本发明涉及植物提取物应用领域,具体地说是一种细梗蔷薇愈伤细胞提取物及其在制备皮肤外用剂中的应用。
背景技术：
：蔷薇属植物种类繁多，不仅可以作为观赏植物引种于园林中，而且作为药用植物，其根、茎、叶和花皆可入药。但是，由于蔷薇的种子具有深度休眠特性，很难在当年萌发，使园林引种困难。所以利用植物组织培养细胞技术，可以在人工可控的和重复的条件下培养大量的植物细胞或愈伤组织，可以为人类提供酶制剂、医药制品、添加剂等相关原料，不占用土地及资源，克服了由于植物本身发芽或地理环境、气候、土壤等生长条件不同，造成的植物资源不能合理充分使用及药材质量不一缺点。细梗蔷薇（rosagraciliflorarehd.etwils），也叫刺栗子，多生于海拔3300-4500米的山坡、云杉林下或林边灌丛，仅在云南、四川、西藏和陕西的部分地区有分布。它花色艳丽，芬芳宜人，是极好的园林绿化材料，另外其根和果实可入药，不仅可以提高免疫能力，还在某些疾病上有着不可或缺的作用，是值得关注和深度开发的一种野蔷薇。植物组织(包括器官和细胞)次级代谢产物的研究已经进行了30多年。植物细胞培养能够产生高价值的次生代谢产物，在食品、药品和化妆品中具有广泛的应用前景。有研究报道一些植物细胞提取物（如葡萄，瑞士苹果等）应用于化妆品中，具有抗氧化，保护紫外损伤，抗炎、抗衰老等作用。但是目前还没有关于细梗蔷薇愈伤组织细胞在化妆品中的应用报道。cn106456526b涉及一种皮肤美白或皮肤皱纹改善用化妆品组合物,提到从白玫瑰花叶中提取了3,5-二-o-甲基-藤黄苷，用于美白/抗皱活性成分。蔷薇属植物在全世界范围内共有2个亚属、200多种，彼此间成分也有较大差异。该专利采用的是白玫瑰，属于栽培品种。该专利中提到的抑制酪氨酸酶活性是乙醇，丁醇和乙酸乙酯层析物及化合物3,5-二-o-甲基-藤黄苷，并未见水层也有抑制活性的数据，据此申请人根据专业技术知识推测是由于该化合物在水中的溶解性很差。技术实现要素：申请人之前已对细梗蔷薇进行了培育阶段的研究，如2019100603660一种细梗蔷薇的组织培养方法。经过后续研究检测发现，细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物对皮肤具有抗衰老和美白作用。具体地说，尤其是清除皮肤自由基、及增加皮肤细胞增殖、及保护皮肤细胞氧化损伤、及保护皮肤细胞遭uva造成损伤的抗衰老活性成分；以及抑制人源表皮黑色素细胞b16的酪氨酸酶活性和黑色素的生成量的美白活性成分。在皮肤外用剂中，所述的细梗蔷薇愈伤细胞提取物的含量为0.001％-1％，较佳地为0.1％-1％，所述的百分比是指所述的细梗蔷薇愈伤细胞提取物的质量占所述的皮肤外用剂总质量的百分比。前述细梗蔷薇愈伤细胞培养方法为固体培养和液体培养中的任意一种。其中固体培养包括下述步骤：a、取试剂ms培养基，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），激动素（kt），蔗糖，琼脂，水；b、根据ms、2,4-d3.0mg/l、kt0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l，以水为溶剂配制成培养基；c、所述固体培养基的ph值调节至5.7-5.8，在灭菌锅内121℃条件下灭菌20min，制得固体培养基；d、在培养容器内，加入10%-20%瓶体积的固体培养基，待固体培养基凝固后，接种培养基体积1%-2%的愈伤组织细胞，培养条件为温度19-21℃，湿度60%-75%，光照强度1500lx-2000lx，每天光照12小时；e、培养20天后收获细梗蔷薇愈伤细胞。其中液体培养包括下述步骤：a、取试剂ms培养基，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），激动素（kt），蔗糖，水；b、根据ms、2,4-d3.0mg/l、kt0.5mg/l、蔗糖30g/l，以水为溶剂配制成培养基；c、所述培养基的ph值调节至5.7-5.8，在灭菌锅内121℃灭菌20min制得液体培养基；d、在培养容器内，加入20%-30%瓶体积的液体培养基，接种液体培养基体积1%-2%的愈伤组织细胞，放入摇床内培养，温度为24-26℃，转速110r/min；e、培养20天后收获细梗蔷薇愈伤细胞。前述水选用去离子水或冰川水，所述冰川水取自喜马拉雅山北坡的多吉曲登尼玛，海拔5128米：依前述固体培养或液体培养所得的细梗蔷薇愈伤细胞的提取包括下述步骤：a、称取细梗蔷薇愈伤细胞，研磨破碎；b、加入细梗蔷薇愈伤细胞5倍体积的去离子水，浸没搅拌；c、500w超声提取2次，每次30min，5000rmp离心10min，取上清过滤，滤液合并；d、冷冻干燥，得到细梗蔷薇愈伤细胞提取物。