本发明涉及一种含硫酸多黏菌素b的组合物、冻干粉及其制备方法和应用。
背景技术：
多黏菌素b是从多黏杆菌培养液中分离得到的一种环肽类抗生素，多黏菌素于20世纪50年代被开发出来，20世纪60年代用于治疗革兰阴性菌感染，特别是铜绿假单胞菌所致感染。由于其抗菌谱窄，肾毒性较明显，特别是20世纪80年代后一些新的广谱抗菌药物如第三代头孢菌素、碳青霉烯类等药物的出现和在临床的广泛使用，导致多黏菌素被弃用。但是由于抗菌药物的广泛使用，特别是不合理的使用，细菌对β-内酰胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物耐药问题日益突出，特别是多药耐药菌株(mdr)感染的出现，甚至对碳青霉烯类抗菌药物也产生耐药性，严重威胁着人类的健康，临床可供选择的药物越来越少，而新的抗菌药物开发上市的速度远不及耐药菌上升的速度。近年来，研究人员发现多黏菌素治疗多药耐药(mdr)革兰阴性菌感染(特别是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌)取得较好疗效，在国外临床已被重新启用于治疗mdr革兰阴性菌严重的感染患者。
硫酸多黏菌素b是多黏菌素b的硫酸盐。硫酸多黏菌素b为白色或类白色粉末，几乎无臭，有引湿性，在水中易容溶，易溶于40％的乙醇水溶液，在醚、酮、酯、烃等有机溶剂中几乎不溶解。在酸性溶液中稳定，碱性溶液不稳定。
目前，硫酸多黏菌素b冻干粉大多采用将原料药硫酸多黏菌素b溶于注射用水中，经过除菌和冻干处理制得；但是，制得的硫酸多黏菌素b冻干粉存在体积缩小、萎缩或开裂等现象，且制得的硫酸多黏菌素b冻干粉复溶时间较长，复溶后不溶性微粒较多，增加了用药的安全性风险。
技术实现要素：
本发明所要解决的问题在于克服现有技术中含硫酸多黏菌素b的冻干粉存在体积缩小、萎缩或开裂的问题，且复溶时间较长，复溶后不溶性微粒较多的缺陷，并提供一种含硫酸多黏菌素b的组合物、冻干粉及其制备方法和应用。本发明中的含硫酸多黏菌素b的冻干粉，结构致密均一、稳定性和复溶效果好；且本发明中的制备方法工艺简便易行。
发明人通过实验表明：叔丁醇水溶液可作为原料药硫酸多黏菌素b的溶剂制备含硫酸多黏菌素b的组合物、冻干粉。根据本领域常规，原料药硫酸多黏菌素b不溶于醇类溶剂，易溶于水，因此本领域技术人员均采用水作为原料药硫酸多黏菌素b的溶剂制备含硫酸多黏菌素b的组合物、冻干粉；但是，发明人意外地发现，通过控制叔丁醇的用量，可以使原料药硫酸多黏菌素b完全溶解，且将含硫酸多黏菌素b和叔丁醇水溶液的组合物进行冻干处理，制得的含硫酸多黏菌素b的冻干粉成型良好，无萎缩或开裂现象，干燥失重低，同时，复溶时间短，复溶后的溶液中不溶性微粒较少，进一步地，根据本发明中的制备方法制得的含硫酸多黏菌素b的冻干粉中硫酸多黏菌素b的含量稳定性好，6个月后甚至12个月后的含硫酸多黏菌素b的冻干粉中硫酸多黏菌素b的含量变化仍然较小。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供的技术方案之一为：一种含硫酸多黏菌素b的组合物，所述含硫酸多黏菌素b的组合物包括硫酸多黏菌素b、叔丁醇和水；
以所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，所述硫酸多黏菌素b的浓度为50～77g/l，所述叔丁醇的浓度为3～16g/l。
本发明中，所述硫酸多黏菌素b可为本领域常规、一般市售可得的硫酸多黏菌素b。所述硫酸多黏菌素b的浓度优选为55～65g/l，更优选为60.36g/l。
本发明中，所述叔丁醇一般市售可得。
所述叔丁醇的含量优选为0.5％～2％，例如0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％，更优选为0.5％、1％或2％；所述百分比为所述叔丁醇占所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积百分比。
