本发明属于医药卫生领域，具体涉及一种预防和治疗人乳头瘤病毒(hpv)感染的凝胶敷料及制备方法。
背景技术：
20世纪80年代德国病毒学家haraldzurhausen首次提出hpv感染与子宫颈癌密切相关，1995年，irac(国际癌症研究组织)专题会议确定了hpv感染是子宫颈癌发生的必要条件，99.7％的宫颈癌组织中可以检测到hpv，未感染hpv者几乎不会发生子宫颈癌(阴性预测值>99％)。由于对宫颈癌病因得以揭示，hausen成为2008年诺贝尔医学奖的得主之一。
高危型hpv是一种蛋白包被的双链dna最小的病毒，目前分型已超过100种，是一种嗜黏膜和皮肤上皮性病毒，具有高度的宿主和特异性，常通过性接触引起一过性感染，从上皮基底层的微小伤口进入体内，在组织细胞内以dna复制的方式进行繁殖，导致不同程度的增生性病变。
高危型人乳头瘤病毒：hpv16、18、33等类型与宫颈癌、宫颈上皮肉瘤等恶性肿瘤的发生有关，故称为高危型hpv，能导致79％以上的宫颈癌和50％以上的宫颈上皮瘤样病变(cinⅱ-ⅲ)。亚高危型人乳头瘤病毒：包括hpv31、39、45、51、52、53、56、59、66、68、73、82、83等类型属高危亚型。低危型人乳头瘤病毒：hpv6、11、42、43、81能导致尖端湿疣、喉乳头瘤等良性病变，是最常见的致病型，故为低危型hpv。
hpv感染是发生子宫颈癌的主要病因之一，99.7％的子宫颈癌都能发现高危型hpv感染。高危型hpv持续感染，使患宫颈癌的风险增加250倍，只有持续感染hpv才会导致宫颈上皮发生cinⅲ(重度不典型增生及原位癌)，约40％的妇女持续感染hpv，合并宫颈低度病变者会发展成cinⅲ或癌，并维持在这个水平上。所以，高危型hpv感染是预测宫颈病变恶化的可靠指标。
人乳头瘤病毒感染可通过疫苗进行预防和治疗，但疫苗价格过高、储存不便，有诸多使用限制。另外可通过外敷药物预防和治疗、目前市面上药物较少，患者可选择性低。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种含cp蛋白具有预防和治疗人乳头瘤病毒感染(hpv)感染的凝胶敷料，为预防和治疗人乳头瘤病毒感染提供更多的选择性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的凝胶敷料，它是以cp蛋白(丝素蛋白)、卡波姆、羧化壳聚糖、甘油、阿拉伯胶为主要原料制成的；所述的原料的质量百分比如下：
优选的，所述的凝胶敷料由如下质量百分比的原料制成：
或
或
本发明的另一个目的是提供所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染的凝胶敷料的制备方法，包括：按配方量称取原料；将卡波姆加入适量纯化水中，溶胀得到卡波姆水溶液；cp蛋白、阿拉伯胶分别配成水溶液；将羧化壳聚糖溶于适量纯化水中，与卡波姆水溶液混匀，得胶浆；往胶浆中依次加入阿拉伯胶水溶液、甘油，混匀；将cp蛋白溶液缓缓加入胶浆，加水至全量，混匀，即得。
具体的，包括以下步骤：按配方量称取原料；将卡波姆加入适量纯化水中，加热至70～80℃，搅拌20～40分钟，室温放置过夜，使其充分溶胀；cp蛋白加入适量纯化水溶解；阿拉伯胶加入适量纯化水，混匀，70～80℃水浴20～40分钟；羧化壳聚糖溶于适量纯化水中，与卡波姆水溶液混匀，得胶浆，胶浆比较浓稠，先加入其他物质混匀，最后加如丝素蛋白利于蛋白在凝胶中混合均匀：往胶浆中依次加入阿拉伯胶水溶液、甘油，混匀；将cp蛋白溶液缓缓加入胶浆，加水至全量，混匀，即得。
所述的cp蛋白通过以下方法的制备得到：蛹蚕茧剪碎，按照料液比1:50(g/ml)与0.5％碳酸钠溶液混合，煮沸换液4次，用蒸馏水反复搓洗，烘干；烘干后，按照料液比1:5(g/ml)与9m溴化锂溶液混合，60℃加热处理4小时，离心除去不溶物，转移至截留分子量8000～14000的透析袋透析2天；透析液冷冻干燥，得冻干粉，即得cp蛋白。实施例所用cp蛋白按照上述方法制得。
