鲟鱼蛋白肽在制备免疫调节制剂中的应用的制作方法

本发明属于生物制品领域，更具体地，涉及鲟鱼蛋白肽在制备免疫调节制剂中的应用。

背景技术：

免疫调节制剂是指能调节、增强、兴奋和恢复机体免疫功能的一类物质。免疫调节制剂包括激素类，如地塞米松、泼尼松，烷化剂类，如环磷酰胺，抗代谢类如甲氨蝶呤，以及一些天然制剂，如抗胸腺细胞球蛋白、抗人淋巴细胞免疫球蛋白、某些菌类多糖，如香菇多糖等。

然而激素类免疫调节制剂在使用剂量上不易把握，后遗症常见；烷化剂及抗代谢药具有明显的细胞毒性，使用非常谨慎；其他免疫调节药物，也存在副作用明显或者免疫调节效果不确切的问题。

需要开发更多的具具有免疫调节作用更为安全的制剂，包括药品、食品、保健品等。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了鲟鱼蛋白肽在制备免疫调节制剂中的应用，其目的在于，实践发现本发明提供的鲟鱼蛋白肽的应用具有免疫调节作用，并具备食品级的安全性，能应用于制备免疫调节制剂，包括内服食品、药品、以及保健品。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备免疫调节制剂。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备免疫增强制剂。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备病毒感染辅助治疗药物。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备冠状病毒感染辅助治疗药物。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备2019-ncov冠状病毒感染辅助治疗药物。

6、优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备恶性肿瘤辅助治疗药物。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其所述鲟鱼蛋白肽含有1.2～1.5mg/g的金属硫蛋白肽。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其所述鲟鱼蛋白肽其平均分子量在250da以下。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其所述鲟鱼蛋白肽按照如下方法制备：

1)将鲟鱼洗净、切成块状，然后绞碎，加入其重量1-3倍的水，升温至90℃以上保持10-20min，然后在2-2.5mpa的压力下进行汽爆处理3-5min；

2)步骤1)得到的物料冷却至60℃以下，加入盐酸溶液调ph至1.5-5，再加入鲟鱼质量0.2～0.3％的胃蛋白酶原进行酶解反应2至5小时；

3)步骤2)得到的物料加入碱溶液调节ph至7.5至8，再加入鲟鱼质量0.1～0.2％的胰蛋白酶进行酶解反应1至3小时；

3)步骤2)得到的物料升温至90℃以上保持10-20min，再冷却至65℃以下，进行脱色、脱盐、除菌过滤、滤液浓缩，最后经消毒干燥后即可得到蛋白肽粉体。

优选地，所述鲟鱼蛋白肽的应用，其应用于制备具有免疫调节作用的内服食品、药品、保健品。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明提供的鲟鱼蛋白肽经实验证实能刺激免疫细胞增殖，启动免疫应答，从而起到免疫调节的作用，可用于制备免疫增强制剂，可用于病毒感染、恶性肿瘤的辅助治疗，起到双向调节免疫力的作用。同时具备食品级的安全性，亦适作为具有免疫调节作用的食品、保健品用于日常保健。