以所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，所述叔丁醇的浓度优选为3.9～15.6g/l，例如3.9g/l、6.24g/l、7.8g/l、9.36g/l、11.7g/l、14.08g/l或15.6g/l，更优选为3.9g/l、7.8g/l或15.6g/l。
所述叔丁醇的密度可为0.78g/ml(77℉)。
所述叔丁醇的质量百分比可为98％以上；优选为99％。
本发明中，所述水可为本领域常规的水，例如纯化水、注射用水和生理盐水中的一种或多种，优选为注射用水。本领域技术人员可根据实际需求调整所述水的用量。
其中，所述注射用水可为符合《中国药典》注射用水中规定的水，一般是指蒸馏水或去离子水经蒸馏所得的水。
本发明中，所述含硫酸多黏菌素b的组合物的ph值可为5.0～7.0，优选为6.0～7.0。
当所述含硫酸多黏菌素b的组合物的ph值不在5.0～7.0范围内时，可采用ph值调节剂调节所述含硫酸多黏菌素b的组合物的ph值。
其中，所述ph值调节剂可为硫酸和/或氢氧化钠。
所述硫酸可为本领域常规的硫酸，一般是指质量百分比为95％的硫酸。
所述ph值调节剂的用量可为将所述含硫酸多黏菌素b的组合物的ph值调节至5.0～7.0的用量。所述用量可为所述ph值调节剂占所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积百分比。本领域技术人员应当知晓，当计算所述含硫酸多黏菌素b和所述叔丁醇的浓度时，所述ph值调节剂的用量可忽略不计。
在本发明一较佳实施例中，所述含硫酸多黏菌素b的组合物，优选包括硫酸多黏菌素b、叔丁醇和水；以所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，所述硫酸多黏菌素b的浓度为60.36g/l，所述叔丁醇的浓度为3.9g/l。
在本发明一较佳实施例中，所述含硫酸多黏菌素b的组合物，优选包括硫酸多黏菌素b、叔丁醇和水；以所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，所述硫酸多黏菌素b的浓度为60.36g/l，所述叔丁醇的浓度为7.8g/l。
在本发明一较佳实施例中，所述含硫酸多黏菌素b的组合物，优选包括硫酸多黏菌素b、叔丁醇和水；以所述含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，所述硫酸多黏菌素b的浓度为60.36g/l，所述叔丁醇的浓度为15.6g/l。
本发明提供的技术方案之二为：一种所述含硫酸多黏菌素b的组合物的制备方法，包括如下步骤：将所述叔丁醇、所述水和所述硫酸多黏菌素b混合即可。
本发明中，优选地，将所述叔丁醇溶解于所述水(一般可在搅拌条件下溶解)，得到叔丁醇溶液；将所述硫酸多黏菌素b溶解于所述叔丁醇溶液(一般可在搅拌条件下溶解)；再加入所述水，得到含硫酸多黏菌素b的组合物。
其中，根据本领域常规，一般可将所述硫酸多黏菌素b完全溶解于所述叔丁醇溶液中，再加入所述水，定容。
用所述水定容之前，优选还包括测量ph值的步骤。当所述ph值不为5.0～7.0时，可采用所述ph值调节剂调至5.0～7.0，优选为6.0～7.0。根据本领域常规，定容的水可为少量，用所述水定容之后的ph值在合理范围内变化，仍为5.0～7.0。
本发明提供的技术方案之三为：一种含硫酸多黏菌素b的冻干粉的制备方法，将所述含硫酸多黏菌素b的组合物进行冻干处理即可。
本发明中，所述冻干处理前，可包括除菌、灌装和半压塞的步骤。
其中，所述除菌的方法可为本领域常规的除菌方法；例如过滤。所述过滤优选为将所述含硫酸多黏菌素b的组合物经过0.2μm微孔滤膜过滤。
其中，所述灌装的方法可为本领域常规的灌装方法；例如将除菌后的所述含硫酸多黏菌素b的组合物，定量地灌装到西林瓶中。
其中，所述半压塞的方法可为本领域常规的半压塞方法；例如将胶塞压入西林瓶瓶口的一半，留下液体逸出的通道。