hpv由蛋白衣壳和dna核心组成，蛋白衣壳由l1和l2组成，其中l1的c端和l2的n端均有一段富含正电荷氨基酸区域。本发明以cp蛋白为主要有效成分，cp蛋白整体带负电，可以和hpv病毒结合，使之失活，且对受损组织有修复能力。卡波姆是优良的水性凝胶的基质，提供高效的增稠性、良好的透明度、悬浮能力及乳化体系的稳定性，而且有高度的不粘感，适用于清澈凝胶；羧化壳聚糖水溶性高，具有优良乳化性、吸湿保湿性、成膜性和生物相容性等特点，具备有效抑制细菌和真菌生长和繁殖的能力，可以作为抑菌剂。同时，羧化壳聚糖可中和卡波姆酸度，使卡波姆u20分子链弥散伸展呈极大的膨胀状态，增稠形成凝胶，改善羧化壳聚糖凝胶性能差的缺点。甘油作为强极性多元醇，能减缓cp蛋白β-折叠，又有保湿效果，故作稳定剂和保湿剂。阿拉伯胶同甘油一同作稳定剂。
本发明的原理：cp蛋白整体带负电，可以和hpv蛋白衣壳上的正电荷相互络合，进而使hpv蛋白构象发生变化而失活；同时，卡波姆、羧化壳聚糖将失活的hpv吸附排出体外；cp蛋白和卡波姆加快受损、糜烂组织快速恢复和愈合。从而达到预防和治疗hpv感染的目的，对宫颈癌的发生有预防作用。
本发明的另一个目的是通过所述的凝胶敷料在制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染药物中的应用。
优选的，所述的人乳头瘤病毒为hpv6、hpv16和hpv18。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
以制备1kg凝胶敷料为例，各原料的质量百分比为：cp蛋白0.1％、卡波姆0.1％、羧化壳聚糖0.1％、甘油15％、阿拉伯胶0.5％、水为余量，各原料的质量百分比之和为100％。
所述的凝胶敷料由以下方法制得：取卡波姆加入适量纯化水中，加热至80℃，搅拌半小时，室温放置过夜，使其充分溶胀；cp蛋白加入适量纯化水溶解；阿拉伯胶加入适量纯化水，混匀，80℃水浴半小时；羧化壳聚糖溶于适量纯化水中，与卡波姆水溶液混匀，得胶浆；往胶浆中依次加入阿拉伯胶水溶液、甘油，混匀；将cp蛋白溶液缓缓加入胶浆，加水至全量，混匀，即得。
实施例2
以制备1kg凝胶敷料为例，各原料的质量百分比为：cp蛋白0.05％、卡波姆0.3％、羧化壳聚糖0.3％、甘油10％、阿拉伯胶1％、水为余量。
所述的凝胶敷料由以下方法制得：取卡波姆加入适量纯化水中，加热至70℃，搅拌20分钟，室温放置过夜，使其充分溶胀，待用；cp蛋白加入适量纯化水溶解，待用；阿拉伯胶加入适量纯化水，混匀，70℃水浴20分钟，待用；羧化壳聚糖溶于适量纯化水中，与卡波姆水溶液混匀，得胶浆；往胶浆中依次加入阿拉伯胶水溶液、甘油，混匀；将cp蛋白溶液缓缓加入胶浆，加水至全量，混匀，即得。
实施例3
以制备1kg凝胶辅料为例，各原料的质量百分比为：cp蛋白0.01％、卡波姆1％、羧化壳聚糖1％、甘油5％、阿拉伯胶3％、水为余量。
所述的凝胶敷料由以下方法制得：取卡波姆加入适量纯化水中，加热至80℃，搅拌40分钟，室温放置过夜，使其充分溶胀；cp蛋白加入适量纯化水溶解；阿拉伯胶加入适量纯化水，混匀，80℃水浴40分钟；羧化壳聚糖溶于适量纯化水中，与卡波姆水溶液混匀，得胶浆；往胶浆中依次加入阿拉伯胶水溶液、甘油，混匀；将cp蛋白溶液缓缓加入胶浆，加水至全量，混匀，即得。
cp蛋白凝胶室温留样考察
利用马尔文电位仪测定凝胶ζ电位。将cp蛋白凝胶样品(实施例1、实施例2、实施例3)室温留样考察12个月，在第0、3、6、9、12个月检测，检测结果如表1。
表1、cp蛋白凝胶样品室温留样考察结果
安全性检测
对制得凝胶进行安全性检测，结果证明无毒无副作用。“阴道刺激试验”按gb/t16886.10-2005中附录b中b7的规定进行检测，鉴定结果为阴道刺激反应程度为无，未见皮肤变态反应。
体外抗病毒活性
