一种COVID-19灭活疫苗组合物及应用的制作方法

一种covid-19灭活疫苗组合物及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别是涉及流行病预防及疫苗生产技术领域，具体涉及一种covid-19灭活疫苗组合物及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒covid-19是一种新出现的新型冠状病毒，属于冠状病毒β家族，可经呼吸道飞沫传播、接触和粪-口传播等途径传播，在人群中极易感染。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。截至2020年4月16日，全球累计确诊超过200万例，累计死亡超过13万例，亟需开发新冠病毒疫苗阻断病毒传播，保护人类健康。
3.在疫苗研制过程中，为了制备安全有效的疫苗，必须考虑佐剂的使用。佐剂与疫苗成份配伍，可以形成稳定、安全、具有免疫原性的疫苗复合物。因此，对疫苗使用的佐剂进行研究一直是疫苗研究过程中的重要环节。佐剂作为非特异性免疫增强剂对疫苗接种后诱导有效的免疫应答，发挥着至关重要的作用。
4.传统一般采用铝盐佐剂，包括氢氧化铝和磷酸铝和其组合物的应用最为广泛。尽管上述佐剂被广泛批准应用于疫苗制备中，但在实际应用中，单独使用低剂量的铝盐佐剂对疫苗的免疫增强作用有限，而提高剂量的铝盐佐剂在使用时常出现一些副作用，如注射部位肿胀、出现肉芽肿、发烧、疼痛、发生过敏等副反应。因此，研制更为广谱、安全、高效，同时便于生产和使用的理想疫苗迫在眉睫。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案。
6.第一方面，本发明提供了一种covid-19灭活疫苗组合物，其包含cpg寡聚脱氧核苷酸作为佐剂。
7.进一步地，作为本发明的一个优选实施方式，covid-19灭活疫苗组合物还包含covid-19灭活病毒株。
8.作为本发明的一个优选实施方式，所述cpg寡聚脱氧核苷酸的所有核苷酸均为硫代修饰，且所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有至少2个cpg单元，其链长至少为20bp；进一步优选地，所述cpg寡聚脱氧核苷酸序列为：
[0009]5’-
tgactgtgaacgttcgagatga-3’；或
[0010]5’-
tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’；或
[0011]5’-
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’。
[0012]
作为本发明的一个优选实施方式，所述covid-19灭活病毒株具有纤突蛋白、包膜蛋白和膜蛋白。所述covid-19灭活病毒株通过利用福尔马林或者β丙内酯对covid-19病毒株进行灭活制得。
[0013]
作为本发明的一个优选实施方式，所述covid-19灭活病毒株在灭活之前利用vero细胞体外培养covid-19病毒株。
[0014]
作为本发明的一个优选实施方式，所述灭活疫苗组合物中covid-19灭活病毒株的含量为0.5～20μg/剂；进一步优选地，所述灭活疫苗组合物中所述covid-19灭活病毒株的含量为1μg/剂、2μg/剂、3μg/剂或10μg/剂。
[0015]
作为本发明的一个优选实施方式，所述灭活疫苗组合物中所述cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂含量为0.25～5mg/剂；进一步优选地，所述灭活疫苗组合物中cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂的含量为0.25mg/剂、1mg/剂、2mg/剂或5mg/剂。
[0016]
作为本发明的一个优选实施方式，所述灭活疫苗组合物为液体疫苗，进一步优选为肌肉内液体注射剂、鼻腔内液体喷剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。
[0017]
第二方面，本发明提供了所述的灭活疫苗组合物在制备用于预防和/或治疗covid-19感染引起的疾病的药物中的应用。进一步优选地，所述疾病为肺炎及综合征，严重急性呼吸道感染，肠道疾病，心脏衰竭，肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。
[0018]
第三方面，本发明提供了cpg寡聚脱氧核苷酸作为covid-19灭活疫苗组合物的佐剂的用途，所述cpg寡聚脱氧核苷酸的所有核苷酸均为硫代修饰，且所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有至少2个cpg单元，其链长至少为20bp；优选地，所述cpg寡聚脱氧核苷酸序列为：
[0019]5’-
tgactgtgaacgttcgagatga-3’；或
[0020]5’-
tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’；或
[0021]5’-
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’。
[0022]