本发明中，所述冻干处理可包括预冻、升华干燥和解析干燥。
其中，所述预冻的方法可为本领域常规的预冻方法，一般是指在所述升华干燥和所述解析干燥之前，将所述含硫酸多黏菌素b的组合物进行冻结。
所述预冻的温度可为-45～-40℃，优选为-45℃。降温至所述预冻温度的时间可为0.2～1h；优选为0.5h。
所述预冻的时间可为4～6h，优选为4～5h。
其中，所述升华干燥可为本领域常规的升华干燥，一般是指一次干燥。
所述升华干燥的温度可为-25～-10℃，优选为-20℃。升温至所述升华干燥温度的时间可为0.5～2h；优选为1h。
所述升华干燥的真空度可为10～30pa，优选为30pa。
所述升华干燥的时间可为4～6h，优选为5h。
其中，所述解析干燥可为本领域常规的解析干燥，一般是指二次干燥。
所述解析干燥可分为解析干燥第一阶段和解析干燥第二阶段。
所述解析干燥第一阶段的温度可为0～5℃，优选为5℃。升温至所述解析干燥第一阶段温度的时间可为1～3h；优选为1h。
所述解析干燥第一阶段的时间可为3～5h；优选为3～4h。
所述解析干燥第一阶段的真空度可为10～30pa，优选为30pa。
所述解析干燥第二阶段的温度可为30～35℃，优选为35℃。升温至所述解析干燥第二阶段温度的时间可为1～3h；优选为1h。
所述解析干燥第二阶段的时间可为2～4h；优选为2～3h。
所述解析干燥第一阶段结束后，所述含硫酸多黏菌素b的组合物中水分含量较少，真空度过高会造成升华速率减慢，因此所述解析干燥第二阶段可适当掺气，开启有限量泄露，加快升华速率。所述解析干燥第二阶段的真空度可为20～30pa，优选为25pa。
其中，所述冻干处理的设备可为本领域常规的冻干处理设备，例如冻干机。
其中，所述冻干处理的总时间一般为16～29.5h，优选为17.5h。
本发明中，当所述冻干处理的设备为冻干机时，所述预冻可为在0.5h内将冷凝器的温度降温至-45℃以下，再将所述含硫酸多黏菌素b的组合物置于所述冻干机内，将所述冻干机的板层温度设置为-45～-40℃，预冻4～6h。
所述升华干燥可为将所述冻干机的真空度设置为10～30pa，并在0.5～2h内将所述冻干机的板层温度升温至-25～-10℃，升华干燥4～6h。
所述解析干燥第一阶段可为将所述冻干机的真空度设置为10～30pa，并在1～3h内将所述冻干机的板层温度升温至0～5℃，保温3～5h。所述解析干燥第二阶段可为开启有限量泄露，将所述冻干机的真空度设置为20～30pa，并在1～3h内将所述冻干机的板层温度升温至30～35℃，保温2～4h。
本发明中，当所述冻干处理的设备为冻干机时，所述预冻优选为在0.5h内将冷凝器的温度降温至-45℃以下，再将所述含硫酸多黏菌素b的组合物置于所述冻干机内，将所述冻干机的板层温度设置为-45℃，预冻4h。
所述升华干燥优选为将所述冻干机的真空度设置为30pa，并在1h内将所述冻干机的板层温度升温至-20℃，升华干燥5h。
所述解析干燥第一阶段优选为将所述冻干机的真空度设置为30pa，并在1h内将所述冻干机的板层温度升温至5℃，保温3h。
所述解析干燥第二阶段优选为开启有限量泄露，将所述冻干机的真空度设置为25pa，并在1h内将所述冻干机的板层温度升温至35℃，保温2h。
本发明提供的技术方案之四为：一种由上述方法制得的含硫酸多黏菌素b的冻干粉。
其中，冻干处理的过程中会除去所述含硫酸多黏菌素b的冻干粉中大部分的叔丁醇，仅有少量残留。叔丁醇的含量低于0.05％；所述百分比为叔丁醇占所述含硫酸多黏菌素b的冻干粉的质量百分比。
本发明提供的技术方案之五为：一种所述含硫酸多黏菌素b的组合物和/或所述含硫酸多黏菌素b的冻干粉作为注射制剂的应用。