本发明的优点在于经实验发现细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物对于皮肤细胞的清除皮肤自由基、及增加皮肤细胞增殖、及保护皮肤细胞氧化损伤、及保护皮肤细胞遭uva造成损伤，及抑制人源表皮黑色素细胞b16的酪氨酸酶活性和黑色素的生成量的作用。因此将细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物应用于皮肤外用剂中作为抗衰老和美白活性成份。另外，利用细梗蔷薇愈伤组织细胞作为原料，具有无限增值、每批次间质量稳定、培养周期短、对环境友好且无关季节易批量培育的优势，可在不破坏植物体本身的情况下进行生产制作，对于植物资源的可持续发展和利用具有很大价值和意义。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例一，细梗蔷薇愈伤细胞的培养1、固体培养取试剂ms培养基，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），激动素（kt），蔗糖，琼脂，冰川水，按照配方ms+2,4-d3.0mg/l+kt0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l配制成培养基后，调节至ph5.7-5.8，在灭菌锅内121℃灭菌20min备用。在培养瓶内接种适量愈伤组织细胞，本实施例中，根据pc培养瓶270ml的容量，选择接种0.3-0.5g细梗蔷薇愈伤组织细胞。培养条件为温度20±1℃，湿度60%~75%，光照强度1500lx~2000lx，每天光照12小时，培养20天后收获细胞。2、液体培养取试剂ms培养基，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），激动素（kt），蔗糖，冰川水，按照配方ms+2,4-d3.0mg/l+kt0.5mg/l+蔗糖30g/l配制成培养基后，调节ph5.8左右，在灭菌锅内121℃灭菌20min备用。在培养瓶内接种适量愈伤组织细胞，本实施例中根据三角瓶100ml的容量，接种0.3g-0.5g的愈伤组织细胞，再加入30ml液体培养基，放入摇床内培养，温度为25±1℃，转速110r/min，培养20天后收获细胞。其中，上述冰川水作为制备培养基的溶剂，也可替换为去离子水。实施例二、细梗蔷薇愈伤细胞的提取1、细梗蔷薇愈伤细胞的提取分别称取实施例一中培育得到的细梗蔷薇愈伤细胞，各称取10g，研磨破碎，加入5倍体积的去离子水，浸没搅拌，500w超声提取2次，每次30min，5000rmp离心10min，取上清过滤，滤液合并，冷冻干燥，得到提取物后，称重并计算产率（见表1）。其中，下述批次是指同样的实验条件下，在不同时期收取的样品。表1细梗蔷薇愈伤细胞的提取产率2、细梗蔷薇愈伤细胞提取物中多酚含量的测定总多酚含量用folin-ciocalteu方法，以没食子酸为对照品进行检测。取0.1ml没食子酸标准液和待测样品溶液，平行3次，加入0.5ml10%folin-ciocalteu试剂,混合，室温放置5min后加入0.4ml7.5%naco3溶液，混合后室温放置60min，测定765nm的od值。由标准液各管od520对没食子含量作标准曲线，根据标准曲线计算样品中多酚含量（见表2）。表2细梗蔷薇愈伤细胞的多酚含量样品多酚含量（%）固体培养-批次11.55固体培养-批次21.19固体培养-批次31.35固体培养-批次41.59液体培养-批次11.48液体培养-批次21.41实施例三、细梗蔷薇愈伤细胞提取物测试1、细梗蔷薇愈伤细胞提取物对自由基清除率的影响1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph）是一种稳定的氮中心有机自由基。dpph法于1958年被提出，广泛用于地量测定生物试样、分类物质和食品的抗衰老能力。此法是根据dpph自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗衰老能力。取提取物样品溶液0.lml加入试管中，再加入0.1mldpph乙醇溶液，混匀，室温下避光在黑暗处反应30min，在525nm处测定od值，按照下面公式计算清除率：清除率i(％)＝[1-(t-t0)/(c-c0)]×100％，式中：t0：0.1ml样品液加0.1ml95％乙醇的吸光度；t：0.1ml样品液加0.1mldpph溶液的吸光度；c0：0.1ml水加0.1ml95％乙醇的吸光度；c：0.1ml水加0.1mldpph溶液的吸光度。由表3结果可知，细梗蔷薇愈伤细胞提取物有一定的清除自由基的作用。