cpg是指由胞嘧啶(cytosine,c)与鸟嘌呤(guanine，g)经磷酸二酯键(phosphodiesterbonds，p)相连组成的二核苷酸，cpg二核苷酸及其5'端和3'端的各两个碱基构成cpg基序(cpg motifs)。cpg基序也被称为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence,iss)，而cpg odn是指含有非甲基化的cpg基序的寡聚脱氧核苷酸。由于在脊椎动物基因组中cpg二核苷酸的出现频率较低，并且多为甲基化，而在细菌基因组中cpg二核苷酸的出现率较高且多为非甲基化，因此，脊椎动物的免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptors,prrs)将细菌基因组中的cpg dna这一特点作为一种危险刺激信号进行识别，进而刺激机体产生免疫保护反应。
[0023]
本发明使用cpg寡聚脱氧核苷酸作为covid-19灭活疫苗的佐剂，可以起到增强免疫效果，延长免疫时间，减少抗原用量的效果。
[0024]
优选所述cpg寡聚脱氧核苷酸的所有核苷酸均为硫代修饰，且所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有至少2个cpg单元，其链长至少为20bp；进一步优选地，所述cpg寡聚脱氧核苷酸序列为：
[0025]5’-
tgactgtgaacgttcgagatga-3’；或
[0026]5’-
tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’；或
[0027]5’-
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’。
[0028]
从免疫应答机理上来讲，cpg odn能够促进树突状细胞、巨噬细胞以及b细胞的成熟和活化，上调cd80、cd86、cd40和mhc
-ⅱ
分子的表达，促进il-6、il-12、ifn-γ等thl型细胞因子的分泌，诱导机体产生thl型免疫反应。此外，cpg odn经内吞作用摄入免疫细胞后，被细胞中内体/溶酶体上的tlr9识别并与其结合，导致tlr9二聚体化，最终促使相关免疫细胞分泌一系列的细胞因子及趋化因子，触发胞内的杀菌机制或诱发炎症反应，产生强ctl诱导效应。而且，通过避免使用铝盐佐剂，也可以减少th2型免疫刺激，从而降低发生ade风险。
[0029]
本发明使用cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂与covid-19灭活疫苗按配方组合后，可产生强烈的免疫应答效果，可以很大程度的延长ovid-19灭活疫苗在体内的滞留时间，降低了各种水解酶对其的水解作用。并且制备方法简单，质量易于控制，易于规模化生产；且安全性好，毒副作用低，特别适合在各类人群，包括中老年等免疫功能低下的人群中用于covid-19的预防和治疗。
[0030]
本发明提供的covid-19灭活疫苗组合物中的covid-19灭活病毒株的制备过程为：从临床患者分离的covid-19病毒株经工业化大规模培养得到高浓度covid-19病毒液，并成功探索出有效灭活所述covid-19的灭活方法及纯化方法，制备得到covid-19灭活病毒株。
[0031]
其中灭活方法包括利用福尔马林或者β丙内酯进行灭活。优选地，对获得的高浓度covid-19病毒液进行灭活。
[0032]
采用福尔马林进行灭活，福尔马林的浓度为福尔马林与病毒液的体积比为1：1000-1：4000，灭活时间为3-13小时。优选地，为了安全起见，灭活时间为9-39小时或更长时间以达到将所有病毒灭活。优选地，37℃下搅拌灭活四天。
[0033]
采用β丙内酯进行灭活，β丙内酯浓度为β丙内酯与病毒液的体积比1：4000-1：6000，灭活时间为16-24小时。优选地，为了安全起见，灭活时间为48-72小时或更长时间以上以达到将所有病毒灭活。优选地，4℃下搅拌灭活20小时。然后，室温放置2天，或37℃作用2小时以分解β丙内酯。
[0034]
灭活液的纯化方法，包括以下步骤：
[0035]
(1)对病毒灭活液进行澄清；
[0036]
(2)对步骤(1)获得的病毒澄清液进行浓缩；以及
[0037]
(3)对步骤(2)获得的病毒浓缩液进行核酸酶消化处理，以消化宿主dna，获得纯化的病毒原液。
[0038]
优选地，步骤(1)中，将病毒灭活液在2000～4000g离心力下，离心30min，去掉沉淀，收获上清即为病毒澄清液。优选地，在2-8℃下进行离心。或者，步骤(1)中，将病毒灭活液通过深层膜堆进行过滤澄清后，再经0.2微米滤器过滤，即为病毒澄清液。优选地，深层膜堆可采用硅藻土的深层膜堆。
[0039]
优选地，步骤(2)中经超滤浓缩对病毒澄清液进行浓缩。优选地，采用两级超滤浓缩对病毒澄清液进行浓缩，第一级超滤浓缩，优选使用100kda孔径的膜包，浓缩约20-40倍，第二级超滤浓缩，优选采用300kda孔径的膜包，使用pbs透析5-8次，浓缩约4-8倍。优选地，pbs的浓度为0.01mol，ph为7.4。
[0040]
优选地，在步骤(2)之后进行密度梯度离心精纯病毒。优选地，利用蔗糖密度梯度离心进行。高蔗糖浓度为50-60％wv，低蔗糖浓度为25-35％wv，2-8℃下，28000-40000rpm离心16-20小时，获得超离液。
[0041]
优选地，在密度梯度离心之后进行层析，优选地，利用sepharose four fast flow对超离液进行层析，洗脱液0.01m pbs，收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
[0042]
优选地，将病毒精纯液通过超滤浓缩约10倍后，添加benzonase核酸酶消化宿主dna。在酶切中，benzonase浓度为25-50u/ml，搅拌2-4小时，静置14-20小时，超滤去除多余的benzonase核酸酶。