本发明提供的技术方案之六为：一种注射用药物，其包括所述含硫酸多黏菌素b的组合物和/或所述含硫酸多黏菌素b的冻干粉。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明中的含硫酸多黏菌素b的组合物，结构致密均一、稳定性和复溶效果好；且本发明中的制备方法工艺简便易行。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例和对比例中硫酸多黏菌素b的商购来源为xelliapharmaceuticalsaps，干燥失重为2.3％，含量为8283u/mg。
实施例1～4和对比例1～4
实施例1～4和对比例1～3中含硫酸多黏菌素b的组合物、冻干粉的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：将叔丁醇加入800ml注射用水中，搅拌均匀，得到叔丁醇溶液；
将硫酸多黏菌素b溶解于叔丁醇溶液中，搅拌至完全溶解，得到混合液；
测量混合液的ph值，若混合液的ph值不为5.0～7.0，采用硫酸或氢氧化钠调节混合液的ph值至5.0～7.0，并用注射用水将调节ph值后的混合液定容至1000ml，得到含硫酸多黏菌素b的组合物；
将上述含硫酸多黏菌素b的组合物经过0.2μm微孔滤膜过滤除菌；
将上述除菌后的混合液按1ml/瓶灌装至西林瓶中，并用胶塞半压塞，得到半压塞好的样品；
其中，硫酸多黏菌素b和叔丁醇的浓度如下表1-1；处方量(以1ml/瓶，共1000瓶计)如表1-2。
步骤(2)：采用冻干机对步骤(1)中半压塞好的样品进行冻干处理；
预冻：开启冷凝器，0.5h将冷凝器温度降至-45℃以下，再将步骤(1)中半压塞好的样品置于冻干机内，设置冻干机的板层温度，预冻；其中，冻干机的板层温度和预冻的时间如下表2；
升华干燥：开启真空泵，设置冻干机的真空度；并在一定的时间内升温冻干机的板层温度，升华干燥；其中，升温所需时间、冻干机的板层温度和升华干燥的时间如下表2；
解析干燥第一阶段：在一定的时间内升温冻干机的板层温度，保温；其中，升温所需时间、冻干机的板层温度和解析干燥第一阶段的时间如下表2；
解析干燥第二阶段：在一定的时间内再次升温冻干机的板层温度，保温；其中，升温所需时间、冻干机的板层温度和解析干燥第二阶段的时间如下表2；
冻干处理后，制得冻干产品，冻干产品即为含硫酸多黏菌素b的冻干粉。
表1-1
表1-2
注：(1)表1-1的处方量中50000万单位硫酸多黏菌b为60.36g硫酸多黏菌b；
(2)表1-1的处方量中还可包括ph值调节剂氢氧化钠和/或硫酸，其用量可忽略不计。
(3)表1-1中，实施例1～4和对比例1～4制得的含硫酸多黏菌素b的组合物的ph值为6.0～7.0。
表2
其中，对比例1中未加入叔丁醇，将硫酸多黏菌素b溶解于注射用水中，搅拌至完全溶解，得到混合液(含硫酸多黏菌素b的组合物)；其他均同实施例1。
对比例2中未加入叔丁醇，将硫酸多黏菌素b溶解于注射用水中，搅拌至完全溶解，得到混合液(含硫酸多黏菌素b的组合物)；其他均同实施例2。
对比例3中叔丁醇的浓度小于本发明请求保护的范围；其他均同实施例2。
对比例4中叔丁醇的浓度大于本发明请求保护的范围，导致硫酸多黏菌素b无法完全溶解，因此未进行冻干处理。
效果实施例1
1.对实施例1～4和对比例1～4中硫酸多黏菌素b的溶解情况进行感官评价，其中，溶液澄清无浑浊为完全溶解；
2.对实施例1～4和对比例1～3中制得的冻干产品的外观进行感官评价；其中，当冻干产品的体积小于冻干前含硫酸多黏菌素b的组合物的体积时，冻干产品有收缩；
3.对实施例1～4和对比例1～3中制得的冻干产品在注射用水中进行复溶；测得冻干产品在注射用水中完全溶解的时间，即为复溶时间；
4.将实施例1～4和对比例1～3中制得的冻干产品溶解在注射用水中，按照《中国药典》2015版第四部第114页的不溶性微粒检查法中显微计数法测量溶液中不溶性微粒的数量；
5.按照《中国药典》2015版第四部第103页中的干燥失重测定法，测量实施例1～4和对比例1～3中制得的冻干产品的干燥失重；
6.采用气相色谱法测量实施例1～4和对比例3中制得的冻干产品的叔丁醇残留量。
结果如表3。
表3
