含包封有PLP依赖性酶及其辅助因子的红细胞的药物组合物的制作方法
本申请是申请号为201580007812.1，申请日为2015年02月12日，发明名称为“含包封有plp依赖性酶及其辅助因子的红细胞的药物组合物”的专利申请的分案申请。
本发明涉及一种含plp依赖性酶(例如蛋氨酸酶)及其辅助因子(可选)，磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，plp或p5p)，和/或plp的磷酸盐前体或非磷酸盐前体的药物组合物，其作为药物的用途，其生产方法，以及与其相关的治疗方法。
背景技术：
磷酸吡哆醛(plp)为一种维生素b6衍生物，而且是一种用于多种酶的辅助因子。plp依赖性酶(本文称“plp酶”)为大约由145种不同酶组成的酶群，这些酶中的大部分参与氨基酸转化代谢途径。这些酶可催化的反应包括脱羧、转胺或进一步的脱除反应(《percudaniandperrachi,emboreportsvol.4no.9,2003》)。
由于plp酶群含有大量的酶，以及由于这些酶可催化各种反应，已有研究对其在人类治疗中的潜在用途进行了调查。在plp酶相关的各种治疗介入可能性当中，其在癌症和心血管病症治疗方面的用途已成为许多研究的课题(《el-sayedandshindia基因治疗靶点(targetsingenetherapy)prof.yongpingyoued.,2011》)。更具体而言，蛋氨酸酶因其在消耗血浆蛋氨酸及诱发蛋氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的凋亡方面的作用而受到关注。已有证据表明，许多人肿瘤细胞在当培养基中的蛋氨酸由其前体高半胱氨酸取代时无法增殖，而正常细胞却具有在此培养基中增殖的能力。从乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤中衍生的细胞系中，可明显观察到这种对蛋氨酸的依赖性(《durandoetal.,bullcancer2008；95(1):69-76》)。
尽管plp酶已在治疗方面得到关注，但是在为这些酶开发基于全身给药途径的治疗方法时却受到下述各显著限制：
·plp酶主要从原核生物中获得，因此当将其给药于人时会表现出强烈的免疫原性；
·其在血浆中的半衰期很短，为了获得足够的活性，需要频繁或大剂量给药；
·plp辅助因子在血浆中的生物利用率较低，从而使得其活性在给药后迅速下降。
对于蛋氨酸酶，上述限制已得到广泛报道。sun等根据提取自恶臭假单胞菌的蛋氨酸酶基因编码，在大肠杆菌中制成了重组蛋氨酸酶。通过该方式获得的酶被命名为rmetase，并静脉注射至免疫缺陷小鼠体内。注射后24小时，在未添加plp的情况下对上述酶的血浆活性进行体外测定的结果为未测出，从而说明其作用时间较短(《sunetal.癌症研究(cancerresearch)63,8377-8383,2003》)。
一年后，同一研究组公布了rmetase在猕猴体内的给药结果(《yangetal.临床癌症研究(clinicalcancerresearch)vol.10,2131-2138,2004》)。在该研究中，将剂量为1000、2000和4000单位/千克的rmetase静脉给药于6只猕猴。第一次注射28天后进行第二次注射，结果导致两只猕猴发生过敏性休克，并最终导致其中的一只猕猴死亡。此外，在大多数(6只中的4只)给药猕猴体内，rmetase的免疫原性导致生成igg型(主要型)和igm型抗rmetase抗体。之后，通过体外方式对这些抗体的中和能力进行了表征。
为了克服其所制蛋氨酸酶的半衰期短和免疫原性限制，上述文章作者们随后提出对该酶进行聚乙二醇化。聚乙二醇(peg)接枝是一种用于增加治疗性蛋白质半衰期及降低其免疫原性的已知技术。如此，通过在rmetase存在时加入peg衍生物，获得了peg-rmetase。此种酶修饰方式使得，小鼠体内的半衰期从游离酶的2小时增加至peg-rmetase的38小时。此外，在半衰期显著增加的同时，免疫原性也获得降低(《sunetal.癌症研究(cancerresearch)63,8377-8383,2003》)。
如果聚乙二醇化已部分解决了半衰期和免疫原性问题，那么plp酶剩下的主要问题即为：血浆中辅助因子的生物利用率较低。plp酶在其辅助因子plp的存在下才具有催化活性，下文中称此为全酶。注射后，全酶因失去plp辅助因子而迅速转化为不具活性的脱辅基酶蛋白。
以外源方式进入的plp迅速变得不能为酶所用，且游离plp的血浆半衰期大约仅为15分钟。此现象已在酪氨酸酚解酶(tyrosinephenol-lyase，tpl)这一plp酶中得到证实。elmer等(《癌症研究(cancerresearch)38；3663-3667,1978》)在将提纯后的tpl注射入正常小鼠体内。注射后5个小时，采取血样，以测定tpl的活性。此活性测定按照以下两个条件进行：样品中的一部分测定时不添加plp；另一部分测定时在测定反应混合物内添加最佳量的plp(这些条件分别反映了该酶在血浆中的实测活性以及当其在与plp辅助因子接触时的潜在活性)。所得结果比较后发现，tpl的血浆实测活性仅为其潜在活性的7％。此外，针对另一组小鼠也进行了相同实验，其中，在注射tpl的同时，还给予大量plp，并在其后每隔一小时注射一次plp。在此情形中，测定结果比较后发现，血浆实测活性为其潜在活性的37％。由此可见，plp共同给药可有限地提高血浆中的tpl活性。然而，以外源方式提供的plp迅速变得不能为tpl所用，且游离plp的血浆半衰期大约仅为15分钟。因此，靠反复注射plp溶液的方式提供plp血浆水平的做法不可行。elmer等提出，在臀部肌肉内注射鲸蜡和花生油构成的植入物，以实现在更长时间内提供plp。然而，此方案被证实不具说服力，其未能将血浆实测活性提高至潜在活性的25％以上，而且其未能以有统计学意义的方式提高tpl在植入黑色素瘤b-16的小鼠中的抗肿瘤效果。类似观察结果同样见于使用蛋氨酸酶的情形。sun等(《癌症研究(cancerresearch)63,8377-8383,2003》)已查明，全酶plp-rmetase在体外相对稳定，但是，此络合物在体内迅速解离，从而导致rmetase失去活性。该文作者们还证明，当通过植入plp泵(plp连续给药泵)补充plp时，可提高使用rmetase和peg-rmetase时的蛋氨酸消耗时间。然而，此连续给药装置将不可避免遇到血浆中plp生物利用率低的问题。
由此可见，虽然plp酶的治疗潜力已成为许多研究工作的课题，具体而言，已使蛋氨酸酶应用于试点临床试验，但仍未能证实这些酶的临床疗效。
因此，为了实现利用plp酶治疗潜力的目的，当具有一种可将这些酶保持于存在最佳可用量plp的环境中的解决方案时比较有利。
目前，已有各种将活性成分掺入红细胞的方法得到报道。在这些方法中，最广为人知的是所谓的溶解-再封技术。此技术包括三个备选方案，分别为低渗透析、低渗“预膨胀”及低渗稀释，所有这些方案均基于红细胞内外之间的渗透压差。这些备选方案具有以下五个共同步骤：洗涤浓缩红细胞并使用生理缓冲液将其离心一次或数次；将红细胞与低渗液体介质接触，以打开红细胞膜孔；活性成分进入红细胞；利用高渗缓冲液将上述膜孔闭合(“再封”)，从而将活性成分封闭于红细胞内；将后者悬浮于保存液内。低渗透析技术为当中最受瞩目的技术，而且已成为工业开发的课题。ep1773452中描述的技术是当前最为高效的一种技术，其具有可重现及提高活性成分包封率的优点。
将酶包封于红细胞内，以期限制与该酶免疫原性相关的风险以及延长其半衰期的这一做法已在相关研究工作中作为已发表科学论文的课题提出。ep1773452中描述了l-天冬酰胺酶的包封，ep1874341描述了精氨酸脱亚胺酶的包封。
上述研究不涉及需要辅助因子的酶，且并未解决与plp酶及其plp辅助因子的动力学相关的复杂性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种含有plp酶的药物组合物，该组合物可在将所述酶置于存在最佳可用量的其plp辅助因子的环境中的同时，还可限制与该酶免疫原性相关的风险，并延长其半衰期。
