一种负载生长因子的活性羊膜材料及其制备方法与流程

本发明属于生物医药材料
技术领域：
，具体涉及一种负载生长因子的活性羊膜材料及其制备方法。
背景技术：
：羊膜具有独特的理化性能与生物学特性，因此，羊膜在临床治疗中得到广泛的应用。作为覆盖材料或敷料时，羊膜有着抑制炎症、抗粘连、促进细胞分化与增殖、抑制瘢痕形成、抑制血管增生等作用，已经成为临床手术中常见的生物材料，如用于角膜及眼表损伤修复，皮肤烧伤及创伤的创面覆盖，外科腹腔手术、妇产科盆腔手术预防组织粘连，肌腱损伤、骨/软骨损伤的手术界面修复等。羊膜的诸多生物学功能是由于其含有多种细胞生长因子，如egf、bfgf、kgf、hgf等。有众多研究表明，这些生长因子可促进细胞迁移和分化，增强细胞间黏附，抑制细胞调亡等。羊膜中除了含有多种细胞因子外还含有多种蛋白酶的抑制因子，这些因子通过抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用。由于羊膜在使用前需要面临预处理，如细菌与病毒灭活等，以及未及时使用的存储与运输，羊膜上所带有的生长因子因此会随着处理工艺、保存方式和保存时间而降低，从而影响其使用时的疗效。如何改良羊膜的处理、保存方式以降低上述过程中的生长因子损耗或对损失的生长因子进行补充成为了生物羊膜的一大改进方向。近些年来发展的生物医用材料改性技术为解决该问题提供了新的思路，但羊膜为天然组织，相对较为脆弱，不能经受处理强度较大的改性，若对羊膜内的天然结构如胶原束排列、生物相容性等造成破坏，则会破坏羊膜的理化性能优势，这对羊膜材料的改性制备提出了较高要求。因此理想的生物羊膜材料制备方法应反应条件温和、生物安全，在不破坏羊膜独特性能的前提下进行。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种负载生长因子的活性羊膜材料及其制备方法。本发明所采取的技术方案是：一种羊膜材料的制备方法，包括以下步骤：(1)取羊膜，清洗羊膜，将羊膜进行酶解消化，去除其表面杂质，然后将处理好的羊膜浸泡于甘油中，静置过夜，备用；(2)将步骤(1)的羊膜材料置于肝素钠溶液中，然后加入交联剂进行交联，在4～6℃条件下，水浴锅中搅拌4～10小时；本发明中的交联过程选择在低温4～6℃条件下是为了控制交联的反应速度，在比较温和的一个状态，温度过高则容易交联过快，导致不均匀。(3)取出经步骤(2)处理的羊膜材料，无菌水洗涤后，于恒温恒湿的无菌环境下晾干，即可获得本发明的羊膜材料。进一步地，所述羊膜材料的制备方法还包括以下步骤：将由如上方法制备的羊膜材料浸泡于含有生长因子的pbs溶液中2～8小时，即得到负载生长因子的活性羊膜材料。进一步地，所述步骤(1)中所用胎盘为新鲜的健康人胎盘。进一步地，所述步骤(1)中酶解消化采用的酶为胰蛋白酶，消化时间为3～5小时。进一步地，所述步骤(1)中静置过夜的温度为4～6℃。进一步地，所述步骤(2)中肝素钠溶液中肝素钠的质量体积浓度为1～2mg/ml，ph值为5.0～5.5。本发明通过大量试验发现在弱酸环境下肝素钠更容易发生交联。进一步地，所述步骤(2)中交联剂为1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的混合物，其中1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺与n-羟基丁二酰亚胺的质量比为(1～2):1。进一步地，所述步骤(2)中羊膜与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:(1～2)。进一步地，所述步骤(3)中恒温恒湿环境的条件如下：温度为20～35℃、湿度为20～60％。进一步地，所述生长因子包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子和肝细胞生长因子中任意一种或几种。本发明还提供了一种由如上所述的制备方法制备而成的负载生长因子的活性羊膜材料。与现有技术相比，本发明的羊膜材料具有以下有益效果：1)本发明的羊膜材料经过改性后保留羊膜的天然微观结构，透光性好、含水保湿性能佳；2)本发明的羊膜材料生物相容性良好，细胞可以在本材料上粘附、增殖；3)本发明的羊膜材料保持了羊膜天然的理化性能且力学性能良好，便于操作、用手术线进行缝合时亦不会造成撕裂；4)本发明的羊膜材料能够通过肝素钠与生长因子的电荷吸附作用实现生长因子的个性化负载，并在使用过程中从材料中释放生长因子；5)本发明的羊膜材料在干燥后使用前，即浸泡含有生长因子的溶液之前，能够长期保存，使用、存储、运输等均较方便，可广泛用于临床，其制备工艺简单、设备简易，具有良好的应用前景和应用价值。附图说明图1实施例1的羊膜材料干燥后与再次浸泡含有生长因子的缓冲液后的照片。图2实施例1的羊膜材料的透光性能检测结果。图3实施例1的羊膜材料上皮面与下皮面的扫描电子显微镜(sem)照片。图4实施例1的羊膜材料的体外细胞毒性检测结果(纵坐标表示上皮细胞od值或细胞密度，横坐标表示细胞培养时间)。图5实施例1的羊膜材料中肝素钠接枝牢固程度的检测结果(纵坐标表示肝纳素含量，横坐标表示时间)。图6实施例1的羊膜材料的生长因子负载能力检测。