[0043]
优选地，经0.22μm膜除菌过滤或者经辐照灭菌的方法除菌，获得病毒原液。辐照灭
菌采用4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品60分钟。
[0044]
一方面，所述的covid-19病毒株具有covid-19病毒的纤突蛋白(spike蛋白，下文简称s蛋白)、包膜蛋白和膜蛋白，能够引起机体体液免疫反应产生中和抗体。
[0045]
另一方面，所述covid-19病毒株为灭活病毒株。接种vero-e6细胞或者vero细胞后不引起vero-e6细胞或者vero细胞的病变。使用vero细胞作为基质体外培养covid-19病毒，可以选择平面培养，如使用细胞工厂培养，也可以选择悬浮培养，如采用微载体在细胞发酵罐中悬浮培养。
[0046]
本发明提供的灭活疫苗的制备方法，包括：
[0047]
(1)从临床患者分离的covid-19病毒株经工业化大规模培养得到高浓度covid-19病毒液；
[0048]
(2)对covid-19病毒液进行灭活，获得灭活的covid-19病毒灭活液；
[0049]
(3)对灭活液进行纯化，获得纯化的病毒原液；以及
[0050]
(4)将病毒原液与cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂混合获得灭活疫苗。
[0051]
本发明提供的covid-19灭活疫苗组合物，通过所述cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂和抗原有效成分covid-19灭活病毒株的组合，制备而成的灭活疫苗可用于制备预防或治疗covid-19感染引起的疾病的药物，能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。所述疾病例如为covid-19感染引起的肺炎和综合征，严重急性呼吸道感染，肠道疾病，心脏衰竭，肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。
[0052]
本发明提供的灭活疫苗可以快速制备，适用于covid-19疫情的控制。
[0053]
本发明提供的疫苗优选为液体疫苗，可以采用多种剂型形式。具体而言，所述灭活疫苗可以是肌肉内液体注射剂、鼻腔内液体喷剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。在实际应用时，可以根据转染效率、局部免疫监视等临床需要进行调整和选择，如选择单一的剂型进行注射免疫，或者选择多种混合剂型进行注射免疫。
[0054]
本发明通过对cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂与covid-19灭活病毒株的结合配比进行研究，确定了最高效的配比方案。本发明提供的covid-19灭活疫苗可产生强烈的免疫应答效益。并且，该灭活疫苗制备方法简单，质量易于控制，易于规模化生产。本发明提供的灭活疫苗组合物可用于有效预防和治疗covid-19感染引起的肺炎，甚至是严重呼吸道感染，将为在我国乃至全世界范围内的疾病的防控提供技术保障。
附图说明
[0055]
图1为不同cpg佐剂的covid-19灭活疫苗免疫balb/c小鼠的血清igg效价示意图；
[0056]
图2为血清中特异性表达s蛋白细胞因子的结果示意图。
具体实施方式
[0057]
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明实施例仅仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0058]
实施例1
[0059]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活
病毒株组合。
[0060]
具体为：将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的灭活并纯化后的疫苗原液(即病毒原液)，使佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)0.5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200401。
[0061]
实施例2
[0062]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)1μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200402。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)2μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200403。
[0065]
实施例4
[0066]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)4μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200404。
[0067]
实施例5
[0068]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)0.5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200405。
[0069]
实施例6