因此，本发明的目的为一种药学上可接受的载体中的红细胞悬浮液，或一种包括红细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，所述红细胞内包封有plp酶。下文中，将所述悬浮液和药物组合物同等地称为组合物。“包封”是指所述活性成分(酶、辅助因子(可选)和/或其他分子)基本上或完全位于内部。“基本上”是指所述活性成分的一小部分可仍截留于细胞膜内。
所述组合物尤其含有每毫升红细胞内0.01mg～30mg，优选0.05mg～10mg的plp酶。
根据第一实施方式，所述plp酶为蛋氨酸酶，也尤其称为l-蛋氨酸酶，蛋氨酸γ-裂解酶(methioninegammalyase，mgl)，ec编号为4.4.1.11，cas编号为42616-25-1。为了对可根据本发明使用的蛋氨酸酶源进行说明，尤其可提到的是已发表文章《elsayeda，appliedmicrobiol.biotechnol.(2010)86:445-467》。
根据第二实施方式，所述plp酶为酪氨酸酚解酶，或称tpl，ec编号为4.1.99.2，cas编号为cas9059-31-8。有关于此，可参考《h.kumagaietal.,j.biol.chem.245,7:1767-72and245，7:1773-7》。
根据第三实施方式，所述plp酶为酪氨酸氨基移转酶(tyrosineaminotransferase，htatase)，ec编号为2.6.1.5，cas编号为9014-55-5。有关于此，可参考《r.rettenmeieretal.,nucleicacidsres.1990,18,13:3583-61》。
根据第四实施方式，所述plp酶为胱硫醚β-合酶，或称合酶，ec编号为4.2.1.22，cas编号为9023-99-8。有关于此，可参考《j.krausetal.,j.biol.chem.1978，253,18:6523-8》。
所述组合物还可包括所述酶的辅助因子(即plp)和/或plp的前体，该前体可以为非磷酸盐前体(例如维生素b6的非磷酸盐形式)和/或磷酸盐前体(如磷酸吡哆醇(pyridoxinephosphate，pnp))。
维生素b6以磷酸盐或非磷酸盐的不同形式存在。磷酸吡哆醇(pnp)、磷酸吡哆醛(plp)和磷酸吡哆胺(pyridoxaminephosphate，pmp)均为其磷酸盐形式。相应非磷酸盐形式为吡哆醇(pn)、吡哆醛(pl)和吡哆胺(pm)。维生素b6的所述各非磷酸盐形式可穿过红细胞膜，且仅能以非常困难的方式穿过。在红细胞内的主要转化路径中(如《andersonetal.j.clin.invest.1971,vol.50,1901-1909》中所述)，吡哆醇(pn)在pn激酶的作用下转化为pnp，pnp之后在pnp氧化酶的作用下转化为plp。随后，plp可在plp磷酸酶的作用下转化为吡哆醛(pl)，而pl之后即可脱离红细胞。容易理解，所提供的前体可在所述组合物的制备方法或储存过程中在红细胞内经历上述各转化过程。
本文所称维生素b6的非磷酸盐形式是指pl、pn和pm这三种维生素b6的“同效形式”中的一种，或两种或三种同效形式的混合物。其中，pn为首选形式。此外，其也可为盐的形式。
所述组合物包括包封于红细胞内的plp。所述plp可在包封过程中提供，或者完全或部分从位于所述红细胞内的其前体中获得。所述提供或形成的plp可与所述酶结合。因此，所述组合物可包括相应的全酶，例如蛋氨酸酶-plp。在上述条件下，所述活性酶的半衰期，例如以其底物的血浆中消耗时长的观察结果而论，获得显着增加。本发明组合物可将给药后的酶活性保持24小时以上，尤其保持1天、5天、10天或15天或更长时间。酶活性尤其指底物在血浆中20％、30％、40％或50％的消耗率。
因此，在一种实施方式中，所述组合物包括：磷酸吡哆醛(plp)和/或维生素b6的非磷酸盐形式和/或磷酸盐前体；磷酸吡哆醇(pnp)；和/或磷酸吡哆胺(pmp)。
根据一个特征，pnp和/或pmp包封于所述组合物内的红细胞内部。所述前体可与上述酶共同包封，或者完全或部分从位于所述红细胞内的其本身的前体中获得。
所述组合物尤其包括每升(l)红细胞内的约0.05μmol～约600μmol，尤其约0.5μmol～约100μmol，优选约5μmol～约50μmol的包封plp和/或pnp和/或pmp。
根据一个特征，所述组合物包括：包封有所述plp酶和plp的红细胞；以及非磷酸盐plp前体，该非磷酸盐plp前体包封于所述红细胞内，或处于所述红细胞内部，或既处于所述红细胞内部也处于其外部。所述非磷酸盐前体可以为pn、pl或pm，优选为pn，或者为这些化合物中的两种或三种的混合物。所述非磷酸盐前体可处于所述红细胞内部和/或外部。所述非磷酸盐前体的存在，可达到比该非磷酸盐前体不存在时显著提高的红细胞内plp水平。
在一种实施方式中，所述组合物包括：包封有所述plp酶、plp以及plp的一种磷酸盐前体的红细胞，pnp，plp和/或pmp。此外，如上所述，这一组合物还可有利地包括一种非磷酸盐前体，尤其为pn。
优选地，本发明组合物具有大于或等于35％、40％或45％的红细胞比容。
根据一种实施方式，所述组合物包括红细胞和药学上可接受的载体，所述红细胞包封有用于同时、分别或贯序给药的：plp酶，例如蛋氨酸酶；以及非磷酸盐形式的维生素b6，优选pn。所述组合物可尤其为试剂盒形式，分开地包括：所述红细胞(悬浮液)；以及所述非磷酸盐形式的维生素b6，优选pn(溶液)。根据一种实施方式，所述药学上可接受的载体为红细胞“保存液”，该保存液为一种溶液，在该溶液内，包封有活性成分的红细胞以合适的形式悬浮，以待注射。优选地，保存液包括至少一种促进所述红细胞保存的试剂，该试剂尤其选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇。有利地，所述保存液含有可抑制所述红细胞内plp磷酸酶的无机磷酸盐。
所述保存液可以为水溶液，该水溶液包括氯化钠，腺嘌呤以及选自葡萄糖、右旋糖和甘露醇的至少一种化合物。根据一个特征，其还包括无机磷酸盐。
所述保存液可包括氯化钠、腺嘌呤和右旋糖，且优选为as3培养基。根据一个特征，其还包括无机磷酸盐。
所述保存液可包括氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖和甘露醇，且优选为sag-甘露醇培养基或adsol培养基。根据一个特征，其还包括无机磷酸盐。
具体而言，保存液内的所述组合物或悬浮液的特征在于，在72小时时，细胞外血红蛋白水平保持于小于或等于0.5g/dl，尤其为0.3g/dl，更尤其为0.2g/dl，优选为0.15g/dl，更佳为0.1g/dl，而且保存温度为2～8℃。
具体而言，保存液内的所述组合物或悬浮液的特征在于，在24小时～20天，尤其在24小时～72小时的时间段内，细胞外血红蛋白水平保持于小于或等于0.5g/dl，尤其为0.3g/dl，更尤其为0.2g/dl，优选为0.15g/dl，更佳为0.1g/dl，而且保存温度为2～8℃。
所述细胞外血红蛋白水平由《g.b.blakneyanda.j.dinwoodie,clin.biochem.8,96-102,1975》中所述的手动基准方法测定时比较有利。此外，也存在以特定灵敏度实施上述测定的自动装置。
具体而言，保存液内的所述组合物或悬浮液的特征在于，在72小时时，红细胞溶解率保持于小于或等于2％，尤其为1.5％，优选为1％，而且保存温度为2～8℃。
具体而言，保存液内的所述组合物或悬浮液的特征在于，在24小时～20天，尤其在24小时～72小时的时间段内，以及2～8℃的温度下，红细胞溶解率保持于小于或等于2％，尤其为1.5％，优选为1％。
具体而言，所述悬浮液的红细胞比容大于或等于35％，40％，45％。
根据一种具体方法，维生素b6在红细胞内的代谢方式被修饰为，通过提高pn激酶和pnp氧化酶的红细胞内水平，和/或通过降低plp磷酸酶的红细胞内水平，提高红细胞内plp浓度。
根据一个特征，除了所述例如为蛋氨酸酶的plp酶以及plp或其前体，所述组合物还包括pn激酶，和/或pnp氧化酶，和/或plp磷酸酶抑制剂。这些酶或试剂既可包封于所述红细胞内，也可同时存在于该红细胞内部和外部。
所述(各)酶或试剂也可单独给药，尤其当所述非磷酸盐维生素b6制剂分离于所述红细胞悬浮液之外时，通过与该制剂混合的方式给药。
