白头翁皂苷B4在制备治疗/预防病毒性肺炎药物的用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种白头翁皂苷b4在制备治疗/预防病毒性肺炎药物的用途。

背景技术：

甲型h1n1流感病毒最早于2009年4月在墨西哥爆发，随后在全球范围内蔓延。中国将甲型流感病毒h1n1纳入乙类传染病，并采取甲类传染病的预防和控制措施。流感病毒具有变异性和传染性，免疫力低下人群容易受到攻击。当流感病毒在肺脏支气管上皮细胞和肺组织中大量增殖时，可引起严重的病理组织损伤，如肺部水肿、炎性渗出、充血等，导致支气管炎和间质性肺炎，严重感染者，出现呼吸衰竭、多脏器功能损伤等，甚至导致死亡，严重影响人类的生活质量和生命健康。急性肺损伤是肺炎反应连带的结果，由各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。其主要治疗方法为呼吸支持治疗，如氧疗、无创呼吸机、有创通气为主，从而改善低氧血症。病毒性肺炎治疗与急性肺损伤的呼吸支持治疗不同，目前治疗病毒性肺炎主要以抗生素、糖皮质激素等药物治疗为主，但长期使用抗生素、糖皮质激素容易产生耐药性和副反应，严重威胁人类健康，因此，探索治疗病毒感染性肺炎的新方法，具有十分重要的意义。

流感病毒诱导的病毒性肺炎的机制，主要与细胞因子水平和细胞免疫相关。细胞因子是由活化免疫细胞或非免疫细胞合成分泌的，主要调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答等。研究表明，流感病毒引起的肺组织损伤，主要由于促炎因子tnf-α、il-6和il-8等的释放介导炎症反应，导致肺组织损伤。同时，还可通过诱导tlr4-md-2二聚体形成，进而激活其下游myd88、trif、nf-kb和mapk等信号通路，促进炎症因子的释放诱导机体的炎症反应。因此，抑制炎症因子释放，抑制tlr4通路蛋白的表达是治疗流感病毒诱导肺炎的有效方法。

白头翁皂苷b4是从毛茛科多年生草本植物白头翁中提取具有药理活性的五环三萜类皂苷，其具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等药理作用。目前对白头翁皂苷b4对防治病毒性肺炎作用尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种白头翁皂苷b4在制备治疗/预防病毒性肺炎药物的用途，白头翁皂苷b4对fm1诱导的病毒性肺炎具有保护作用，保护机制可能与降低炎症因子的表达，抑制tlr4、md2和myd88蛋白表达有关。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种白头翁皂苷b4在制备治疗和/或预防流感病毒引发的哺乳动物包括人的病毒性肺炎的药物中的用途。

优选的是，所述药物含有治疗有效量的白头翁皂苷b4和药学上可接受的载体。

优选的是，所述药物被制成药学上允许的剂型。

优选的是，所述药物被制成注射剂。

优选的是，所述药物下调病毒性肺炎受试者炎症因子的水平。

优选的是，所述炎症因子包括il-4、tnf-α。

优选的是，所述药物抑制tlr4、md-2和myd88蛋白的表达。

优选的是，白头翁皂苷b4的给药剂量为不低于0.5mg/kg·d。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明利用甲型h1n1流感病毒鼠适应株(fm1)诱导小鼠病毒性肺炎模型，探讨注射用白头翁皂苷b4(b4)对病毒性肺炎的保护作用及可能机制，为防治病毒性肺炎提供理论依据，通过fm1诱导小鼠病毒性肺炎模型，以评价指标：血清、肺泡灌洗液和肺组织中il-6和tnf-α炎症因子的水平，肺组织中tlr4、md-2和myd88蛋白的表达情况，fm1(病毒原液用生理盐水稀释500倍)气管滴注给药能显著诱导小鼠病毒性肺炎模型，小鼠呼吸急促，血清、肺泡灌洗液和肺组织中il-6、tnf-α的水平显著升高，注射用白头翁皂苷b4能够显著降低血清、肺泡灌洗液和肺组织中炎症因子il-6、tnf-α的水平和肺组织中tlr4、md-2和myd88蛋白的表达。且注射用白头翁皂苷b4治疗fm1诱导的病毒性肺炎效果比阳性药组效果更显著。实验结果表明，注射用白头翁皂苷b4对fm1诱导的病毒性肺炎具有保护作用，保护机制可能与降低炎症因子的表达，抑制tlr4、md2和myd88蛋白表达有关。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的白头翁皂苷b4对小鼠肺组织tlr4、md-2和myd88蛋白的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

1、材料

1.1实验动物

健康balb/c小鼠，雌雄各60只，spf级，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：scxk京2016-0006。

