，用0.9％生理盐水500ml，2％盐酸利多卡因40ml，肾上腺素1ml配成局麻肿胀液，在标记抽吸部位做3～5mm皮肤切口，将一只手放在抽吸部位皮肤表面，可感觉到针的定位及肿胀程度，在标记供区范围内均匀注射至肿胀发白，皮肤有“橘皮样”外观为止。结束注射后，应轻按摩术区至肿胀液扩散均匀。麻醉成功后，用吸脂针沿切口插入皮下脂肪组织，吸脂针呈扇形均匀抽取深层脂肪共计400ml左右；

本发明的有益效果为：本发明通过一种创造型的脂肪干细胞细胞辅助脂肪移植的方法，提高了臀部移植脂肪细胞的存活率，有效提高了臀部填充后就医者的满意度，减少其并发症及后遗症的发病率，在具体操作时可抽取实验者自身脂肪，通过细胞成分结合释放（在体外提取adscs以及乳糜脂肪细胞），而后进行臀部填充，从而达到填充的效果，通过本发明所提供的方法，脂肪细胞存活效果好，并发症较少，而且，本发明工艺简单，满足了人们的使用需求，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1是两组实验者临床资料对比表；

图2是两组实验者满意度对比表；

图3是两组实验者注射使用后臀围保持情况统计表。

具体实施方式

需要说明的是，本发明申请的目的是提供一种以非治疗为目的自体脂肪的提取、adscs细胞的提取与浓缩及填充脂肪细胞的提取的方法，本发明自始至终不属于人体的诊断治疗方法，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是：本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“1.5～2.5”表示本文中已经全部列出了“1.5～2.5”之间的全部实数，“1.5～2.5”只是这些数值组合的缩略表示。本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

具体实施例1：为了解决由于自体脂肪移植后存在一定程度的吸收率，临床观察在报批临床委员会和与就医者签署知情及免责协议后本发明将此方法应用于实验者，结果发现本发明所提供的adscs辅助脂肪细胞移植方法，能够有效提高脂肪移植后的成活率，能够有效的提高臀部整形效果，提高实验者的满意度，其具体实施步骤如下：

一．自源adscs与脂肪细胞的获取

1.1.自体脂肪的提取：可根据实验者主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并标记抽取脂肪的范围。具体操作如下：在常规的标记供区肿胀麻醉，用0.9％生理盐水500ml，2％盐酸利多卡因40ml，肾上腺素1ml配成局麻肿胀液，在标记抽吸部位做3～5mm皮肤切口，将一只手放在抽吸部位皮肤表面，可感觉到针的定位及肿胀程度，在标记供区范围内均匀注射至肿胀发白，皮肤有“橘皮样”外观为止。结束注射后，应轻按摩术区至肿胀液扩散均匀。麻醉成功后，用吸脂针沿切口插入皮下脂肪组织，吸脂针呈扇形均匀抽取深层脂肪共计400ml左右；

1.2.adscs的提取与浓缩：此步骤共分为6个步骤，具体操作如下：

①抽取的脂肪组织先经无菌pbs液洗涤，去除红细胞和细胞碎片后，在离心机中300g离心3min，去除上层液体，并在100ml脂肪组织内加入含0．075％i型胶原酶的无菌pbs液80ml，在37℃下摇床内200rpm充分混匀30min

②离心后弃去上清，加入等量的生理盐水终止胶原酶的消化，将下层的漂浮物通过离心机在500g下离心10min；

③弃去上清后，以生理盐水重悬下层沉淀，并通过孔径100μm的筛网过滤器滤掉破碎的细胞；

④滤过液再经500g离心和重悬2次，得到5mladscs悬液；

⑤将得到脂肪干细胞接种于培养皿内，置于37℃，5％c02培养箱内孵育，第二天换液，之后每天观察，每3天换液一次；

⑥所得的脂肪干细胞可以继续传代扩增培养，以期能够得到足够的脂肪干细胞，也可以冷冻保存，留待二次注射使用；

1.3脂肪细胞提取：每例实验者抽取的脂肪组织约400ml，取其中100ml脂肪组织按上述步骤提取adscs，剩余的大约300ml脂肪组织作为填充脂肪，将其置于碎冰上低温保存，按照以下方法处理：

①将吸出来脂肪液连同注射器放入4℃生理盐水中直立静置5min，混合液分为3层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；