因此，本发明的目的在于用作药物的此类组合物。
本发明的目的尤其为一种药物，该药物可为对其有需求的患者提供处于良好生物利用率条件下的plp酶及其辅助因子，所述良好生物利用率是指，该酶及其辅助因子相互间可以有效量为对方所用，从而使得该酶在治疗应用中具有活性且有效。所述药物的目的尤其为，消耗或降低所述酶的底物在血浆或循环中和/或器官内的浓度。
根据第一分目标，所述药物包括蛋氨酸酶，且可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中的蛋氨酸。该药物为一种抗癌药物，其可治疗癌症，尤其含蛋氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的癌症，更尤其为乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤。
根据第二分目标，所述药物包括蛋氨酸酶，且可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中或肝内的高半胱氨酸。该药物可治疗同型胱氨酸尿症，和/或高同型半胱氨酸血症，和/或中枢神经系统、视觉系统和/或骨骼的相关病症，例如心血管疾病。
根据本发明第三分目标，所述药物包括tpl，且可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中的酪氨酸。该药物为一种抗癌药物，其可治疗癌症，尤其含酪氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的癌症，更尤其为黑色素瘤。
根据本发明第四分目标，所述药物含有htatase，且可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中或肝内的酪氨酸。该药物可治疗与上述plp酶的缺乏相关的罕见疾病，尤其里奇纳-汉哈特(richner-hanhart)综合征(酪氨酸血症ii型)。
根据本发明第五分目标，所述药物含有胱硫醚β-合酶，且可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中或肝内的高半胱氨酸。该药物可治疗同型胱氨酸尿症，和/或高同型半胱氨酸血症，和/或相关病症，例如心血管疾病、中枢神经系统疾病、视觉系统疾病和/或骨骼疾病。
本发明还涉及一种药物组合物的制备方法，所述药物组合物包括包封有plp酶(如蛋氨酸酶)的红细胞，药学上可接受的载体，磷酸吡哆醛(plp)，并可选包括磷酸盐或非磷酸盐plp前体，该方法包括如下步骤：可选但优选地，使用生理缓冲液洗涤红细胞团块并将其离心一次或数次；使红细胞悬浮液与低渗液体介质接触，以打开红细胞膜孔；在所述膜孔打开之前或之后，使所述红细胞悬浮液与所述plp依赖性酶(如蛋氨酸酶)接触；该plp酶(如蛋氨酸酶)进入红细胞内；利用等渗或高渗(优选高渗)缓冲液使所述膜孔封合，并收集含所述plp酶(如蛋氨酸酶)的再封红细胞悬浮液；可选地，温育所述红细胞悬浮液，以除去脆性最高的红细胞；洗涤所述红细胞悬浮液并使用保存液对其进行调节，其中，在所述方法中：
-所述plp和/或plp的磷酸盐前体(如存在)与所述plp酶(如蛋氨酸酶)共同包封，
-所述plp的非磷酸盐前体(如存在)在所述膜孔打开之前或之后加入至所述红细胞悬浮液内，而且/或者
-所述plp的非磷酸盐前体(如存在)在所述温育过程中加入，或者加入所述保存液中。
优选地，一些plp与所述plp酶共同包封；至少一种非磷酸盐前体，例如pn、pl和/或pm，在所述膜孔打开之前和/或之后，并且/或者在所述温育过程中加入所述红细胞悬浮液内，并且/或者加入至所述保存液中。优选地，所述非磷酸盐前体为pn。
所述红细胞悬浮液与低渗液体介质接触后，导致红细胞膜孔打开。可以看出，所述溶解-再封技术具有三种备选方案，分别为低渗透析、低渗预膨胀以及低渗稀释，所有这些方案均基于红细胞内外之间的渗透压差。其中，低渗透析为优选方案。
包封有所述plp酶(如蛋氨酸酶)并可选包封plp和/或plp前体的红细胞的悬浮液尤其可通过如下方法制得：
1、将红细胞团块悬浮于红细胞比容水平大于或等于65％的等渗溶液中，并冷却至+1℃～+8℃；
2、在保温于+1℃～+8℃的条件下实施溶解步骤，包括使红细胞比容水平大于或等于65％的所述红细胞悬浮液与冷却至+1℃～+8℃的低渗溶解液通过透析装置，该装置例如为线圈式或卡盒式(优选卡盒式)透析装置；
3、包封步骤：在保温于+1℃～+8℃的条件下，将待包封的活性成分(尤其含于预先制备的溶液内)在溶解前或溶解过程当中加入(优选逐渐加入)所述悬浮液内；以及
4、在尤其为+30℃～+42℃的更高温度以及等渗或高渗(优选高渗)溶液存在的条件下，实施再封步骤。
在优选替代方案中，可从wo-a-2006/016247(ep1773452)所述方法中获得启发：
1、将红细胞团块悬浮于红细胞比容水平大于或等于65％的等渗溶液中，并冷却至+1℃～+8℃；
2、测定该团块红细胞样品的渗透脆性；
3、在保温于+1℃～+8℃的条件下实施溶解步骤，包括使红细胞比容水平大于或等于65％的所述红细胞悬浮液与冷却至+1℃～+8℃的低渗溶解液通过透析装置，该装置例如为线圈式或卡盒式(优选卡盒式)透析装置，其中，根据前面所测渗透脆性调节溶解参数，尤其根据所测渗透脆性对通过所述透析装置的红细胞悬浮液流以及所述溶解液的渗透压进行调节；
4、包封步骤：在保温于+1℃～+8℃的条件下，将待包封的活性成分(尤其含于预先制备的溶液内)在溶解前或溶解过程当中加入(优选逐渐加入)所述悬浮液内；以及
5、在尤其为+30℃～+42℃的更高温度以及等渗或高渗(优选高渗)溶液存在的条件下，实施再封步骤
为实施透析，将所述红细胞团块悬浮于具有高红细胞比容水平的等渗溶液中，所述红细胞比容水平尤其为大于或等于65％，优选大于或等于70％，此外，将该悬浮液冷却至+1℃～+8℃，优选+2℃～+6℃，通常为+4℃左右。根据一种具体方法，所述红细胞比容水平为65％～80％，优选70％～80％。
测量红细胞渗透脆性时，优选在即将实施所述溶解步骤之前，在所述待包封活性成分存在或不存在(优选存在)的环境下进行测量。所述红细胞或含该红细胞的悬浮液的温度优选接近或等于溶解温度。根据本发明的另一有利特征，所述渗透脆性的测量结果被迅速使用，即在样品采取后短时间即实施所述溶解步骤。优选地，采样和溶解开始之间的经过时间小于或等于30分钟，更佳为小于或等于25，甚至20分钟。
在关于如何通过测量并将所述渗透脆性纳入考虑而实施所述溶解-再封过程这一方面，本领域技术人员可参考wo-a-2006/016247中的更多细节。此文献通过引用并入本文。
申请日为2013年5月7日的fr1354204中描述了对包封技术的改进，本领域技术人员可参考此文献，而且该文献也通过引用并入本文。如此，根据一种实施方式，包封有所述活性成分(即所述plp酶，如蛋氨酸酶)并可选包封一种或多种其他活性成分(如plp和/或plp前体)的红细胞通过包括如下步骤的方法获得：通过溶解-再封，将所述活性成分包封于红细胞内；获得含有掺入所述活性成分的红细胞的悬浮液或团块，以及渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的溶液；直接温育所述团块或悬浮液，或者在加入渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的温育液之后温育所述团块或悬浮液。所述温育进行的时间尤其为大于或等于30分钟，更尤其为大于或等于1小时。其后，去除温育后溶液的液体介质，获取红细胞后将其悬浮于允许制成的悬浮液注射至患者体内的溶液中，优选悬浮于允许制成的悬浮液注射至患者体内的保存液中。上述渗透压为所述红细胞在相关时刻在其内处于悬浮状态或处于团块中的溶液的渗透压。
根据一种具体方法，在所述生产或储存方法过程中或在最终配方中，提供非磷酸盐plp前体，尤其为维生素b6的非磷酸盐形式。此化合物例如可掺入所述温育液或保存液内，或者当实施注射前稀释时，在注射前掺入所述配方中。
根据一个特征，在所述生产或储存方法过程中或在所述最终配方中，提供尤其为0.1mm～250mm，优选为1～50mm的pn和/或pl和/或pm。如上所述，此类维生素b6的非磷酸盐衍生物的一部分将在所述红细胞内转化为plp。