1.2药物与试剂

注射用白头翁皂苷b4，以下简称b4(江西本草天工科技有限责任公司，批号：2018042205)；fm1株(购自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所，由中国中医科学院中药研究所absl-2实验室常规传代，-80℃保存备用)；利巴韦林(北京索莱宝科技有限公司，批号：20160308)；注射用生理盐水(四川科伦药业股份有限公司，批号：l219012211)；il-6、tnf-αelisa测定试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，批号：m190530-102a)。

1.3仪器

低温高速离心机(eppendorf公司，型号：5425r)；酶联免疫检测仪(美国biotek公司，型号：synergyh1)；组织研磨机(杰灵仪器制造天津有限公司，型号：tp-24)。

2、方法

2.1动物造模及给药

健康balb/c小鼠，雌雄各60只，适应性喂养3天，实验室室温为(25±5)℃，相对湿度(40～70)％。常规饲料喂养，自由饮水。于造模前称小鼠体重并随机分为空白对照组、模型对照组(fm1病毒株，病毒原液用生理盐水稀释500倍，i.t.)、白头翁皂苷b4低剂量组(fm1+白头翁皂苷b42.5mg/kg，i.v.)、白头翁皂苷b4中剂量组(fm1+白头翁皂苷b45mg/kg，i.v.)、白头翁皂苷b4高剂量组(fm1+白头翁皂苷b410mg/kg，i.v.)、阳性对照组(fm1+利巴韦林40mg/kg,i.v.)(每组20只，雌雄各半)，为了方便记录数据，以上六组后续分别在表格中计为空白对照组、fm1模型组、b4(2.5mg/kg)组、b4(5mg/kg)组、b4(10mg/kg)组、利巴韦林(40mg/kg)组，按照气管滴注(i.t)给fm1病毒1次进行造模。造模前各组小鼠腹腔注射0.4％戊巴比妥钠，0.12ml/10g麻醉后，取小鼠仰卧位，于手术台上，用小鼠开口器打开小鼠口腔，用肺部液体定量雾化器，从会厌软骨开口处将fm1病毒溶液(病毒原液用生理盐水稀释500倍)注入肺脏，雄性小鼠注入50μl、雌性小鼠注入50μl，模型即建立完成，待其苏醒后给予水和饲料。白头翁皂苷b4低、中、高剂量组于造模后0h、24h、48h、72h、96h尾静脉(i.v)注射注射用白头翁皂苷b4(2.5、5、10mg/kg)、利巴韦林0h、24h、48h、72h、96h灌胃(i.g)给药(40mg/kg)，fm1模型组i.v注射等量生理盐水。

2.2检测指标

2.2.1肺组织指标测定

每组10只小鼠(雌雄各半)于造模后120h摘除肺脏，用组织研磨机匀浆后，于-80℃冰箱保存，采用elisa法检测il-6、tnf-α含量。

2.2.2肺泡灌洗液(balf)炎症因子的检测

采血结束后，每组按顺序选取雌雄前5只，处死，迅速打开胸腔并暴露颈部气管，用1ml注射器由气管注入pbs溶液0.3ml，反复回抽推注3～5次，得肺泡灌洗液，同法重复3次，合并3次肺泡灌洗液，置于低温冷冻离心机，在4℃下，1600rpm，离心10min，收集上清液，采用elisa法检测肺泡灌洗液炎症因子il-6、tnf-α水平，具体操作按elisa试剂盒说明书进行。

2.2.3血清指标测定

小鼠处死前，摘眼球取血于ep管中，室温血液自然凝固30min后，于4℃、3000r/min离心20min，分离血清，分装冻存于-80℃，严格按照操elisa操作说明检测血清il-6、tnf-α炎症因子的含量。

2.2.4小鼠肺组织蛋白检测

小鼠肺组织研磨后，离心取上清，大白定量后，用westernblotting方法检测tlr4，md-2，myd88蛋白的表达。

2.2.5统计学分析

多个样本间均数比较。方差齐性数据采用单因素方差分析lsd检验，以p＜0.05为差异具有统计学意义。

采用spss13.0统计软件包，各项指标结果用均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析(one-wayanova)和两两比较(lsd法)。p<0.05为差异具有统计学意义。

3、实验结果

3.1白头翁皂苷b4对肺组织匀浆il-6、tnf-α水平的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺组织il-6、tnf-α水平显著升高(p<0.001)；与模型对照组比较，阳性对照组小鼠肺组织il-6、tnf-α水平显著降低(p<0.001或p<0.05)，白头翁皂苷b4低、中、高剂量组小鼠肺组织il-6、tnf-α水平均降低(p<0.05或p<0.01或(p<0.001)。