②然后取出上述混合物排去底层液体，把中、上两层脂肪液及脂肪颗粒转移至50ml离心管内，放入冷冻离心机，400r／min离心2min，离心后呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪，底层为淡红色肿胀液，移除下层液体所得即为移植用脂肪细胞；

二．脂肪细胞的回输（自体脂肪源性干细胞的移植）

会输前进行常规的臀部消毒，根据实验者身形条件在整个臀部/臀部上缘/臀部外侧/臀部内侧/臀部下缘标记受区，在标记好的受区边缘外2cm处选择合适进针点，给予利多卡因局部浸润麻醉，通常，在受区以“扇形”模式插入，创建多个隧道，但是只有在退出时才注入脂肪，进行脂肪注射时，将患者置于俯卧位，髋部弯曲，放置时应同时屈膝，避免下肢静脉瘀血，减少深部静脉血栓形成的风险。这种体位的使用还可以使注射套管更多地注射到皮下和浅表肌肉平面，脂肪颗粒的注射量以矫枉过正30%左右为宜，在注射过程中应该保持力度均匀一致，可轻轻推动局部以促进脂肪的分布均匀，且与周围衔接自然，从而达到更为理想的效果，注射后吸脂区用无菌棉垫加压包扎，填充区域切口覆盖无菌纱布。术后第1天换药，并穿戴弹力衣l～3个月，需要指出说明的是，在脂肪注射过程中，有以下四个关键的原则来保持安全：

①使用较大直径的钝性套管（≥4mm）：使用直径较大的（4mm～5mm）钝性套管可以使脂肪到达深层肌肉组织更困难，将静脉损伤的风险最小化，与更灵活的小直径套管相比，大直径套管硬度更合适，能更好的控制和明确解剖的位置。当直径较小的套管穿过组织时，接口处可能会发生弯曲，尽管管腔的外观是笔直的，但这可能会导致实际注射部位更深，从而损伤血管，并可能导致脂肪栓塞；

②多次重复注射：缓慢、连续、重复注射可进一步改善脂肪移植物的存活率，首先，套管的持续运动可以防止直接将脂肪注入血管。此外，随着持续的运动，移植的脂肪分布在受体组织多处，使移植物存活的可能性更大，使用动力辅助装置可使移植的脂肪分布更均匀；

③注射在皮下或浅层肌肉平面：为了避免臀部血管的损伤，脂肪最好注射在皮下和浅肌层平面内，注射时保持套管平行于臀部表面，在危险三角区域只注射在皮下平面内，在这些关键的原则中，明确套管尖端的确切平面和位置是保证安全的最重要的条件，在危险三角范围内仅注射在皮下平面内，可以降低意外血管损伤或直接注射入血管的风险，还可以避免损伤坐骨神经，在危险三角之外，脂肪移植应该停留在更浅的平面，因为臀部的大血管位于臀大肌的深处，当注射至臀部肌肉组织中时，只有肌肉的浅表区域被注射，同时脂肪应分布在远离臀动脉和静脉的部位；

④避免填充过度导致受区压力过大，当在进行脂肪移植的过程中发现受区移植的脂肪持续从切口溢出时，这是受体部位压力明显过高的信号，在压力过大时，若存在静脉损伤可能导致高压的脂肪进入低压的静脉腔内，从理论上讲，在静脉损伤的情况下，对受体部位的过量填充会增加脂肪栓塞的风险，量填充和压力增高也会降低移植物的存活率。

为了验证本发明的效果，可构建研究组与对照组进行说明，研究组为按照上述步骤处理得到的adscs与脂肪细胞混合后（将纯化后的脂肪颗粒组织与获取的adscs充分混合，并静置30min，使adscs和脂肪颗粒细胞充分附着，形成adscs辅助脂肪颗粒移植混合物，并将这一混合物回输到就医者臀部。），对照组为按照常规脂肪颗粒移植的方法进行，研究组人数n=47，对照组人数n=44；

三．效果评估

3.1设计量化的指标，根据评分标准计算两组实验者的注射后的分值，比较两组在效果上有无区别，观察指标及判定标准：比较两组注射后12个月的评分情况，标准：注射后疤痕情况、注射后并发症情况，臀部增大效果，实验者满意度，分别采用0-3分代表4个等级，各评分相加即为最终分数，总分值0-12分，分数越高表明注射实验效果越好。