“稳定红细胞悬浮液”尤其指在使用于人体之前细胞外血红蛋白含量保持在小于或等于0.2g/dl的悬浮液，该使用可尤其发生于掺活性成分红细胞批次生产后的1～72小时内。
“随时可用的稳定红细胞悬浮液”是指处于允许注射至患者体内的溶液，尤其处于保存液中的所述稳定悬浮液。其红细胞比容通常大于或等于35％、40％或45％。
“红细胞团块”是指将红细胞之前所悬浮于其中的液体介质分离后收集的红细胞浓缩物。该分离可通过过滤或离心完成，而且通常通过离心完成。团块含有一定比例的液体介质。通常，该团块具有70％～85％的红细胞比容。
“温育液”是指所述温育步骤中所述包封有活性成分的红细胞所在的溶液。该温育可在较大红细胞比容范围内完成，所述红细胞比容范围尤其为10％～85％。
“脆性红细胞”是指在完成掺入步骤并悬浮于保存液内且在该悬浮液在2℃～8℃下尤其保存1～72小时后可发生溶解的红细胞。
“初始红细胞比容”是指脆性红细胞在温育过程中因溶解而损失之前的红细胞比容。
上述方法可尤其包括如下步骤：
(a)将所述待包封活性成分(plp酶(如蛋氨酸酶)及plp和/或plp前体(可选))包封于红细胞内，包括：使所述红细胞与低渗介质接触(从而打开红细胞膜孔)；使所述红细胞与所述活性成分接触(以使该活性成分进入红细胞)；尤其通过等渗或高渗(优选高渗)介质将所述红细胞再封；
(b)获得或制备含有掺入所述活性成分的红细胞的悬浮液或团块，以及渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的溶液；
(c)直接温育步骤(b)的团块或悬浮液，或者在加入渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的温育液之后温育该团块或悬浮液，温育时间为大于或等于30分钟，尤其大于或等于1小时；
(d)去除步骤(c)温育后悬浮液的液体介质；
(e)将步骤(d)所得红细胞悬浮于允许制成的悬浮液注射至患者体内的溶液中，优选悬浮于允许制成的悬浮液注射至患者体内的保存液中。
所述维生素b6的非磷酸盐形式可在所述包封步骤中、步骤(a)中或步骤(c)的温育过程中加入，或者进一步加入至所述保存液内。
根据第一方法，所述溶解-再封式包封后的步骤，尤其步骤(b)，包括至少1个洗涤过程，优选2或3个洗涤过程，每个洗涤过程通过如下方式完成：将所述溶解-再封步骤或步骤(a)所得悬浮液或团块稀释于渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的溶液中；然后获得红细胞团块或悬浮液。该团块或悬浮液包括掺入所述活性成分的红细胞，以及渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的溶液。在此之后，实施后续步骤，如步骤(c)、(d)和(e)。
根据第二方法，在所述溶解-再封步骤或步骤(a)中，通过等渗或高渗介质对所述红细胞再封后所得的可在之后进行温育的红细胞悬浮液，即步骤(b)的所述悬浮液，处于渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的溶液中。换句话说，所述溶解-再封步骤或步骤(a)包括红细胞再封步骤，在该步骤中，包封有活性成分的所述悬浮红细胞与等渗或高渗(优选高渗)再封液混合，从而生成渗透压大于或等于280mosmol/kg，尤其约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选约290mosmol/kg～约330mosmol/kg的红细胞悬浮液。在该方法中，所述温育步骤或步骤(c)包括，对再封所得悬浮液进行温育。该温育的时间为大于或等于30分钟，尤其大于或等于1小时。在此之后，实施后续步骤，如步骤(d)和(e)。
所述溶解-再封之后的步骤(如步骤(b)～(e))的实施条件使得脆性红细胞发生溶解，或使得其大部分发生溶解，尤其使得其50％、60％、70％、80％、90％或更大部分发生溶解。为实现此目的，可对温育时间，温育温度及悬浮有所述红细胞的溶液的渗透压施加作用。渗透压越高，温育时间可越长。因此，为了获得相同效果，渗透压较低时，所述温育时间可较短。此外，温度越高，温育时间可越短，反之亦然。在此之后，可通过一个或多个洗涤过程去除细胞碎片，细胞外血红蛋白，以及细胞外活性成分。
根据本发明，洗涤过程包括：将红细胞悬浮液或团块稀释；然后将红细胞与洗液分离。优选地，一个洗涤步骤包括2个或3个此稀释-分离过程。所述分离可由过滤和离心等任何合适的手段完成。其中，优选为离心。
温育不受悬浮液红细胞比容的限制。因此，可温育悬浮液的初始红细胞比容一般为10％～85％，尤其40～80％。或者说，70％以上的称为团块，而低于此值的称为悬浮液。
所述去除步骤或步骤(d)的目的在于去除悬浮液或温育后团块的液态部分，以尤其去除细胞碎片和细胞外血红蛋白，并从而去除细胞外活性成分。
根据所述去除步骤或步骤(d)的第一方法，尤其通过离心，且尤其对于悬浮液，实施分离。此分离后，可通过先在等渗溶液内稀释，然后尤其通过离心进行分离的方式，实施一个或多个(例如2个或3个)洗涤过程。
根据所述去除步骤或步骤(d)的第二方法，对于悬浮液或团块，先进行稀释，然后尤其通过离心实施分离。所述稀释中尤其使用等渗洗液或保存液。
上述最终步骤或步骤(e)包括，制备最终悬浮液，从而使得其无需任何其他处理即可施用至患者。
根据此步骤的第一方法，使用所述注射溶液，尤其所述保存液，稀释去除步骤或步骤(d)所得到的红细胞团块。
根据上述步骤的第二方法，使用所述注射溶液，尤其所述保存液，通过先稀释后分离的方式，一次或多次洗涤去除步骤或步骤(d)所得到的红细胞团块。洗涤后，将红细胞再次悬浮于所述注射溶液内，尤其所述保存液内。
本发明方法还可包括以下特征中的一个、多个或全部：
-在约2℃～约39℃的温度下实施所述温育步骤或步骤(c)，而且实施时间足够保证脆性红细胞得到溶液；
-在尤其为2℃～约10℃，更尤其为2℃～约8℃的低温下实施所述温育步骤或步骤(c)，实施持续时间为约1小时～约72小时，尤其为约6小时～约48小时，优选为约19小时～约30小时；
-在约20℃～约39℃，且尤其为室温(25℃±5℃)的较高温度下实施所述温育步骤或步骤(c)，实施持续时间为约30分钟～约10小时，尤其为约1小时～约6小时，优选为约2小时～约4小时；上述步骤还可在比室温更高的温度下实施，但其可对细胞产率，p50和/或2,3-dpg含量造成负面影响；
-在所述温育步骤或步骤(c)中，所述悬浮液的初始红细胞比容为10％～85％，尤其40％～80％；可对红细胞比容例如为70％～约85％的分离所得团块，或红细胞比容为约40％～70％的稀释所得团块进行温育；
-所述温育步骤包括搅拌所述悬浮液；
-所述温育步骤不包括任何搅拌；
-作为一种洗涤和/或温育方案，使用已计量的氯化钠水溶液，以获得所需渗透压；如此，可例如获得含有0.9％氯化钠的溶液；除了氯化钠，该溶液还可尤其含有葡萄糖(尤其葡萄糖一水合物)，磷酸二氢钠二水合物，磷酸二钠十二水合物；如此，所得组合物例如包括，0.9％氯化钠，0.2％葡萄糖一水合物，0.034％磷酸二氢钠二水合物，0.2％磷酸二钠十二水合物；
-在所述最终步骤或步骤(e)中，使用所述保存液实施洗涤；
-所述随时可用或者说可直接注射至患者体内的悬浮液内的溶液(液态部分)的渗透压为约280mosmol/kg～约380mosmol/kg，优选为约290mosmol/kg～约330mosmol/kg；
-所述随时可用或者说可直接注射至患者体内的悬浮液的红细胞比容大于或等于35％、40％或45％；
-所有洗涤和温育步骤均使用所述保存液；
-步骤(b)中洗液和/或步骤(e)中洗液，以及所述保存液具有相同组成且包括促进红细胞保存的化合物；
-所述保存液(必要时，以及所述洗液或温育液)为包括氯化钠，腺嘌呤以及选自葡萄糖、右旋糖和甘露醇的至少一种化合物的水溶液；
-所述保存液(必要时，以及所述洗液或温育液)包括氯化钠、腺嘌呤和右旋糖，且优选为as3培养基；
-所述保存液(必要时，以及所述洗液或温育液)包括氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖和甘露醇，且优选为sag-甘露醇或adsol培养基。