具体实施方式为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种羊膜材料的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将羊膜从新鲜健康的人胎盘中剥离，使用无菌生理盐水清洗羊膜的血迹和污渍，洗净后将羊膜置于胰蛋白酶溶液中3～5小时，酶解结束后用细胞刮处理羊膜表面杂质，将上述处理好的羊膜浸泡于甘油中，于4～6℃条件下静置过夜，过夜处理后取出，用无菌生理盐水冲洗5次，备用；(2)将肝素钠用ph值为5.0～5.5的mes缓冲液配制成浓度为1mg/ml的肝素钠溶液；将步骤(1)的羊膜材料置于肝素钠溶液中，然后加入交联剂在4℃条件下进行交联，水浴锅中搅拌4～10小时；所述交联剂为1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的混合物，其中1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺与n-羟基丁二酰亚胺的质量浓度分别为1.5mg/ml与0.75mg/ml；羊膜与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:1。(3)取出经步骤(2)处理的羊膜材料，用无菌水洗涤，于温度30℃、湿度50％的恒温恒湿环境的无菌环境下晾干处理。实施例2本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的肝纳素的质量终浓度为2mg/ml。实施例3本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的交联温度为6℃。实施例4本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺与n-羟基丁二酰亚胺的质量比为1:1；实施例5本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中羊膜与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:2。实施例6本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中恒温恒湿的环境条件为：温度20℃、湿度20％。实施例7本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中恒温恒湿的环境条件为：温度35℃、湿度40％。实施例7本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中恒温恒湿的环境条件为：温度35℃、湿度60％。实施例8本实施例提供一种负载生长因子的活性羊膜材料的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将羊膜从新鲜健康的人胎盘中剥离，使用无菌生理盐水清洗羊膜的血迹和污渍，洗净后将羊膜置于胰蛋白酶溶液中3～5小时，酶解结束后用细胞刮处理羊膜表面杂质，将上述处理好的羊膜浸泡于甘油中，于4～6℃条件下静置过夜，过夜处理后取出，用无菌生理盐水冲洗5次，备用；(2)将肝素钠用ph值为5.0～5.5的mes缓冲液配制成浓度为1mg/ml的肝素钠溶液；将步骤(1)的羊膜材料置于肝素钠溶液中，然后加入交联剂在4℃条件下进行交联，水浴锅中搅拌4～10小时；所述交联剂为1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的混合物，其中1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺与n-羟基丁二酰亚胺的质量浓度分别为1.5mg/ml与0.75mg/ml；羊膜与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:1。(3)取出经步骤(2)处理的羊膜材料，用无菌水洗涤，于温度30℃、湿度50％的恒温恒湿环境的无菌环境下晾干处理。(4)将步骤(3)的羊膜材料浸泡于ph值为7.2含有生长因子的pbs溶液中2～8小时，即得到负载生长因子的活性羊膜材料；所述生长因子包括以下质量浓度的组分：1ng/ml的表皮生长因子、2ng/ml的成纤维细胞生长因子、1ng/ml的神经生长因子。实施例8制备的羊膜与天然羊膜材料进行检验，结果如图1～6和表1所示，从表1可知，改性后羊膜材料的厚度、含水率、力学强度均与天然羊膜相似。由图1可知本发明的改性羊膜材料从干态复水到湿态后的宏观形貌与天然羊膜相似。由图2可知，羊膜材料在改性后与天然羊膜的透光率相似，在眼科等需要羊膜透光性能得应用方面，具有优势。由图3可知，羊膜材料改性后的微观结构没有受到破坏，能够清晰地看到表面地胶原纤维结构，相比于其他改性方式，该方法制备获得的羊膜材料有利于羊膜天然理化性能的维持，得益于该优势，因此该材料拥有与天然羊膜相似的理化性能，如透光性等。由图4可知，改性后的羊膜材料没有明显的细胞毒性，上皮细胞能够在其表面黏附并增殖。由图5可知，肝素钠接枝到羊膜表面后牢固且稳定，在不同的温度条件下保存都能保持较高的留存率，保证了载体的稳定性及负载生长因子的稳定性、可靠性，羊膜材料拥有较长的保存时间。由图6可知，接枝了肝素钠的羊膜相比天然羊膜能够吸附更多的生长因子，相比于没有改性处理过的羊膜，经过长时间的保存后仍能够为疾病提供更好的治疗效果。表1：不同羊膜材料的性能比较结果材料厚度含水率拉伸强度天然羊膜17±1.4μm91.92±5.43％0.752±0.172mpa实施例8的羊膜材料18±0.9μm87.75±7.71％0.781±0.201mpa以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12