3.1.1注射后疤痕评分标准

0分，注射后存在明显疤痕，或疤痕出现增生情况

1分，注射后存在较明显疤痕，未出现疤痕增生情况

2分，注射后存在不明显疤痕，未出现疤痕增生情况

3分，注射后未留下疤痕，或疤痕完全愈合消失

3.1.2注射后并发症情况评分标准

0分，注射后发生感染、坏死、肉芽肿或其他严重症状

1分，注射后出现皮下出血等症状并于术后自行恢复

2分，注射后出现肿胀等症状并于术后自行恢复

3分，注射后未出现任何并发症

3.1.3注射后臀部增大效果评分标准（术后12个月进行观察）

0分，注射后臀围未增加或有所减小

1分，注射后臀围增加2cm以下

2分，注射后臀围增加2~5cm

3分，注射后臀围增加5cm以上

3.1.4实验者满意度评分标准

0分，实验者对注射效果不满意

1分，实验者对注射效果感觉一般

2分，实验者对注射效果较为满意

3分，实验者对注射效果非常满意

3.2比较评价臀围大小变化及其稳定保留率

两腿并拢直立，两臂自然下垂，皮尺水平放在前面的耻骨联合和背后臀大肌最凸处，为了确保准确性，测量臀围时，一是要在横切面上，二是要在锻炼前进行。同时要注意每次测量的时间和部位相同，测量时不要把皮尺拉太紧或太松，力求仔细、准确。分别测量2次，取平均值。保留率的计算方法为术后两周消肿后的臀围作为参考值，比较术后1，3，6个月复查时的臀围的变化。

四．效果验证

4.1两组实验者临床资料对比

两组患者临床资料对比如表1所示，其中，年龄，bmi，随访时间，供区等数据无明显差异不具备统计学意义，传统adscs辅助脂肪移植组在注射后4个月内出现脂肪细胞吸收现象，而研究组组在注射后6～13个月仍维持一个较满意的效果，部分患者在注射后6-9个月要求行二次注射，研究组6例(12.8％)行二次注射，对照组组9例(20.5％)进行二次注射，其差异具有统计学意义(p=0．011)。

所有实验者注射均顺利，未发生感染、坏死、肉芽肿或其他严重并发症，对照组19例患者术后出现明显臀部肿胀症状，约4周恢复，3例患者出现臀部皮下出血，于术后l～2周自行吸收恢复。研究组组22例患者臀部出现轻微肿胀，术后1-2周恢复，未出现皮下出血（如说明书附图1所示）。

4.2设计量化的指标得分对比

根据评分标准计算两组实验者术后的分值，比较两组在治疗效果上有无区别，观察指标及判定标准：比较两组就实验者后12个月的评分情况。标准：术后疤痕情况、术后并发症情况，臀部增大效果，实验者满意度。分别采用0-3分代表4个等级，各评分相加即为最终分数，总分值0-12分，分数越高表明注射效果越好。可以看到采用脂肪干细胞辅助脂肪细胞移植的方法最后得分远高于普通脂肪移植，可见采用脂肪干细胞辅助脂肪细胞移植的方法能够增强整形的效果，提高实验者的满意度，具体情况如说明书附图2所示；

4.3评价臀部的隆起程度，比较臀围大小变化及其稳定保留率

两腿并拢直立，两臂自然下垂，皮尺水平放在前面的耻骨联合和背后臀大肌最凸处。为了确保准确性，测量臀围时，一是要在横切面上，二是要在锻炼前进行。同时要注意每次测量的时间和部位相同，测量时不要把皮尺拉太紧或太松，力求仔细、准确。分别测量2次，取平均值。两组实验者术前臀围比较，差异无统计学意义（p>0.05）。两组术后2周，以及1、3及6个月的臀围比较，采用重复测量设计的方差分析，结果表明术后不同时间点患者的臀围有差别，研究组的术后各个时间点的臀围高于对照组；而且研究组术后各个时间点的臀围的稳定保持率也高于对照组，具体情况如说明书附图3所示；

综上所述，与传统的脂肪干细胞辅助脂肪细胞移植的方法相比，通过adscs辅助脂肪移植技术的方法显著提高了臀部移植脂肪细胞的存活率，有效提高了臀部填充后就医者的满意度，减少其并发症及后遗症的发病率。