[0070]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)1μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200406。
[0071]
实施例7
[0072]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)2μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200407。
[0073]
实施例8
[0074]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)4μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200408。
[0075]
实施例9
[0076]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)0.5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200409。
[0077]
实施例10
[0078]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)1μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200410。
[0079]
实施例11
[0080]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)2μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200411。
[0081]
实施例12
[0082]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)4μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200412。
[0083]
实施例13
[0084]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)0.5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200413。
[0085]
实施例14
[0086]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)1μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200414。
[0087]
实施例15
[0088]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)2μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200415。
[0089]
实施例16
[0090]
本实施例提供了一种灭活疫苗，使用cpg寡聚脱氧核苷酸为佐剂，和covid-19灭活病毒株组合。该疫苗为液体疫苗，将cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量(即covid-19灭活病毒株含量)4μg/剂。将本实施例
所得疫苗编号记为20200416。
[0091]
以上各实施例使用的佐剂cpg寡聚脱氧核苷酸序列为：
[0092]5’-
tgactgtgaacgttcgagatga-3’。
[0093]
实施例17：佐剂效果在小鼠模型上的免疫学评价
[0094]
一、中和抗体效价测定
[0095]
按照表1所示，将实施例1-8提供的8组疫苗分别用生理盐水做1:4、1:16、1:64稀释，使用1ml注射器，接种balb/c小鼠，每组10只，按照0，7天免疫，每只腹腔注射一个剂量，第1次免疫后4周采血，检测中和抗体。中和抗体效价gmt大于8的视为阳性，视为有保护效果。测定结果如表2所示。
[0096]
表1为佐剂效果在小鼠模型上的免疫学评价实验设计。
[0097]
表1
[0098][0099][0100]
表2为不同cpg佐剂的covid-19灭活疫苗免疫balb/c小鼠的中和效价。
[0101]
表2
[0102][0103]
由表2结果可见，上述不同有效成分和佐剂含量的covid-19疫苗免疫balb/c小鼠，均能产生足够高的中和抗体效价。佐剂含量高的疫苗免疫原性相对高于含量低的同样有效成份的疫苗。本发明提供疫苗均能诱导balb/c小鼠产生有保护能力的中和抗体。
[0104]
二、igg抗体效价测定
[0105]
按照表1所示，将实施例1-8提供的8组疫苗进行igg抗体效价测定。igg抗体效价检测方法如下：
[0106]
将covid-19病毒按蛋白浓度1μg/ml、100μl/孔包被于酶标板，2-8℃包被过夜或37℃包被2小时以上，洗板拍干，采用含1％bsa或10％小牛血清的0.01m pbs进行封闭，200μl/孔封闭，37℃封闭1-2小时，甩去其中液体，排干待用。将待检样品及阴性血清对照采用上述封闭液系列稀释，100μl每孔加入封闭后的酶标板，37℃孵育60-70分钟，洗板拍干；加入对应抗种属的hrp酶标抗体，37℃孵育45-60分钟，洗板拍干；加入显色a/b液各50μl，37℃显色10-15分钟后，加入2m h2so4终止。结果分析：样品od值≥阴性血清相同稀释倍数下od值的2.1倍时的最高稀释倍数即为样品的igg抗体效价。若阴性对照od值小于0.05，则按0.05计算。