结果显示，fm1可导致balb/c小鼠肺组织il-6、tnf-α水平升高，而利巴韦林和白头翁皂苷b4具有降低fm1所致肺组织il-6、tnf-α水平升高的作用，并且白头翁皂苷b4比阳性对照组抑制作用强，详见表1、2。

表1白头翁皂苷b4对小鼠肺组织il-6水平的影响

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

表2白头翁皂苷b4对小鼠肺组织tnf-α水平的影响

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

3.2白头翁皂苷b4对肺泡灌洗液(balf)中il-4、tnf-α含量的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺泡灌洗液il-6、tnf-α水平显著升高(p<0.001)；与模型对照组比较，阳性对照组小鼠肺泡灌洗液il-6、tnf-α水平显著降低(p<0.001)，白头翁皂苷b4低、中、高剂量组小鼠肺泡灌洗液il-6、tnf-α水平均降低(p<0.05或p<0.001)

结果显示，fm1可导致balb/c小鼠肺泡灌洗液il-6、tnf-α水平升高，而利巴韦林和白头翁皂苷b4具有降低fm1所致小鼠泡灌洗液il-6、tnf-α水平升高的作用，且白头翁皂苷b4中、白头翁皂苷b4高剂量抑制作用较阳性对照组强，详见表3、4。

表3白头翁皂苷b4对小鼠肺泡灌洗液il-6水平的影响

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

表4白头翁皂苷b4对小鼠肺泡灌洗液tnf-α水平的影响

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

3.3白头翁皂苷b4对血清中il-6、tnf-α含量的影响

与空白对照组比较，模型对照组血清il-6、tnf-α水平显著升高(p<0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组小鼠血清il-6、tnf-α水平无显著性差异，白头翁皂苷b4低、中、高剂量组小鼠血清il-6、tnf-α水平均降低(p<0.05或p<0.01或(p<0.001)。

结果显示，fm1可导致balb/c小鼠血清il-6、tnf-α水平升高，白头翁皂苷b4具有降低fm1所致肺组织il-6、tnf-α水平升高的作用，且抑制作用比阳性药利巴韦林效果更好，详见表5、6。

表5白头翁皂苷b4对小鼠血清il-6水平的影响

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

表6白头翁皂苷b4对小鼠血清tnf-α水平的影响

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

3.4白头翁皂苷b4对小鼠肺组织tlr4、md-2和myd88蛋白的影响

tlr4是tlr家族中第一个被发现的病原模式识别受体(pattern-recognitionreceptors,prrs)。tlr4信号涉及到大多微生物引起的先天免疫反应，其中包括革兰氏阴性和阳性菌、分枝杆菌、螺旋体、酵母，以及一些病毒，如呼吸道合胞病毒和乳腺肿瘤病毒。fm1激活tlr4后，tlr4与md-2形成二聚体，并激活其下游myd88、trif、nf-κb及mapk等，促进炎症因子释放。

与空白对照组比较，模型对照组tlr4、md-2和myd88蛋白表达水平显著升高；与模型对照组比较，白头翁皂苷b4低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠肺组织中tlr4、md-2和myd88蛋白表达水平均显著降低。

结果显示，fm1可导致balb/c小鼠血清il-6、tnf-α水平升高，白头翁皂苷b4具有降低fm1所致肺组织il-6、tnf-α水平升高的作用，其治疗病毒性肺炎机制可能通过抑制tlr4、md-2和myd88的表达，从而抑制炎症因子的释放，详见图1。

3.5结论

实验结果表明，白头翁皂苷b4对fm1诱导的病毒性肺炎具有治疗作用，其作用机制可能通过降低血液、肺泡灌洗液和肺组织炎症因子如il-6、tnf-α的水平，抑制tlr4、md2和myd88蛋白表达有关。il-6、tnf-α为肺炎相关炎症因子，不同于急性肺损伤炎症因子il-1β和tgfβ等，因此，降低il-6、tnf-α水平可以对肺炎具有治疗作用。白头翁皂苷b4对fm1诱导小鼠血清、肺泡灌洗液和肺组织中il-6、tnf-α的水平抑制作用较阳性对照组强。本发明首次发现说明白头翁皂苷b4(2.5，5，10mg/kg)对治疗病毒性肺炎具有治疗作用，其效果比利巴韦林和中药组合更显著。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明白头翁皂苷b4，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或者注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂(纳米制剂)、口服液、喷雾剂、栓剂等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

本发明提取物用作药物时，以药物制剂的形式使用，优选为注射剂，其中b4纯度＞99％。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。