由表3中可以看出，对比例3中叔丁醇的浓度为1.56g/l，小于本发明请求保护的范围，导致冻干产品有收缩，干燥失重和不溶性微粒的数量均较高，复溶时间也较长。对比例4中叔丁醇的浓度为39g/l，大于本发明请求保护的范围，导致硫酸多黏菌素b仅有部分溶解。而实施例1～4中叔丁醇的浓度在3～16g/l之间，能够保证硫酸多黏菌素b完全溶解，同时改善了冻干产品的外观，加快了冻干产品的复溶时间。
实施例1～4中的叔丁醇/水溶剂体系，在预冻时，叔丁醇可以改变水的结晶形态，形成针状结晶，具有更大的表面积，同时针状结晶升华后，留下管状通道，可大幅度减小水蒸气流动阻力，升华速率显著提高，加快冻干过程的传质过程，缩短冻干周期；而且叔丁醇作为冻干溶剂，能改变溶质的结晶方式，有利于升华干燥，因此冻干处理后制得的冻干产品更加疏松，有利于复溶。但是，由于硫酸多黏菌素b溶于水、不溶于醇类，因此本发明中特别选择了叔丁醇的浓度。
由上述实施例和对比例可以看出，与对比例1相比，实施例1中制得的冻干产品复溶时间更短，不溶性微粒的数量更少；实施例2～4中冻干处理的总时间可缩短8.5小时，且冻干产品的干燥失重无显著变化；
与对比例2相比，实施例2～4中冻干产品的干燥失重显著减少，可见叔丁醇可增加传质过程，冻干处理的总时间较短，且水分挥发更彻底，干燥失重更低。
以含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，叔丁醇的浓度为6.24g/l、9.36g/l、11.7g/l或14.08g/l，其他均同实施例2时，制得的冻干产品可实现与本发明实施例1～4相当的技术效果，复溶时间短，不溶性微粒的数量少，冻干处理的总时间较短，干燥失重低，叔丁醇残留量低。
效果实施例2
对实施例3～4和对比例1～2进行加速实验稳定性考察和长期实验稳定性考察；
按照《中国药典》2015版第四部第77页中的ph值测定法，测量实施例3～4和对比例1～2中混合液的酸度；
按照《中国药典》2015版第四部第111页中的溶液颜色检查法和113页中的澄清度检查法，观察实施例3～4和对比例1～2中制得的冻干产品的溶液的澄清度与颜色是否符合规定；
按照《中国药典》2015版第四部第103页中的干燥失重测定法，测量实施例3～4和对比例1～2中制得的冻干产品的干燥失重；
采用硫酸多黏菌素busp对照品(批号n1m425，每100mg中含b169.7mg、b215.9mg、b33.2mg、b1-ⅰ6.1mg)，按照高效液相法测得实施例3～4和对比例1～2中制得的冻干产品中多黏菌素b各组分的含量百分比；
采用高效液相面积归一化法，测得有关物质(总杂和单杂)的面积百分比；其中，总杂和多黏菌素b组分的面积百分比之和为100％。
按照《中国药典》2015版第四部第114页的不溶性微粒检查法中显微计数法，测量实施例3～4和对比例1～2中制得的冻干产品的不溶性微粒的数量；
按照《中国药典》2015版第四部第160页的抗生素微生物活性检定法，测得实施例3～4和对比例1～2中制得的冻干产品中硫酸多黏菌素b的含量百分比；
其中，加速实验的温度为25℃±2℃，湿度为60％rh±5％rh；结果如表4所示；
长期实验在冷藏条件下进行，温度为5℃±3℃；结果如表5所示。
表4
表5
由表4和表5中稳定性考察结果可知，与对比例1～2相比，本发明实施例3～4制得的冻干产品中硫酸多黏菌素b的含量更加稳定，6个月后甚至12个月后的冻干产品中硫酸多黏菌素b的含量变化仍然较小；且将本发明实施例制得的冻干产品中溶解在注射用水中其不溶性微粒明显少于对比例；可以看出本发明实施例中制得的冻干产品较为稳定。
本发明实施例1～2制得的冻干产品，以及以含硫酸多黏菌素b的组合物的体积为1l计，叔丁醇的浓度为6.24g/l、9.36g/l、11.7g/l或14.08g/l，其他均同实施例2时，制得的冻干产品均可实现与本发明实施例3～4相当的技术效果，稳定性较佳。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。