表3细梗蔷薇愈伤细胞的dpph清除率样品测试浓度（mg/ml）dpph清除率（%）固体培养-批次10.556固体培养-批次20.545固体培养-批次30.549固体培养-批次40.560液体培养-批次10.550液体培养-批次20.5482、细梗蔷薇愈伤细胞提取物对皮肤细胞增殖的影响角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的皮肤。制备的样品用去离子水或者dmso配制成溶液，加入到人永生化表皮hacat细胞或者人原代成纤维细胞（fb）培养液中，以不含样品的溶剂为空白对照。培养48小时后，用mtt法对细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度，空白对照的增殖率为100%，参比空白对照，评估对hacat或者fb细胞增殖的影响。其中，上述人永生化表皮hacat是永生化的人角质形成细胞系，因其细胞形态、功能和正常人角质形成细胞类似，且至少可以传140代，故被大量应用于科研中；相比细胞系，人原代成纤维细胞更能模拟人体皮肤功能。由表4结果可知，细梗蔷薇愈伤细胞提取物对皮肤细胞表皮hacat细胞和成纤维细胞都有一定的增殖促进作用。表4细梗蔷薇愈伤细胞对皮肤细胞增殖的影响样品测试浓度(mg/ml)hacat细胞增殖率（%）fb细胞增殖率（%）阳性对照（小牛血清）50120140固体培养-批次10.1103113固体培养-批次20.1109115固体培养-批次30.1108118固体培养-批次40.1110122液体培养-批次10.1105110液体培养-批次20.1106112固体培养-批次10.5109139固体培养-批次20.5115145固体培养-批次30.5118132固体培养-批次40.5120148液体培养-批次10.5110135液体培养-批次20.51131373、细梗蔷薇愈伤细胞提取物对皮肤细胞氧化损伤的保护作用自由基可以从细胞水平、分子水平乃至组织器官水平上对机体造成各种不可逆性的氧化性损伤，加速生物体细胞乃至整个机体的衰老进程，诱发各种与衰老相关的疾病。过氧化氢(hydrogenperoxide，h202)是细胞内一种重要的氧自由基，对人体皮肤细胞能造成直接的氧化应激反应和氧化应激所致的氧化性损伤。在体外利用h202能够诱导并加速细胞因氧化应激所致的衰老进程，模拟体内氧化损伤的病理过程。人永生化表皮hacat细胞，以5000个/孔种于96孔板中，37°c的5%co2细胞培养箱中培养72小时。样品处理前细胞换成不含血清的饥饿培养基培养6小时，之后细胞在含有样品的饥饿培养基中培养24小时。然后换成含有过氧化氢（h2o2）500um的饥饿培养基处理1h，再换成含有待测样品的培养基，继续培养24小时，用mtt法检测细胞活力。用没有h2o2处理的做为对照组（-）。用ve作为阳性对照。由表5结果可知，细梗蔷薇愈伤细胞提取物对双氧水造成的细胞氧化损伤有明显的保护作用。表5细梗蔷薇愈伤细胞对皮肤氧化损伤的保护作用样品测试浓度(mg/ml)细胞活力（%）空白对照（无h2o2处理）-100空白对照（h2o2处理）-65阳性对照ve174固体培养-批次10.173固体培养-批次20.183固体培养-批次30.172固体培养-批次40.177液体培养-批次10.175液体培养-批次20.176固体培养-批次10.580固体培养-批次20.584固体培养-批次30.592固体培养-批次40.590液体培养-批次10.583液体培养-批次10.5854、细梗蔷薇愈伤细胞提取物的紫外损伤保护作用皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(ultravioletuv)照射是外源性老化形成的主要因素,所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是uva（320nm-400nm）和少量的uvb（280-320nm）。许多资料表明照射到皮肤的的紫外线95%是由角质形成细胞吸收，因此我们用uva照射人永生化表皮hacat细胞建立皮肤的光损伤模型，利用该模型评估活性物对皮肤紫外损伤的保护作用。人永生化表皮hacat细胞，以5000个/孔种于96孔板中，37°c的5%co2细胞培养箱中培养72小时。样品处理前细胞换成不含血清的饥饿培养基培养6小时，之后细胞在含有样品的培养基中培养24小时。将培养基换成pbs后，uva（365nm）辐照，剂量为10j/cm2。再加入含有待测样品的培养基，继续培养24小时，用mtt法检测细胞活力。用没有uva辐照组做为对照组（uva-）,uva辐照组作为对照组(uva+)。用vc作为阳性对照。由表6结果可知，细梗蔷薇愈伤细胞提取物对uva造成的细胞损伤有明显的保护作用。