附图说明

图1是实施例1不同浓度的鲟鱼蛋白肽对raw264.7细胞的毒性作用结果图；

图2是实施例2不同浓度的鲟鱼蛋白肽对raw264.7细胞分泌no的影响结果图；

图3是实施例3受试患者后前位胸片图像。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

所述鲟鱼蛋白肽含有1.2～1.5mg/g的金属硫蛋白肽，平均分子量在250da以下。

所述鲟鱼蛋白肽按照如下方法制备：

1)将鲟鱼洗净、切成块状，然后绞碎，加入其重量1-3倍的水，升温至90℃以上保持10-20min，然后在2-2.5mpa的压力下进行汽爆处理3-5min；

2)步骤1)得到的物料冷却至60℃以下，加入盐酸溶液调ph至1.5-5，再加入鲟鱼质量0.2～0.3％的胃蛋白酶原进行酶解反应2至5小时；

3)步骤2)得到的物料加入碱溶液调节ph至7.5至8，再加入鲟鱼质量0.1～0.2％的胰蛋白酶进行酶解反应1至3小时；

4)步骤3)得到的物料升温至90℃以上保持10-20min，再冷却至65℃以下，进行脱色、脱盐、除菌过滤、滤液浓缩，最后经消毒干燥后即可得到蛋白肽粉体。

本发明提供的鲟鱼蛋白肽，经细胞实验证实，本发明提供的鲟鱼蛋白肽(商品名“古德宁鲟鱼蛋白肽粉”)能刺激免疫细胞增殖，启动免疫应答，从而起到免疫调节的作用，可用于制备免疫增强制剂，例如恶性肿瘤辅助治疗药物。同时，有人体实验显示，本发明提供的鲟鱼蛋白肽具有抑制过度免疫应答的效果，提示本发明提供的鲟鱼蛋白肽具有双向免疫调节作用，可用于制备病毒感染辅助治疗药物、例如冠状病毒感染辅助治疗药物。

同时本发明提供的鲟鱼蛋白肽，源自天然食品，经检验具有食品级的安全性。

以下为实施例：

实施例中鲟鱼蛋白肽按照如下方法制备：

1)将鲟鱼洗净、切成块状，然后绞碎，加入其重量1-3倍的水，升温至90℃以上保持20min，然后在2.5mpa的压力下进行汽爆处理3min；

2)步骤1)得到的物料冷却至60℃以下，加入盐酸溶液调ph至1.5-5，再加入鲟鱼质量0.3％的胃蛋白酶原进行酶解反应5小时；

3)步骤2)得到的物料加入碱溶液调节ph至7.5至8，再加入鲟鱼质量0.1％的胰蛋白酶进行酶解反应2小时；

4)步骤3)得到的物料升温至90℃以上保持20min，再冷却至65℃以下，进行脱色、脱盐、除菌过滤、滤液浓缩，最后经消毒干燥后即可得到蛋白肽粉体。脱色剂采用活性炭和硅藻土按质量比2:1混合得到，脱色剂的加入量为鲟鱼质量的0.2-0.3％，脱色时间为30min，温度控制在60-70℃；采用枯草芽孢杆菌发酵进行脱腥处理；采用反渗透脱盐处理，所述反渗透脱盐处理参数：压力1mp，温度25℃，脱盐率70％，醋酸纤维素膜；再采用微滤膜进行除菌过滤；采用纳滤膜对滤液浓缩，最后经瞬时高温消毒和真空冷冻干燥后即可得到蛋白肽粉体。

所述鲟鱼蛋白肽，含有1.5mg/g的金属硫蛋白肽；委托北京中科光析化工技术研究所(食品实验室)进行多肽含量及分子量分布检测结果显示平均分子量为243。

实施例1单核巨噬细胞raw264.7细胞存活率的影响实验

采用体外培养小鼠单核巨噬细胞raw264.7作为细胞模型，评价鲟鱼蛋白肽的免疫调节活性。

巨噬细胞是单核巨噬细胞系统中的主要成分，具有吞噬外来入侵的病原微生物、处理和呈递抗原多种作用，通过吞噬和分泌细胞因子从而杀死外来病原体，对维持人体健康起到了关键作用。raw264.7是一种单核巨噬细胞，其包括组织中包括组织中的巨噬细胞、骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞，它们能够清除多种病原物质，在机体防御中起着重要作用。不仅能够启动先天性免疫(非特异性免疫)应答，而且还能参与细胞免疫(特异性免疫)应答，在机体抵抗微生物感染、肿瘤等许多疾病过程中均发挥重要的作用。因此，raw264.7常作为理想的细胞模型来评价生物活性物质的免疫调节活性。

lps(脂多糖)是一种可以激活巨噬细胞的物质，因此本实验选择其作为阳性对照。

mtt实验可以用于评价药物对细胞的毒性影响，细胞活力大小与细胞毒性呈负相关，一般认为细胞活力＜90％即具有一定的细胞毒性，细胞活力＞90％即不具有细胞毒性。

mtt实验测定鲟鱼蛋白肽对细胞存活率的影响

mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)能够被活细胞体内的线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的结晶沉淀物，不能被死细胞还原，二甲亚砜能够溶解紫色沉淀物，其溶液在490nm处的吸光度值能反应活细胞的数量

取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度，按1×10^5个/ml每孔100ul细胞接种于96孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100uldmem基础培养基(不含血清)；阳性对照组加入100ullps(基础培养基稀释至1ug/ml)；实验组给予不同浓度(12.5-1000ug/ml)的鲟鱼蛋白肽溶液(基础培养基配制)，继续培养24h，弃掉上清，加入100ul的mtt溶液(用dmem基础培养基配制成终浓度0.5mg/ml)，然后进一步温育4小时。吸出培养基后，向各孔中加入150uldmso以溶解甲瓒晶体，在490nm处测定其吸光度值。细胞活力＝(od实验-od空白)/(odcontrol-od空白)。

实验结果如图1所示，不同浓度的鲟鱼蛋白肽对raw264.7细胞的毒性作用，当鲟鱼蛋白肽在12.5-500μg/ml浓度范围内时对该细胞没有毒性作用，并在一定程度上可促进巨噬细胞的增殖，当鲟鱼蛋白肽在12-250μg/ml浓度范围内时，增殖活性随鲟鱼蛋白肽的浓度增加而增加，并且均高于阳性对照组的增殖活性(118.76±5.78％)，其最大增殖活性为143.97±8.6％。

实验显示：鲟鱼蛋白肽可促进raw264.7细胞的增殖，在250μg/ml增殖活性最大为143.97±8.6％。

实施例2细胞no分泌影响实验

取对数生长期raw264.7细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度为1×10^6个/ml接种于24孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100uldmem基础培养基(不含血清)；实验组给予不同浓度(12.5-500ug/ml)的鲟鱼蛋白肽(基础培养基配制)，继续培养24h，收集上清液2500r/min离心10min，分别取100ul于酶标板中，然后加入等量的griess试剂，室温静置30min后，于540nm处测定吸光度。根据标准曲线计算上清液中的亚硝酸盐(no2-)含量。

no也是免疫反应中重要的细胞因子，可由被激活的巨噬细胞分泌，是一种反应性氮中间产物，属于具有氧化性能的自由基。少量的no便具有极强的杀伤力，能够病原体和肿瘤细胞等。但是no若分泌过量，也能损坏正常的宿主细胞，从而引起全身性的炎症反应。因此，当机体无炎症时，少量的no即可提高机体的免疫功能。根据前面mtt实验的结果选择12.5-500μg/ml进行下一步实验。结果如图2所示，从图2是不同浓度的鲟鱼蛋白肽对raw264.7细胞分泌no的影响，各个浓度的鲟鱼蛋白肽均能促进raw264.7细胞分泌no，在浓度为100μg/ml时其促进作用最大，为12.04±0.17μm。

实验显示：鲟鱼蛋白肽能够促进raw264.7分泌no，具有免疫调节作用。

细胞实验显示，鲟鱼蛋白肽能有效提高免疫力，具有恶性肿瘤辅助治疗应用前景。

实施例3人体实验

受试患者刘某，女性，62岁，2020年1月23日经核算确诊为2019-ncov冠状病毒感染，伴有高血压基础疾病，确诊当日后前位胸片如图3左图所示，结果为双肺磨玻璃状增高阴影。2020年1月24日至2020年1月29日，支持疗法之外，使用本发明提供的鲟鱼蛋白肽，一日三次，一次30克，温水冲服。2020年1月29日，再次放射成像检测，后前位胸片结果如图3右图所示，肺部病灶明显改善。

显示本发明提供的鲟鱼蛋白肽具有抗病毒感染的辅助治疗作用，尤其是抗冠状病毒感染的辅助治疗作用。由于冠状病毒引起过度免疫应答，提示本发明提供的鲟鱼蛋白肽具有双向免疫调节作用。