[0107]
结果如图1所示，图1为不同cpg佐剂的covid-19灭活疫苗免疫balb/c小鼠的血清igg效价图。
[0108]
实施例18：细胞因子检测
[0109]
将表1中的疫苗按照0、7天免疫，28天采血的程序分别免疫balb/c小鼠，采集细胞上清进行细胞免疫检测。采用细胞内细胞因子染色法和流式细胞法检测血清中特异性表达s蛋白细胞因子的cd4+t细胞。具体如下。
[0110]
(1)脾淋巴细胞的分离
[0111]
颈椎脱臼处死小鼠，于70％酒精浸泡约3min。将小鼠于生物安全柜内无菌取出脾脏，放到置于无菌平皿中的200目细胞筛上。加入10ml rpmi1640完全培养基，用注射器活塞将脾轻柔地研磨成单个细胞，再用10ml rpmi1640完全培养基冲洗细胞筛，以获得更多的脾细胞。将脾细胞悬液转移至50ml离心管中，500g水平离心5min。弃上清，细胞用3m|1
×
红细胞裂解液重悬，室温裂解5min，加入27ml rpmi1640完全培养基，500g水平离心5min。弃上清，细胞再用20ml rpmi1640完全培养基清洗一次，用适量培养基重悬，经200目细胞筛过滤至10ml试管中，取50μl稀释20倍后进行计数，待用。
[0112]
(2)小鼠脾细胞的体外刺激
[0113]
将以上分离的小鼠脾细胞取适量稀释至4
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106cells/ml，每孔0.5ml加入到24孔板中。每只小鼠分别设置特异ctl表位刺激孔和无刺激孔。特异表位浓度为每条肽2μg/ml，无刺激加入等量的dmso。作为阳性对照，加入pma和ionomycin刺激孔，其中pma浓度为100ng/ml，ionomycin浓度为1μg/ml。同时每孔加入1μl brilliant violet 421tm anti-mouse cd107a。细胞于37℃、5％co2细胞培养箱中培养1小时后，每孔各加入适量的golgistop和(或)golgiplug作为细胞因子分泌的阻断剂。总共培养6小时后进行相关抗原的染色，用于细胞内细胞因子的流式细胞术检测。
[0114]
(3)细胞表面抗原和细胞内细胞因子染色
[0115]
脾细胞经体外刺激6小时后，转移至流式管中，4℃，500g离心5分钟，弃上清。用pbs+2％fbs按说明书推荐的使用量先稀释好适量的荧光标记抗体percp/cy5.5-conjugated anti-cd3(clone 145-2c11)和fitc conjugated anti-cd8(clone 53-6.7)，每管加入50μl，轻轻混匀，4℃放置30分钟。30分钟后，每管加入3ml pbs+2％fbs，4℃，500g离心5分钟，弃上清。每管加入200μl cytofix/cytopermtm fixation and permeabilizaiton solution，于4℃放置20分钟，对细胞进行固定和穿孔。20分钟后，每管加入1ml1
×
perm/washtm buffer，4℃，600g离心5分钟，弃上清。用1
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perm/washtm buffer按说明书推荐使用量先稀释好适量的pe conjugated anti-ifn-γ(clone xmg1.2)抗体，每管加50μl，轻轻混匀，于4℃放置30分钟。最后，每管分别用1ml1
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perm/washtm buffer和3ml的pbs各洗一次，弃上清后用200μl pbs重悬，上机检测。为了在检测时调节各染料间的荧光补偿，设置不染色管、单染percp/cy5.5-conjugated anti-cd3管、单染fitc conjugated anti-cd8管和单染peconjugated anti-ifn-γ管，其中pe conjugated anti-ifn-γ单染管使用的是阳性刺激的细胞。
[0116]
(4)流式细胞术检测
[0117]
使用bd facs cantotm进行流式细胞术检测。首先各通道调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节各染料间的荧光补偿，然后依次上样，收集数据。
[0118]
(5)细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果
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细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果显示，免疫小鼠的脾细胞经表位刺激后，cd4+t细胞可大量分泌ifnγ和il-2细胞因子，表达水平显著高于对照组。结果如图2显示。
[0120]
图2结果显示，在本发明提供的抗原含量范围内的疫苗均能引起良好的细胞免疫。
[0121]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中
的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0122]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0123]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。