表6细梗蔷薇愈伤细胞对皮肤uva损伤的保护作用样品测试浓度（mg/ml）细胞活力（%）空白对照（无uva处理）-100空白对照（uva处理）-87阳性对照vc0.1111固体培养-批次10.191固体培养-批次20.1100固体培养-批次30.194固体培养-批次40.199液体培养-批次10.190液体培养-批次20.189固体培养-批次10.595固体培养-批次20.597固体培养-批次30.599固体培养-批次40.5101液体培养-批次10.596液体培养-批次20.5975、细梗蔷薇愈伤细胞提取物的美白作用近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。人表皮中位于基底层的黑素细胞与周围的角质形成细胞接触并发生联系，构成“表皮黑素单元”，其中黑素是一种含氮的复合物,在黑素小体中进行合成。一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。皮肤的颜色来自于角质形成细胞内存储的黑色素。一般来讲，存储黑色素多的人肤色更深，也更受到保护，远离阳光辐射。黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。酪氨酸酶是结构复杂的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。在人体中酪氨酸酶是皮肤合成黑色素的关键酶。采用l-dopa氧化法测定样品对酪氨酸酶的抑制作用。小鼠黑色素瘤b16细胞以1×105密度培养在96孔板中，经24h后，将提取物的样品粉末用pbs溶解后过滤除菌，加入到细胞中培养48h,去掉培养液，每孔加入含1%tritonx-100的pbs缓冲液100μl，然后加入50μl0.2mg/ml的l-dopa，37℃处理3h后再测定490nm的吸光值。按如下公式计算酶活力：酪氨酸酶抑制率=[1-(实验组od值/对照组od值]×100%。同时用mtt法测定样品对b16细胞的活力影响。采用naoh裂解法测定细胞内黑色素的含量。小鼠黑色素瘤b16细胞以1x105密度培养在12孔板中，经24h后，将提取物的样品粉末用pbs溶解后过滤除菌，加入到细胞中，培养48h弃去上清液，胰酶消化后离心收集细胞到离心管，加入150μl的1mol/l的naoh溶液(含10%dmso),在80℃条件下充分裂解细胞1h,测定405nm的吸光值。b16细胞的蛋白浓度以bca法测定，用于吸光值的校正。数据统计以对照组的百分比表示。由表7结果可知，细梗蔷薇愈伤细胞提取物对b16细胞活力没有影响，但是能够抑制b16细胞的酪氨酸酶活性和黑素生成。表7细梗蔷薇愈伤细胞对小鼠黑色素瘤b16细胞酪氨酸酶活力和黑素生成的影响实施例四、含有细梗蔷薇愈伤细胞提取物的皮肤外用剂取实施例二中所制备的细梗蔷薇愈伤细胞提取物，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述细梗蔷薇愈伤细胞提取物在皮肤外用剂中的重量百分比是0.001％-1％，优选0.1%-1%。以下是细梗蔷薇愈伤细胞提取物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，以下各表中“-”表示无添加。1、含有细梗蔷薇愈伤细胞提取物的化妆水取实施例二中所制备的细梗蔷薇愈伤细胞提取物，用于制备具有抗衰老、美白作用的化妆水，所述化妆水含有的组分如表8所示：表82、含有细梗蔷薇愈伤细胞提取物的精华液取实施例二中所制备的细梗蔷薇愈伤细胞提取物，用于制备具有抗衰老、美白作用的精华液，所述精华液含有的组分如表9所示：表93、含有细梗蔷薇愈伤细胞提取物的乳液/霜取实施例二中所制备的细梗蔷薇愈伤细胞提取物，分别用于制备具有抗衰老、美白作用的乳液/霜，所述乳液/霜含有的组分如表10所示：表10上述实验中，细梗蔷薇愈伤组织细胞由实验室从云南香格里拉的细梗蔷薇中诱导而来，冰川水采集自喜马拉雅西藏曲登尼玛，当地的多吉曲登尼玛泉位于喜马拉雅山北坡，海拔5128米，其泉口温度常年保持在1.5-2℃，所用ms培养基及植物生长素购自phytotech公司，蔗糖及琼脂购自国药公司。其中，野生细梗蔷薇果实，由中央民族大学龙春林教授采集自云南香格里拉，该物种被鉴定为细梗蔷薇(rosagraciliflora)；冰川水采集自喜马拉雅山北坡的多吉曲登尼玛，该处海拔5128米，水源温度常年保持在1.5-2℃。至此，以上述实施例为中心而对本发明技术方案进行了说明。但本领域技术人员应理解可做出多种改动和其要素可被等价物所替代而不会背离本发明的范围。此外，可对本发明的教导做出许多改变以适应特定情况或测量而不会背离本发明的基本范围。因此，所公开的实施例并非出于限定性观点，而是旨在说明。也因此，意味着本发明不受限于所公开的作为预期实施本发明的最佳方式的特定实施方式，而是所述发明包括落入所附权利要求范围内的所有实施方式。当前第1页12