1)构建hpv假病毒
假病毒是指一种反转录病毒能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒。假病毒与正常病毒的感染能力相同，但是假病毒在感染细胞后不能在细胞内进行正常的增值活动，直至所有假病毒被细胞清除，对细胞没有危害。据buck等人的研究(buckcb,pastranadv,lowydr,schillerjt.efficientintracellularassemblyofpapillomaviralvectors.jvirol.2004；78(2):751–757.doi:10.1128/jvi.78.2.751-757.2004)，他们将hpv膜结构蛋白l1、l2的基因优化后构建到真核生物表达载体与报告质粒同时转染真核细胞，他们发现l1、l2能在真核细胞内高效地表达且自我进行组装，形成具有免疫原性的假病毒颗粒。利用buck等人的构建方法不仅方便且产生的假病毒滴度较高可达107tu利用该方法包装的假病毒已成功应用于生产hpv疫苗和药物筛选。本发明利用该法构建了低危型hpv6和高危型hpv16、hpv18三种假病毒模型。构建步骤如下：
将hpvl1、l2相关基因优化，利用聚合酶链式反应(pcr)进行扩增，克隆到真核细胞表达载体，然后进行酶切和测序鉴定，形成稳定表达的phpv6、phpv16、phpv18的表达载体。将测序鉴定正确的三个表达载体质粒和报告质粒pseap(内含碱性磷酸酶报告基因)大量扩增，备用。
本试验以dmem高糖培养基为培养基。
培养293ft细胞，分别传代至4个100mm培养板，37℃、5％co2培养待细胞生长至融合度至80％时，利用lipofilter转染试剂分别将质粒phpv6、phpv16、phpv18与pseap报告质粒共同转染293ft细胞，同时设对照组仅转染pseap报告质粒。将转染质粒后的细胞放置37℃、5％co2培养箱继续培养12h后更换新鲜培养基，继续培养72h后去除培养基用dpbs洗2次，用0.25％的胰酶消化细胞3分钟，加入10ml培养基转入15ml离心管，1000g离心5分钟去除上清液，加入与沉淀等体积的细胞裂解液(0.3％brij58，0.2％benzonase，0.2％plasmidsafeatpdependentdnase的dpbs)37℃处理24小时，取出后置于冰上5分钟，加入0.17倍体积的5mnacl溶液，涡旋混匀，置于冰上10-20分钟，4℃、5000g离心10分钟，取上清液，即为假病毒悬液，分装，置于-80℃，备用。
2)病毒滴度测定
将293ft细胞传代至96孔板，每孔细胞数为1×105个，37℃、5％co2培养8h。
将hpv假病毒悬液进行连续10倍的稀释，从10-1到10-6。去除96孔中的培养基，加入50μl假病毒稀释液，再加入50μl正常培养基，37℃、5％co2继续培养72h，取50μl培养液上清，利用默克碱性磷酸酶检测试剂盒检测，以此计算tcid50。
3)cp蛋白对hpv6、hpv16和hpv18的抑制活性检测
将293ft细胞传代至96孔板，每孔细胞数为1×105个，37℃、5％co2培养8h。
分别将100tcid50的hpv6、hpv16、hpv18假病毒(50μl)与不同浓度的cp蛋白溶液(50μl)进行孵育，37℃孵育30min；以β-乳球蛋白为对照蛋白进行孵育。去除96孔板中的培养基，加入上述孵育后的混合物，37℃、5％co2继续培养12小时，更换新鲜培养基，培养72小时后，取50μl培养液上清液，利用默克碱性磷酸酶检测试剂盒检测，利用spss25计算cp蛋白的ic50(半数抑制浓度)。结果见表2。
表2、cp蛋白抗hpv的活性
从表2中可以看出cp蛋白对hpv6、hpv16、hpv18病毒有显著的抑制活性，ic50分别约为1.3μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml。