快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像系统和方法与流程

本发明属于光学显微成像领域的一种光学补偿散射成像系统和方法，特别涉及了一种快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像系统和方法，并应用于非侵入型深穿透无标记光学显微成像。

背景技术：

在生物医学光学领域，光学散射是制约光学成像质量的主要因素。多数深部组织成像的光学技术(例如，激光共聚焦成像，双光子显微镜和光学相干层析扫描)主要利用非散射光子(即弹道光子)成像。弹道光子的数量随深度增加呈指数式衰减，因此将光学聚焦范围往往限制在了1mm的深度。

早先应用在天文学中的自适应光学技术，为实现深层生物组织成像提供了新的技术支持。

现有的非侵入式自适应光遗传学技术是基于自适应光学的精确相位校正技术，或基于相干光自适应技术来进行相位补偿，从而在样本内校正畸变相位，形成良好的光束聚焦，从而激发出已经标记于样本中的特定物质，使其吸收一定程度的光子能量并发出另一特定波长的荧光信号。

但是以上方法(包括激光共聚焦成像，双光子显微镜等)都需要事先对样本进行荧光标记。虽然目前已经有部分荧光染料已经被证明无害，但是大多数材料仍然由于其或长期或短期的毒性不能用于活体样本上。

受激拉曼散射技术利用物质本身的拉曼光谱，通过两束有特定频率差的光束，通过适应于物质本身的特定拉曼光谱，产生受激拉曼散射信号，得到强度发生周期性变化的原有频率的散射光信号，通过锁相放大器只收集与调制频率相同的出射散射信号并放大。由于受激拉曼散射属于非线性效应，因此只对焦点部分才会产生更明显的所需信号，使其本身便具有了光学切片效应，无需切片即可得到不同深度的图像。由于不同物质的拉曼光谱的敏感性，可以避免掉荧光染色经常会产生的背景噪声并实现高分辨率成像。

虽然受激拉曼散射成像能够进行无标记的成像，但是由于其非线性效应本身比较弱，因此所得到的信号仍然不够强。在散射较为严重的样本中，可能无法形成足够良好的焦点从而得到所需的信号。在完成无标记高分辨率成像的同时保证良好的信号强度和成像速度也是目前生物应用中亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的在于提出了一种快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像系统和方法，利用图像刷新率较高的可变形镜解决传统应用于生物医学的自适应光学中的空间光调制器耗时较长的问题。

本发明利用可变形镜快速的刷新率，结合受激拉曼散射技术的原理，将可变形镜进行分区处理，分别对受激拉曼散射所需要的两束光进行不同程度的相位调制，通过自适应算法，使入射波前契合于散射情况，提升光束聚焦的质量，从而提高受激拉曼散射信号的强度，从而提高无标记成像的分辨率。从而提高受激拉曼散射技术的效率。

为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：

一、一种基于快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像系统：

系统包括激光器、半波片、偏振分束器、声光调制器、扩束模块、反射镜、二向色镜、相位延迟模块、合束模块、可变形镜、扫描模块、显微物镜、实验样品和光强探测模块；两个半波片与两个偏振分束器布置在激光器输出端前，激光器发射出两束不同波长的光束，两束光束均经各自的半波片与偏振分束器被调节为相同的偏振方向，第一束光束从偏振分束器出射后依次经声光调制器、扩束模块入射到反射镜，第二束光束依次经扩束模块、相位延迟模块后入射到二向色镜，第一束光束被反射镜反射后经二向色镜透射后和经二向色镜反射的第二束光束一起分隔间距地经过合束模块入射到可变形镜的两个区域上，再经由可变形镜反射到合束模块形成一束光束，该光束再经过扫描模块入射到显微物镜聚焦，实验样品位于显微物镜焦平面上，经实验样品透射产生散射光束被光强探测模块接收进行探测，实验样品受激拉曼反射激发产生非线性信号，非线性信号通过光强探测模块接收进行探测。

每个所述扩束模块包括一个前扩束模块透镜和一个后扩束模块透镜；前扩束模块透镜和后扩束模块透镜沿光轴依次布置在偏振分束器之后，激光器出射的两束光束依次经各自的扩束模块之后被扩束到相同直径。

所述的相位延迟模块包括沿光路依次布置的出射反射镜、前偏转反射镜、后偏转反射镜和入射反射镜，未经声光调制器调制的第二束光束入射到出射反射镜，依次经出射反射镜反射、前偏转反射镜反射、后偏转反射镜反射、入射反射镜反射后出射到二向色镜；前偏转反射镜与出射反射镜之间的距离、后偏转反射镜和入射反射镜之间的距离均能调节，从而达到不同的延迟效果。

所述的激光器发射出的两束光束均为脉冲光束，通过相位延迟模块的不同延迟调节使得两束光束的脉冲同步。

所述的合束模块包括左分束器和右分束器；左分束器和右分束器之间连线平行于可变形镜的反射面放置，左分束器和右分束器具体均为半透半反镜，第一束光束透射过右分束器后入射到可变形镜反射，经由可变形镜反射回的光束入射到右分束器反射产生第一反射光束，第二束光束透射过左分束器后入射到可变形镜反射，第二束光束经由可变形镜反射回的光束入射到左分束器反射产生第二反射光束，第二反射光束入射到右分束器透射后和第一反射光束合束，使得从可变形镜反射回的两束光束分别入射到左分束器和右分束器之后反射后形成同轴。

所述的可变形镜是主要由数个可三维调整反射面面型的微镜紧密阵列构成，具体可采用空间光调制器。

所述的扫描模块包括前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜；前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜沿光路依次布置在合束模块之后，合束模块合束后出射的光束依次经前扫描振镜反射、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜反射、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜后入射到显微物镜；

所述的光强探测模块包括聚光器、滤光片、准直聚焦透镜、光电二极管和锁相放大器，设计为透射式系统，聚光器、滤光片、准直聚焦透镜、光电二极管和锁相放大器沿光路依次布置在实验样品之后，实验样品内的散射光束依次经过聚光器、滤光片和准直聚焦透镜后进入光电二极管和锁相放大器收集并放大信号。

二、一种基于快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像方法：方法利用自适应补偿方法对受激拉曼散射系统的入射光进行调制，提高分辨率，入射光为入射到实验样品的光束；方法包括以下步骤：

1)将可变形镜对半分为两个区域，激光器发射出两束不同波长的光束，经光路分别入射到可变形镜分区后的两个区域进行光束聚焦，两个区域对应两种不同波长的光束；在显微物镜的焦平面处得到聚焦光斑；

2)在显微物镜的焦平面处不放置实验样品，可变形镜的两个区域均不进行相位调制，进行步骤1)，在显微物镜的焦平面处得到理想聚焦光斑并进行光强探测，记录理想聚焦光斑的中心作为聚焦中心位置of，获得理想聚焦光斑在聚焦中心位置of处的信号光强值作为参考；

3)在显微物镜的焦平面处放置实验样品，可变形镜的两个区域均不进行相位调制，进行步骤1)，在显微物镜的焦平面处得到畸变聚焦光斑并进行光强探测，记录获得畸变聚焦光斑在聚焦中心位置of处的信号光强值；

4)对可变形镜的两个区域进行相位调制，且两个区域进行不同的相位调制，不同以相位调制的方式进行光强探测，进行步骤1)，在显微物镜的焦平面处得到相位调制聚焦光斑，针对相位调制聚焦光斑进行分析和提取获得两束光束的每一束光束在聚焦中心位置of的信号光强值，并处理获得每一束光束在可变形镜的补偿相位分布，即每一束光束在可变形镜中每一个微镜对应的补偿相位值；

5)将两束光束各自所得到的补偿相位分别加载到步骤3)实施时的可变形镜对应的两个分区上，进行步骤1)，在实验样品内形成最终光学聚焦补偿光斑，在聚焦中心位置为of处激发出更强的非线性信号。

所述步骤2)中的光束聚焦具体是：激光器发射出两束不同波长的光束，经过各自的准直扩束后，在可变形镜上反射，合束后经过扫描模块，通过物镜聚焦。

所述步骤2)、3)和4)中的光强探测具体是：激光器发射出两束不同波长的光束，其中一束光束经声光调制器调制，经可变形镜上反射合束后通过物镜聚焦到实验样品上，在实验样品内产生畸变散射光斑，两束光束的强度以声光调制器的调制频率产生强度变化，畸变散射光斑的散射光束利用光强探测模块中的滤光片采集其中一束光的强度变化信息，通过准直聚焦透镜聚焦后由光电二极管收集并使用锁相放大器放大信号作为聚焦中心位置of处的信号光强值。

所述的声光调制器调制其中一束光束的光强强度，使得两束光束匹配受激拉曼散射成像要求。

所述步骤5)中的相位补偿具体是指在步骤3)实施时的光束原相位基础上加载额外的补偿相位值。

所述步骤4)具体是利用自适应算法分别对可变形镜的两个区域进行快速的调制从而获得能使采集到的信号光强最大时的补偿相位值。

所述实验样品为但不限于活体生物组织、离体生物组织、含小球的琼脂块等。

本发明受激拉曼散射利用两束不同波长的光通过非线性效应激发所需要的信号，由于样本内部的散射作用，会使得所得到的散射信号很弱。利用可变形镜对该系统进行自适应矫正以提高信号的强度，利用可变形镜，并进行分区从而对两束不同波长的光束进行分别调制。利用可变形镜，通过向其加载不同的补偿相位，光束聚焦后经过样本散射，仍然会形成一个特定强度的焦点，从焦点发出的散射光收集起来通过光电二极管接受记录并放大信号。

本发明通过优化方法，调整可变形镜的补偿相位值，使得光束进行相位补偿后能够在样品内部形成中心光强更强的聚焦光斑，以更好地激发非线性效应。本发明从受激拉曼散射原理与相位补偿的方法出发，提升了散射介质内部深处成像的质量，为活体深层无标记高分辨率显微成像提供了一种新的技术处理方式。

本发明的有益效果是：

本发明利用可变形镜实现了快速的自适应光束聚焦补偿，利用可变形镜快速的图像刷新速率，克服了以往利用空间光调制器进行相位校正时速度慢的问题，提升了光束聚焦的速度。

本发明基于受激拉曼散射的原理，通过将受激拉曼散射成像技术于自适应光学技术相结合，得到于散射样本相契合的分区相位值，从而使聚焦中心的光强显著提升，提高了入射光利用率，能够有效地提高拉曼信号的收集率，在提升自适应光学聚焦质量的同时，实现分辨率更高的无标记成像，减小对生物组织的损害和毒性。

附图说明

图1为本发明系统的结构示意图；

图2为理想情况下300mm透镜聚焦850nm光时产生的艾里斑结果图；

图3为在透镜f/2处放置散射介质后产生的散射光斑结果图；

图4为模拟散射介质所使用的随机相位结果图；

图5为调制散射光所使用的补偿相位值结果图；

图6为经过自适应调制后的聚焦光斑结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。

如图1所示，具体实施包括激光器1、半波片2、3、偏振分束器4、5、声光调制器6、扩束模块、反射镜11、二向色镜16、相位延迟模块、合束模块、可变形镜19、扫描模块、显微物镜26、实验样品27和光强探测模块；两个半波片2、3与两个偏振分束器4、5布置在激光器1输出端前，激光器发射出两束不同波长的光束，两束光束均经各自的半波片2、3与偏振分束器4、5被调节为相同的偏振方向，第一束光束从偏振分束器4、5出射后依次经声光调制器6、扩束模块入射到反射镜11，第二束光束依次经扩束模块、相位延迟模块后入射到二向色镜16，第一束光束被反射镜11反射后经二向色镜16透射后和经二向色镜16反射的第二束光束一起分隔间距地经过合束模块入射到可变形镜19的两个区域上，再经由可变形镜19反射到合束模块形成一束光束，该光束再经过扫描模块入射到显微物镜26聚焦，实验样品27位于显微物镜26焦平面上，经实验样品27透射产生散射光束被光强探测模块接收进行探测，实验样品受激拉曼反射激发产生非线性信号，非线性信号通过光强探测模块接收进行探测。

每个扩束模块包括一个前扩束模块透镜7/8和一个后扩束模块透镜9/10；前扩束模块透镜7/8和后扩束模块透镜9/10沿光轴依次布置在偏振分束器4/5之后，激光器1出射的两束光束依次经各自的扩束模块之后被扩束到相同直径。

相位延迟模块包括沿光路依次布置的出射反射镜12、前偏转反射镜13、后偏转反射镜14和入射反射镜15，未经声光调制器6调制的第二束光束入射到出射反射镜12，依次经出射反射镜12反射、前偏转反射镜13反射、后偏转反射镜14反射、入射反射镜15反射后出射到二向色镜16；前偏转反射镜13与出射反射镜12之间的距离、后偏转反射镜14和入射反射镜15之间的距离均能调节，从而达到不同的延迟效果。

激光器发射出的两束光束均为脉冲光束，通过相位延迟模块的不同延迟调节使得两束光束的脉冲同步。

合束模块包括左分束器17和右分束器18；左分束器17和右分束器18之间连线平行于可变形镜19的反射面放置，左分束器17和右分束器18具体均为半透半反镜，第一束光束透射过右分束器18后入射到可变形镜19反射，经由可变形镜19反射回的光束入射到右分束器18反射产生第一反射光束，第二束光束透射过左分束器17后入射到可变形镜19反射，第二束光束经由可变形镜19反射回的光束入射到左分束器17反射产生第二反射光束，第二反射光束入射到右分束器18透射后和第一反射光束合束，使得从可变形镜19反射回的两束光束分别入射到左分束器17和右分束器18之后反射后形成同轴。

可变形镜19是主要由数个可三维调整反射面面型的微镜紧密阵列构成，具体可采用空间光调制器。

扫描模块包括前扫描振镜20、前光束准直透镜21、后光束准直透镜22、后扫描振镜23、前扫描模块透镜24和后扫描模块透镜25；前扫描振镜20、前光束准直透镜21、后光束准直透镜22、后扫描振镜23、前扫描模块透镜24和后扫描模块透镜25沿光路依次布置在合束模块之后，合束模块合束后出射的光束依次经前扫描振镜20反射、前光束准直透镜21、后光束准直透镜22、后扫描振镜23反射、前扫描模块透镜24和后扫描模块透镜25后入射到显微物镜26；

光强探测模块包括聚光器28、滤光片29、准直聚焦透镜30、光电二极管31和锁相放大器32，设计为透射式系统，聚光器28、滤光片29、准直聚焦透镜30、光电二极管31和锁相放大器32沿光路依次布置在实验样品27之后，实验样品27内的散射光束依次经过聚光器28、滤光片29和准直聚焦透镜30后进入光电二极管31和锁相放大器32收集并放大信号。

本发明的实施例及其实施过程如下：

1)将可变形镜19分为两个区域，分别对应两种不同波长的光束；

2)物镜的焦平面处不放置试验样品，用分区后的可变形镜19进行光束聚焦，在物镜的焦平面处得到理想聚焦光斑，如图2，并记录理想聚焦光斑的聚焦中心位置of和信号光强值作为参考，图2中的理想聚焦光斑信号光强值为0.042139(a.u.)；

3)将实验样品置于物镜焦平面处，用分区后的可变形镜19预加载初始的全0相位，并进行光强探测，记录散射后得到的畸变聚焦光斑的聚焦中心位置of′和信号光强值，如图3，其中畸变聚焦光斑中心位置的光强信号值为0.00042439(a.u.)，模拟所使用的散射介质在仿真中放置于透镜焦距f/2处，如图4；

4)针对可变形镜19的两个区域以相位调制的方式进行相位补偿，所使用的自适应算法如下：

对每一束光，首先通过以不同频率调制可变形镜对应分区中的一半区域，得到聚焦中心的随时间变化的信号值。对其进行傅里叶变换从而得到频域数据，根据调制的频率，得到频谱中相应频率对应的不同调制分区的相位值，得到聚焦中心of′处光强最大时所需的相位值，并固定此一半的区域的相位值不变；对该分区另一半区域采取同样的方法使中心光强最大，获得所需的补偿相位值，二者叠加得到最终此光束对应分区完整的调制相位。对调制另一束光的分区采取同样的操作，并处理所获得另一分区中各个区域对应的补偿相位值，本次对其中850nm波长的光束进行仿真(聚焦焦距300mm)，所得到的可变形镜19上加载的相位如图5；

5)将所得到的补偿相位值加载到可变形镜19上进行光强探测，在实验样品内形成最终光学聚焦补偿光斑，如图6，调制后的光强值为0.027333(a.u.)，相比于畸变聚焦光斑，最终光学聚焦补偿光斑能够在聚焦中心位置获得增强了约64.41倍的信号值，从而在聚焦中心位置为of′处激发出更强的非线性信号。

6)得到的信号通过光电二极管31采集和锁相放大器32进行放大，即得到该点的信号值。

7)利用扫描模块扫描整个实验样本，并对每个扫描点重复步骤3)到步骤6)即可得到整个扫描区域每个点的信号值从而组成图像。

相比于传统的受激拉曼散射成像(srs)系统，快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像系统能够在同样散射程度的样品中得到更好的焦点质量，更有效地利用光功率，减少过大功率对生物组织地损耗，在输入光强相同的情况下能够得到更高的信噪比，有效提高成像速度和分辨率。