本发明方法尤其包括如下步骤：
(a)将活性成分包封于红细胞内，包括：与低渗介质接触，以打开红细胞膜孔；与所述活性成分接触，以允许其进入所述红细胞内；通过等渗或高渗介质将所述红细胞再封。需要注意的是，虽然所述活性成分可在红细胞溶解前就处于红细胞悬浮液内，或者可在溶解过程当中或溶解之后进一步加入，但一定在再封之前加入。在此步骤(a)的一种实施方式中，该方法包括如下分步骤：
(a1)获得红细胞比容大于或等于60％或65％的红细胞悬浮液；
(a2)测量该悬浮液内红细胞的渗透脆性；
(a3)溶解并内包所述活性成分，包括：使所述红细胞悬浮液以与溶解液相反的方向通过透析装置(尤其卡盒式)；根据步骤(a2)所测量的渗透脆性，调节红细胞悬浮液流，或调节溶解液流速，或调节溶解液渗透压；
(a4)将所述红细胞再封。
本发明的另一目的为一种治疗方法，意在为对其有需求的患者提供处于良好生物利用率条件下的plp酶及其辅助因子，所述良好生物利用率是指，该酶及其辅助因子相互间可以有效量为对方所用，从而使得该酶在治疗应用中具有活性且有效。此方法的目的尤其为，消耗或降低所述酶的底物在血浆或循环中和/或器官内的浓度。此方法包括，将本发明组合物以有效量给药，或者使用本发明试剂盒。
根据第一分目标，本发明为一种治疗方法，该治疗方法可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中的蛋氨酸。此方法包括，将含蛋氨酸酶及其辅助因子的本发明组合物以有效量给药，或者使用含蛋氨酸酶及其辅助因子的本发明试剂盒。该方法用于治疗癌症，尤其含蛋氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的癌症，更尤其为乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤。
根据第二分目标，本发明为一种治疗方法，该治疗方法可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中或肝内的高半胱氨酸。此方法包括，将含蛋氨酸酶及其辅助因子的本发明组合物以有效量给药，或者使用含蛋氨酸酶及其辅助因子的本发明试剂盒。该方法用于治疗同型胱氨酸尿症，和/或高同型半胱氨酸血症，和/或与高同型半胱氨酸血症相关的病症，如心血管疾病、中枢神经系统疾病、视觉系统疾病和/或骨骼疾病。
根据本发明第三分目标，本发明为一种治疗方法，该治疗方法可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中的酪氨酸。此方法包括，将含tpl及其辅助因子的本发明组合物以有效量给药，或者使用含tpl及其辅助因子的本发明试剂盒。该方法用于治疗癌症，尤其含酪氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的癌症，更尤其为黑色素瘤。
根据本发明第四分目标，本发明为一种治疗方法，该治疗方法可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中或肝内的酪氨酸。此方法包括，将含htatase及其辅助因子的本发明组合物以有效量给药，或者使用含htatase及其辅助因子的本发明试剂盒。该方法用于治疗与上述plp酶的缺乏相关的罕见疾病，尤其里奇纳-汉哈特(richner-hanhart)综合征(酪氨酸血症ii型)。
根据本发明第五分目标，本发明为一种治疗方法，该治疗方法可消耗或减少对其有需求的患者血浆或循环中或肝内的高半胱氨酸。此方法包括，将含胱硫醚β-合酶及其辅助因子的本发明组合物以有效量给药，或者使用含胱硫醚β-合酶及其辅助因子的本发明试剂盒。该方法用于治疗同型胱氨酸尿症，和/或高同型半胱氨酸血症，和/或与高同型半胱氨酸血症相关的病症，如心血管疾病、中枢神经系统疾病、视觉系统疾病和/或骨骼疾病。
用于上述各治疗用途的所述组合物可还包括所述plp酶的辅助因子(即plp)和/或其前体，该前体可以为：非磷酸盐前体，如维生素b6的非磷酸盐形式；和/或磷酸盐前体，如磷酸吡哆醇(pnp)。所述组合物可还包括pn激酶，pnp氧化酶，plp磷酸酶抑制剂。更一般而言，所述治疗方法可包括，将上述组合物或试剂盒给药。
治疗时，每月对患者给药一个或多个剂量，尤其为一个或两个剂量，表示一次或多次注射内的50ml～300ml的红细胞比容大于或等于35％、40％或45％的悬浮液或组合物。所述给药尤其为静脉或动脉注射，更尤其为灌注。
可替代地，将有效量的含包封有所述plp酶(如蛋氨酸酶)的红细胞的组合物，以及有效量的含维生素b6的非磷酸盐形式(优选pn)的溶液分别给药同一患者。此维生素b6的非磷酸盐形式可通过与所述红细胞悬浮液同时或分别注射的方式给药，也可通过其他任何途径给药，尤其口服给药。
在第一实施方式中，将注射前1小时～72小时，尤其10小时～72小时制备的包封有所述活性成分的红细胞的悬浮液注射于患者体内。该悬浮液的红细胞比容大于或等于35％、40％或45％。其位于保存液内。细胞外血红蛋白水平小于或等于0.5g/dl，尤其为0.3g/dl，更尤其为0.2g/dl，优选为0.15g/dl，更佳为0.1g/dl，而且/或者红细胞溶解水平小于或等于2％，尤其为1.5％，优选为1％。所述悬浮液在注射前未洗涤，或者已经过类似操作处理。
本发明的另一目标为以高产率生产纯化形式的蛋氨酸酶的方法，包括如下步骤：
(a)培养已转化至可生产蛋氨酸酶的细菌，培养物离心后回收团块；
(b)将所述团块悬浮于溶胞缓冲液内，溶解细菌细胞，离心后回收上清；
(c)用沉淀剂处理所述上清，沉淀后回收团块；
(d)将所述团块在约25℃～40℃下进行两轮使用peg的结晶化或沉淀后回收团块；
(e)将所述团块悬浮于溶解缓冲液(例如[25mmtris；0.5mmp5p；0.5mg/mlβ-巯基乙醇；ph7.5])内，对所述团块进行两轮阴离子交换层析后回收蛋氨酸酶溶液；
(f)对所述蛋氨酸酶溶液进行层析精制，其后，回收已纯化的蛋氨酸酶溶液。
在一种优选实施方式中，使用恶臭假单胞菌的蛋氨酸酶编码序列。此序列可优化至与生产性菌株相适应。所述生产性菌株优选大肠杆菌，例如为hms174菌株。含所述蛋氨酸酶序列，优选含上述优化后的蛋氨酸酶序列的表达载体可用于对所述生产性菌株进行转化，并在之后可选择生产性克隆。之后，利用该克隆，在通常条件下，使用发酵罐实施蛋氨酸酶的生产。
优选地，将步骤(a)的所述团块再悬浮于溶胞缓冲液中(例如，[100mm磷酸钠；4.4mmedta；3.3mmp5p；1mmdtt；ph7.6])(每克湿重7ml)。优选地，通过高压均质化进行溶胞，该高压均质化为采用多步高压均质化时比较有利，优选三步高压均质化。通常，在每个均质化步骤之前，均将温度保持于约10℃(9℃～12℃)。优选地，在溶解后和离心前，将细胞溶胞物进行澄清，该澄清过程使用阳离子型凝结剂，优选为聚乙烯亚胺(pei)。该pei的浓度一般可为约0.05％～约0.5％(v/v)，尤其为约0.1％～约0.3％，优选约0.2％。
在步骤(c)中，可使用硫酸铵实施沉淀，该硫酸铵的饱和度通常为约60％。优选地，在该沉淀之前，使用约0.2μm的膜过滤上清。
在步骤(d)中，peg优选为peg-6000。其最终浓度可为约0.5％～约25％(w/v)，尤其为约5％～约15％。所述第一轮沉淀可优选在硫酸铵存在的情况下实施。通常，该硫酸铵的饱和度可为约10％(9％～11％)。一般情况下，peg的最终浓度可约为10％。所述第二轮沉淀可优选在无机盐存在的情况下实施，该无机盐一般为碱金属盐，例如氯化钠或氯化钾，优选氯化钠。该盐的最终浓度可为约0.20m(0.19～0.21)。一般情况下，peg的最终浓度可约为12％。上述温度可为约25℃～约35℃，尤其约28℃～约32℃，通常为约30℃。
在步骤(e)中，可在deae琼脂糖凝胶上实施层析。优选地，可在层析前，将所述再悬浮团块或沉淀通过一约0.45μm的滤器。
在步骤(f)中，通过所述精制去除剩余的残留污染物，如内毒素、hcp和dna。此外，也可使用q膜层析实施该精制步骤。
在此之后，便可将纯化后的蛋氨酸酶浓缩及渗滤。还可通过冷干和约-80℃储存对其进行保存。
附图说明
以下将通过非限制性实施方式并参考附图对本发明进行更加详细的描述，附图中：
图1：根据ep0978560所述方法及根据本申请所述改进方法的mgl纯化方法说明。对专利ep0978560b1中描述的方法所作的改进涉及硫酸铵沉淀步骤之后的步骤。
图2和图3：在将rc-mgl-plp悬浮液与不同浓度吡哆醇(pn)共同温育后红细胞内plp浓度(图2)和细胞外plp浓度(图3)之间的比较。在不存在吡哆醇(0mm)的室温条件下温育3小时和24小时的rc-mgl-plp悬浮液的plp基底水平为3.9μm。将所述悬浮液与2mm和4mm吡哆醇共同温育可在温育3小时后将红细胞内plp浓度提高至8μm(浅灰色条柱)，并可在温育24小时后获得更加大幅提高的水平(分别为11μm和14μm)(暗灰条柱)。
图4：载有mgl-plp络合物的红细胞(rc)的药代动力学。通过对含3mg/mlmgl和约30μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp2。通过对含3mg/mlmgl和约125μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp3。通过对含5mg/mlmgl和33μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp4。通过对含6mg/mlmgl和100μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp5。这些产物均通过荧光标记(cfse)，实现红细胞的体内追踪。在静脉注射于cd1小鼠体内(产物rc-mgl-plp2、rc-mgl-plp3和rc-mgl-plp5为8ml/kg，产物rc-mgl-plp4为10ml/kg)后，所述各产物表现出优异的稳定性，且被注射红细胞在给药后120小时(即5天)的存活率大于75％。rc-mgl-plp4产物的存活率在约10天后降至75％以下。
图5：游离mgl酶的药效动力学。该mgl酶由加入10μmp5p的磷酸钾溶液稀释，以获得两个可注射产物(mgl-l1和mgl-l2)。此两产物的制备方式使得其获得：1)与产物rc-mgl-plp2的酶浓度相同，即0.45mg/mlmgl；2)浓度为产物rc-mgl-plp2的两倍，即0.90mg/mlmgl。此两产物均通过静脉注射(iv)给药于cd1小鼠(8ml/kg)，且注射后6小时再通过静脉注射补充吡哆醇。血浆l-蛋氨酸水平由hplc-ms-ms测定。未处理cd1小鼠的l-蛋氨酸水平测得为68μm。产物mgl-l1和mgl-l2均导致给药后15分钟内的快速消耗，但未经长久保持。
图6：rc-mgl-plp的短时间内药效动力学。通过对含3mg/mlmgl和约30μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp2。通过对含3mg/mlmgl和约125μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp3。此两产物均通过静脉注射(iv)给药于cd1小鼠(8ml/kg)，且注射后6小时再通过静脉注射为rc-mgl-plp2给药的小鼠补充吡哆醇。血浆l-蛋氨酸水平由hplc-ms-ms测定。未处理cd1小鼠的l-蛋氨酸水平测得为82μm。rc-mgl-plp2和rc-mgl-plp3均导致给药后15分钟内的快速消耗，并将l-蛋氨酸水平分别降至15.0±3.6μm和22.7±1.5μm，其后保持35μm的较为温和的消耗，但在48小时～120小时达到稳定。
图7：rc-mgl-plp的长时间内药效动力学。通过对含5mg/mlmgl和33μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp4(0.5mg/ml)。此产物均通过静脉注射(iv)给药于cd1小鼠(10ml/kg)，且注射后6小时再通过静脉注射为rc-mgl-plp4给药的小鼠补充吡哆醇。血浆l-蛋氨酸水平由hplc-ms-ms测定。未处理cd1小鼠的l-蛋氨酸水平测得为68μm。产物rc-mgl-plp4导致给药后15分钟内的快速消耗，并将l-蛋氨酸水平降至约10μm，其后保持约25μm的较为温和的消耗，但在24小时～48小时达到稳定，并在注射后12天逐渐回升至对照值。
图8：循环中plp酶的残留活性。mgl酶由加入10μmp5p的磷酸钾溶液稀释，以获得可注射产物mgl-l2。通过对含3mg/mlmgl和约30μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp2。通过对含3mg/mlmgl和约125μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp3。通过对含5mg/mlmgl和33μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp4。通过对含6mg/mlmgl和100μmplp的悬浮液进行溶解-再封，获得产物rc-mgl-plp5。上述各产物通过静脉注射于cd1小鼠体内(产物mgl-l2、rc-mgl-plp2、rc-mgl-plp3和rc-mgl-plp5为8ml/kg，产物rc-mgl-plp4为10ml/kg)。按照实施例4所述方法，通过测定mgl所产生的nh3而测定被注射mgl酶(总红细胞)的残留活性。
具体实施方式
实施例1：蛋氨酸γ-裂解酶(mgl)的制取及表征方法
菌株制备及高产克隆的分离：通过修饰稀有密码子，对恶臭假单胞菌(genbank：d88554.1)的mgl天然序列进行优化(以将该序列主干从恶臭假单孢菌转为生产性大肠杆菌菌株)。此外，还进行了其它修饰，以改善转译启动的条件。最后，还实施了沉默突变，以删除编码序列的三个元素(框35、框10和56位上的转录因子结合位点)，这些元素为推定的该编码序列内细菌启动子的一部分。利用含有所述优化序列的表达载体pgtpc502_mgl(启动子t7)将所述生产性大肠杆菌菌株hms174(de3)进行转化，并选出生产性克隆。在加入0.5％葡萄糖和卡那霉素的gy培养基中，将所述生产性克隆在37℃下预培养6～8小时(预培养1)以及16小时(预培养2)。
发酵：在发酵罐中，利用gy培养基进行生产，其中，搅拌及压力和ph控制与预培养2相同，光密度为0.02。当光密度达到10时，进入生长阶段(37℃)，之后通过在所述培养基中加入1mm的iptg，在28℃下诱导细胞表达。诱导完成后20小时，以如下两个阶段获取细胞沉淀物：先使用500kda中空纤维过滤细胞培养液，然后将其浓缩5～10倍；15900×g离心后回收细胞团块，并将其储存于-20℃。
纯化：所述细胞团块解冻后悬浮于溶胞缓冲液(7v/w)内。在10℃下，以三步高压均质法实施溶胞(第一步压力为1000巴，之后两布为600巴)。之后，通过在10℃下加入0.2％pei并实施15900×g，将所得细胞溶胞物澄清。在将可溶部分0.2μm灭菌后，利用硫酸铵(60％饱和)在6℃下经20小时使其沉淀。所得沉淀物溶解后，再利用溶解缓冲液实施两个结晶化步骤，其中，第一结晶化步骤通过加入10％peg-6000(最终浓度)和10％饱和硫酸铵实现，第二结晶化步骤通过在30℃下加入12％最终浓度的peg-6000和0.2m氯化钠(最终浓度)实现。15900×g离心后，获取每一分层内含有mgl蛋白质的团块。在将含有mgl蛋白质的团块再次悬浮于溶解缓冲液内并将其以0.45μm滤器过滤后，以两次阴离子交换层析(deae琼脂糖凝胶ff)对其进行处理。在对纯化后的蛋白质实施精制步骤后，使其通过q膜层析囊，以去除各种杂质(内毒素、hcp宿主细胞蛋白质、残留dna)。最后，在将纯化后的mgl蛋白质浓缩于40毫克/毫升后，使用10kda截止切向流过滤盒在配方缓冲液中对其进行渗滤。将所得物质等分为每小瓶约50mg蛋白质的量后，在控制压力和温度的条件下将其最终冷冻干燥并储存于-80℃。
表征：如实施例4中所述，通过测量所产生的nh3，对酶的比活性进行测定。此外，还使用sds-page测定纯度；根据实施例5所述方法，测定溶解后的plp水平；使用渗透压计(loser15型微渗透压计)测定渗透压。
下表总结了一个生产批次内mgl的主要特征：
上述生产方法的讨论：实施例1所述mgl纯化方法的建立基础为专利ep0978560b1中所述方法及相应发表文章(《takakuraetal.,应用微生物生物工程(applmicrobiolbiotechnol)2006》)。选择该方法的原因在于所述结晶化步骤的简单性和稳健性，而且正如上述文章作者们所述，该步骤非常实用且易于适应大规模生产。该步骤的基本点在于，在将溶胞/澄清步骤以及通过添加peg-6000/硫酸铵去除杂质的步骤后获得的mgl溶液加热后，对peg-6000和硫酸铵的使用。该步骤的其他显著特征在于，在通过利用peg-6000对mgl溶液处理后实施离心的方式去除杂质的步骤中，可迅速获得高纯度水平。如此，所述杂质再次进入离心团块内，而mgl的大部分位于上清溶液中。此纯度使得，对所述mgl溶液实施的单个阴离子交换柱(deae)层析步骤以及葡聚糖凝胶s200hr柱凝胶过滤纯化步骤为纯化蛋白质的获得提供了可能性。
在将上述专利方法应用至小规模试验时发现，所得结果无法再现。根据专利ep0978560b1，在杂质去除步骤结束(利用peg-6000/硫酸铵处理并离心)后，mgl酶的大部分位于可溶部分内，而杂质因离心而进入沉淀并被去除。在根据ep0978560b1所述方法实施的小规模试验中，mgl蛋白质的大部分(约80％)仍然处于离心团块内。下表列出sds-page胶上经密度法所测可溶部分内mgl百分比。
鉴于这一意外结果，通过以下步骤对上述专利方法进行了优化：1)对含mgl的离心团块进行处理；2)载入deae柱后，连续实施两个结晶化步骤，以提高杂质去除效果；3)对deae柱层析进行优化。
对于上述最后一个步骤，最终发现，在上述试验缓冲液和ph条件下，deae琼脂糖凝胶ff树脂的交换能力不够强大。在实施了各种额外优化试验后，最终作出如下选择：1)以ph7.6的tris缓冲液代替最初方法中使用的磷酸盐缓冲液，以提高该方法的稳健性；2)实施第二次deae柱层析，以大幅提高内毒素水平和蛋白质纯度的同时，不发生任何的mgl损失(《takakuraetal.，2006》中为0.8eu/mg，而该改进方法中为0.57eu/mg)。
最后，为了获得与大规模gmp生产要求相符的方法，还增加了q膜精制步骤，以降低残留内毒素和hcp水平。此最终的精制步骤避免了对s200凝胶过滤层析的实施，该s200凝胶过滤层析为工业规模生产过程中使用的一种高难度步骤(就该层析的成本和用时而言)。
ep0978560b1方法以及本申请方法中的不同纯化步骤如图1所示。
通过下表可知，上述改进后的纯化方法的收率至少与初始方法的收率相等。
$葡聚糖凝胶s-200hr处理后(ep978560)，或q膜处理后(本发明方法)。
实施例2：将mgl和plp共同包封于小鼠红细胞内
将cd1小鼠(charlesriver)的全血在4℃下1000×g离心10分钟，以去除血浆和血沉棕黄层。使用0.9％氯化钠(v:v)对红细胞洗涤三次。将所述冻干mgl以78.7mg/ml的浓度悬浮于水中，并将其加入上述红细胞悬浮液，以制得红细胞比容为70％且含不同mgl和plp浓度的最终悬浮液。其后，将该悬浮液装入流速为120ml/h的血液透析器中，并通过流速为15ml/min的逆流低渗溶液对其进行透析。在此之后，利用高渗溶液将所述悬浮液再封，并在37℃下将其温育30分钟。在0.9％氯化钠及0.2％葡萄糖中洗涤三次后，将该悬浮液溶于加入6％bsa的sag-甘露醇保存液内。所得产物在d0(制备后2小时)和d1(在2～8℃下保存约18～24小时后)进行表征。之后，通过兽医学自动设备测得血液学特征(sysmex，poch-100iv)。
结果：
在下文提到的不同的研究中，根据实施例4所述方法，并通过与mgl水溶液的外部校准范围比照的方式，对上述最终产物中的mgl活性进行了测定。所得结果与所述描述性研究共同说明，所述最终产物中的mgl活性随该方法中引入的酶量的增加而增加，而且在保持良好稳定性的同时，易于达到每毫升最终产物内32iu的mgl包封率。
在另一项研究中，按照如下方法制备了三种小鼠最终产物：rc-mgl-plp1、rc-mgl-plp2和rc-mgl-plp3：
rc-mgl-plp1：由含3mg/mlmgl和约30μmplp的悬浮液制得mgl和plp的共同包封最终产物，并将该最终产物溶于加有6％bsa和另外10μmplp的sag-甘露醇中。
rc-mgl-plp2：由含3mg/mlmgl和约30μmplp的悬浮液制得mgl和plp的共同包封最终产物，并将该最终产物溶于6％bsa的sag-甘露醇中。
rc-mgl-plp3：该共同包封最终产物由含3mg/mlmgl和约124μmplp的悬浮液制得，并溶于6％bsa的sag-甘露醇中。
在第三项研究中，按照如下方法，使用另一批次的mgl制备了小鼠最终产物rc-mgl-plp4：
-rc-mgl-plp4：由含5mg/mlmgl和约35μmplp的悬浮液制得mgl和plp的共同包封最终产物，并将该最终产物溶于6％bsa的sag-甘露醇中。
最后，在第四项研究中，按照如下方法，通过又一批次的mgl制备了小鼠产物rc-mgl-plp5：
-rc-mgl-plp5：由含6mg/mlmgl和约100μmplp的悬浮液制得mgl和plp的共同包封最终产物，并将该最终产物溶于6％bsa的sag-甘露醇中。
上述三种最终产物在d0(制备后)时的血液学和生化特性如下表所示。此外，各产品均获得18.6％～30.5％的满意包封率。
*根据每批次比活性计算。
实施例3：根据上述工业化方法生产包封有蛋氨酸γ-裂解酶和plp的人红细胞
使用0.9％氯化钠将已去除白细胞的袋装人红细胞(由“etablissement
实施例4：红细胞内包封mgl的测定
通过测定mgl所产生的nh3，对细胞悬浮液(总红细胞)及上清中的mgl活性进行测定。此外，还根据rochediagnostics市售的试剂盒(11877984)，通过谷氨酸脱氢酶(gldh)的酶促作用间接测定nh3离子。
标准品的制备：制备不同浓度的mgl基质(总红细胞或上清红细胞)标准品或水溶液标准品。
样品预处理：利用与标准品相同的方式(加入plp及相同稀释液，但不加入mgl)，对待测样品(10μl)进行预处理。
mgl测定：将7.5μl的标准品(std)或样品引入紫外孔板的板孔中。此外，还加入含α-酮戊二酸缓冲液的94μlr1试剂(roche试剂盒)和56μlr2试剂(roche试剂盒)，nadph以及gldh，以除去样品中的内源nh3离子。温育10分钟后，加入75μl的78.3mml-蛋氨酸，并将反应混合物继续温育30分钟。通过测量340nm处的光密度，对nadph至nadp+的降解进行持续跟踪。针对标准品和样品，在340nm处所测光密度曲线的直线区段上计算每分钟光密度变化率δod/min。之后，制作校准曲线δod/min＝f(标准品内mgl浓度或活性)。利用回归系数，求得样品中的mgl浓度。该结果既可表示为mg/ml，也可表示为iu/ml(针对每一批次，均计算mgl比活性)。红细胞内的mgl水平通过下式计算：[mgl]红细胞内＝([mgl]总-([mgl]上清×(1-红细胞比容/100))/(红细胞比容/100)。
实施例5：利用hplc测定血样中plp
利用调整后的《vandekampetal.营养研究(nutritionresearch)15,415-422,1995》中所述方法，测定细胞悬浮液(总红细胞)和上清内plp。该测定中使用带荧光检测功能(rf-10axl检测器，激发波长：300nm，发射波长：400nm)的rp-hplc(岛津uflc)。使用三氯乙酸(tca)对样品所含plp进行萃取，直至最终浓度为6％。离心后(15000×g，10分钟)，收集上清，并将其稀释于流动相a中。将50μl体积的样品注入250×4.6mm的gemini5μc18柱(phenomenex)内。流动相a由33mm磷酸二氢钾，加有用于增强plp信号的亚硫酸氢钠(0.5g/l)的8mm1-辛烷磺酸钠，以及由33mm磷酸二氢钾和17％(v:v)2-丙醇组成的流动相b组成。所使用的梯度为流动相b在流动相a(100％)内的占比按如下方式增大：8分钟内从0％增大至8％。柱内流速保持于1ml/min。利用经历与样品相同的tca处理后的外部plp标准品的范围，确定样品内plp浓度。plp的保留时间约为3.4分钟。红细胞内的plp水平通过下式计算：[plp]红细胞内＝([plp]总-([plp]上清×(1-红细胞比容/100))/(红细胞比容/100)。
实施例6：通过将plp和mgl共同包封提高红细胞内plp水平
利用实施例2所述mgl和plp包封方法处理小鼠红细胞悬浮液。利用实施例5所述方法测定细胞内plp。
利用实施例3所述mgl和plp包封方法处理人红细胞悬浮液。在所述室温温育步骤之前，提取一部分的人rc-mgl-plp，以按照实施例5所述方法测定细胞内plp。
下表对人或小鼠红细胞内plp的生理水平与plp和mgl共同包封所致水平进行比较。
*计算详情：7.5nmol/g血红蛋白，约2.4μm(平均红细胞血红蛋白浓度(ccmh)为32g/dl)。
实施例7：对通过与吡哆醇体外温育提高红细胞-mgl内plp浓度进行展示
利用实施例3所述mgl包封方法处理人红细胞悬浮液。在所述3小时温育步骤前，提取该红细胞的一部分并将其分为三份，以与不同浓度(0mm、2mm和4mm)的吡哆醇进行温育(v/v)。均质化后，将各悬浮液在室温下温育。分别温育3小时和24小时后，制备细胞悬浮液样品和上清样品(将悬浮液在4℃下1000×g离心10分钟后获得)并将其冷冻，以用于按实施例5所述方法通过hplc测定plp浓度。
所得结果示于图2和图3。
当不存在吡哆醇时，红细胞内plp水平为3.9μm(plp来自于mgl和plp共同包封)。3小时和24小时温育后，此plp浓度保持恒定。在24小时时，观察到plp浓度的轻微下降，并同时观察到处于细胞外的plp，其原因在于温育后发生的红细胞溶解。
当存在吡哆醇(2mm或4mm)时，rc-mgl内的plp增加，其中，3小时温育后的红细胞内浓度增加至两倍(约8μmplp)，24小时温育后几乎增加至三倍，并同时发生剂量效应(对于2mm和4mm的吡哆醇浓度，分别为11μm和14μm)。上述结果说明，对包封有plp依赖性酶和吡哆醇(pn)的红细胞悬浮液进行温育可长效式地提高细胞内的plp水平。
实施例8：包封mgl-plp的红细胞在小鼠体内的药代动力学
使用cfse(荧光)对上述小鼠产物rc-mgl-plp2、rc-mgl-plp3、rc-mgl-plp4和rc-mgl-plp5进行标记，并将其静脉注射至cd1小鼠体内。经过不同时间(上述三产物为d0+15分钟，d1，d2，d5；rc-mgl-plp4产物还包括d14和d28；rc-mgl-plp5产物还包括d14)之后，将小鼠处死并将其血液收集于避光+4℃下保存的肝素锂管内，以用于药代动力学测定。利用流式细胞仪法测定cfse标记的红细胞在全血中的比例。将5μl全血稀释于1ml0.5％bsa的pbs中，每个样品测试三次(fl-1对1万个细胞进行计数；fc500流式细胞计；美国贝克曼库尔特(beckmancoulter))。通过将不同时间cfse标记红细胞的比例与t0+15分钟时的cfse标记红细胞比例(100％对照)相加，对带mgl的红细胞的存活状况进行评价。再将每一时间上获得的不同百分比绘图(图4)，以表示循环中带mgl红细胞的比例与时间的关系。
不同时间循环中cfse标记红细胞的比例的测定结果显示，上述四种产物注射后120小时在小鼠体内具有优良稳定性(存活率分别为83.5±0.6％、94.7±0.6％、87.3±5.6％和76.8±1.3％)。rc-mgl-plp4产物的29天后药动学研究表明，包封mgl的半衰期约为12.6天。
实施例9：l-蛋氨酸的24小时内消耗状况
将实施例2制备及表征的小鼠产物rc-mgl-plp1、rc-mgl-plp2和rc-mgl-plp3以8ml/kg的剂量静脉注射至cd1小鼠体内。6小时后，向rc-mgl-plp2给药的小鼠注射约0.09mg的吡哆醇(即150μl的2.9mm盐酸吡哆醇溶液)。24小时后，使用hplc-ms-ms测定l-蛋氨酸的血浆水平(《piraudm.etal.,rapidcommun.massspectrum.19,3287-97,2005》)。各组小鼠注射后消耗状况见下表。
对照小鼠体内所测l-蛋氨酸血浆水平为82.7±22.5μm。含包封mgl和低浓度plp的产物rc-mgl-plp1在给药24小时后的l-蛋氨酸消耗率为44％。对此，我们提出加至该产物保存液内的plp无法为mgl酶所用的假设，其原因为：1)其大部分与保存液内的bsa结合；2)其无法通过红细胞膜。
上述结果表明，以吡哆醇(rc-mgl-plp2)静脉注射或高浓度plp包封这两种更易产生结果的方式为红细胞提供plp时，可获得约1.5倍高的l-蛋氨酸消耗率(消耗率分别为73％和64％)。
实施例10：红细胞-mgl药效动力学
以8ml/kg的剂量向cd1小鼠体内静脉注射游离形式的mgl酶。然后，实施两轮注射，第一轮酶浓度为0.45mg/ml(产物mgl-l1)，第一轮酶浓度为第一轮的两倍(0.90mg/ml，产物mgl-l2)。注射后6小时，向mgl-l1和mgl-l2给药小鼠注射约0.09mg的吡哆醇(即150μl的2.9mm盐酸吡哆醇溶液)。使用hplc-ms-ms，分别在mgl-l1注射后15分钟、24小时、48小时和120小时，以及mgl-l2注射后15分钟、24小时、48小时、120小时和144小时，测定l-蛋氨酸血浆水平。各组小鼠注射后消耗状况见图5。
结果显示，两实验组的l-蛋氨酸消耗均十分强劲(≈4μm)快速(注射15分钟后)。然而，此消耗状况非常短暂且未能经时保持。尽管最初时提供了p5p(不但在稀释缓冲液提供，而且还在溶于水的酶配方内提供)，而且还与rc-mgl-plp2产物给药试验一样补充了维生素b6，但l-蛋氨酸水平仍在注射后24小时回升至对照值。由此可见，注射后15分钟～24小时，游离mgl失去活性，其原因可能为该酶在循环中的消除速度较快。
在第二阶段，将实施例2制备及表征的小鼠产物rc-mgl-plp2和rc-mgl-plp3以8ml/kg的剂量静脉注射至cd1小鼠体内。6小时后，向rc-mgl-plp2给药的小鼠注射约0.09mg的吡哆醇(即150μl的2.9mm盐酸吡哆醇溶液)。使用hplc-ms-ms，分别在15min、24小时、48小时和120小时后测定l-蛋氨酸血浆水平。各组小鼠注射后消耗状况见图6。
结果显示，两实验组的l-蛋氨酸的消耗稳定于约35μm且经时保持(注射后48～120小时)。这些结果表明，补充plp或其前体(维生素b6)可将红细胞内所包封mgl的注射后活性在小鼠体内至少保持120个小时。作为证明，下表给出注射后24小时和120小时后各产品(mgl游离形式或mgl与plp共同包封于红细胞的形式)的血浆内l-蛋氨酸浓度。
为了评价mgl包封浓度为0.5mg/ml的小鼠产物rc-mgl-plp4的120小时之外药效学特性，将该产物以10ml/kg的剂量静脉注射于cd1小鼠体内。6小时后，向rc-mgl-plp4给药的小鼠注射约0.09mg的吡哆醇(即150μl的2.9mm盐酸吡哆醇溶液)。使用hplc-ms-ms测定l-蛋氨酸血浆水平。注射后15分钟，d1、d2、d5、d14和d28的消耗状况见图7。
结果显示，l-蛋氨酸消耗较为显著(≈10μm，对照组≈68μm)且经时较快(注射后15分钟)。然而，该消耗在rc-mgl-plp4注射后24小时～48小时略变稳定至约25μm，5天后升至约40μm，并在约12天后最终与对照值相同。
最后，按照实施例4所述测定方法，在plp存在的环境中，对所注射mgl酶的残留活性进行了测定。图8列出了游离mgl-l2酶，各rc-mgl-plp产物以及tpl酶(数据来自文献)的残留活性经时变化。
结果显示，通过在小鼠红细胞内包封mgl，可在24小时后保持较强的24小时酶活性(残留活性为约60％～100％)。注射后48小时，该残留活性略微下降(约35％～100％)，并在120小时(即5天)后保持于约20％～约65％。游离mgl的残留活性在注射后的最初数分钟内急剧下降，并在24小时后几乎变为0(残留活性<10％)。作为对比，图中还给出了游离tpl的注射后残留活性，如图所示，后者在注射后5小时最高仅为37％(《elmeretal.,1978》)。此残留活性测定结果清楚地表明了plp酶在红细胞内的包封在保持其酶活性方面的有益效果。
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