秦皮素治疗骨关节炎的应用

1.本发明涉及秦皮素，具体地，涉及秦皮素在治疗、缓解或预防骨关节炎药物上的应用。


背景技术：

2.骨关节炎(oa)是一种以软骨破坏为特征的复杂关节疾病。消瘀散为伤科经验方，临床疗效佳，但是临床发现oa多有热证表现，故拟加入清热药物对消瘀散进行改良，但传统的清热药物，效果并不理想。


技术实现要素：

3.本发明旨在克服上述缺陷，对秦皮素的作用和机制进行了研究，发现秦皮素通过抑制软骨细胞凋亡，炎症与细胞外基质分解代谢，可减轻m ia诱导的oa大鼠模型中膝关节的软骨破坏与炎症。
4.本发明提供了一种活性成分的用途，其特征在于：
5.上述活性成分选自秦皮素、或其类似物或衍生物；
6.本发明的秦皮素由中药秦皮提取而得，纯度大于99％；
7.上述秦皮素为如下结构所示的化合物：
[0008][0009]
上述活性成分用于降低血清软骨转换与炎症生物标志物的表达水平。
[0010]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0011]
上述活性成分用于制备治疗、预防或缓解骨关节炎的药物。
[0012]
上述活性成分为有效量的用量标准，一般来说根据药物的制剂形式可在常规配方量上进行调整，如：针对大鼠给予秦皮素，关节腔注射(5mg/kg/day，溶于50μl生理盐水中)。
[0013]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0014]
上述治疗或预防骨关节炎的药物为经胃肠道给药剂型或经胃肠道以外给药途径剂型。
[0015]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0016]
上述经胃肠道给药剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂；
[0017]
上述经胃肠道以外给药途径剂型选自注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。
[0018]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0019]
上述活性成分用于制备消瘀散、消瘀宣痹散或其改进方。
[0020]
上述活性成分占消瘀散、消瘀宣痹散或其改进方总重量的1-50％。
[0021]
在本发明中，消瘀散为魏氏伤科传承经验方：即、消瘀散贴膏(大黄，蒲公英，紫荆皮，三七，蒲黄，乳香，没药，五灵脂，苏木，老鹳草，刘寄奴，地鳖虫，丹参，泽兰，续随，当归)；
[0022]
消瘀宣痹散为消瘀散的改进方，由传统消瘀散中的4-7味组成，其配方方案可以为大黄、紫荆皮、乳香、三七、当归、秦皮、牛膝。
[0023]
改进方指对消瘀散或消瘀宣痹散的进一步的改进。
[0024]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0025]
上述活性成分还用于改善骨关节的软骨结构缺损破坏、软骨细胞凋亡、蛋白聚糖丢失及相关的骨关节炎症状。
[0026]
即、上述活性成分可用于制备改善骨关节的软骨结构缺损破坏、软骨细胞凋亡、蛋白聚糖丢失及相关的骨关节炎症状的药物。
[0027]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0028]
上述活性成分还用于抑制软骨细胞凋亡、炎症与细胞外基质分解代谢。
[0029]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0030]
上述活性成分还用于降低il-1β诱导的caspase3、caspase8蛋白表达量和tunel阳性细胞率。
[0031]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0032]
上述活性成分还用于降低il-1β诱导的tlr4、myd88、nf-κbp65、tnf-α和il-6的蛋白表达水平，并增加了iκbα的表达量。
[0033]
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征在于：
[0034]
上述活性成分还用于抑制il-1β诱导的ii型胶原的降解和mmp-13的分泌。
附图说明
[0035]
图1、图1.秦皮素对碘乙酸单钠(mia)诱导的骨关节炎(oa)大鼠模型的组织形态的影响；
[0036]
其中，图1a为h&e染色对比图；
[0037]
图1b为番红固绿染色对比图；
[0038]
图1c为oarsi评分图；
[0039]
图1d为mankin’s评分图；
[0040]
图1e为mri成像对比图；
[0041]
**p<0.01(相对于假手术组)，#p<0.05(相对于mia组)，n＝3。
[0042]
图2.秦皮素对oa大鼠模型的软骨降解和炎症生物标志物的影响；
[0043]
其中，图2a为大鼠血清软骨降解标志物ctx
-ⅱ
表达；
[0044]
图2b为大鼠血清炎症标志物tnf-α表达；
[0045]
*p<0.05(与假手术组相比)，#p<0.05(与mia组相比)，n＝6。
[0046]
图3.秦皮素对软骨细胞活性的影响；
[0047]
其中，图3a为不同浓度秦皮素干预正常软骨细胞毒理测定；
[0048]
图3b为不同浓度秦皮素干预oa软骨细胞活力测定；
[0049]
#p<0.05(与对照组相比)；*p<0.05和**p<0.01(与il-1β组相比)。
[0050]
图4.秦皮素对软骨细胞凋亡的影响
[0051]
其中，图a-c为caspase3与caspase8蛋白表达水平；
[0052]
图d-e为tunel阳性细胞率；
[0053]
***p<0.001(相对于对照组)；#p<0.05，##p<0.01(与il-1β组相比)，n＝3。
[0054]
图5.秦皮素对软骨细胞的炎症蛋白表达的影响
[0055]
其中，图a-g为tlr4、myd88、nf-κbp65、iκbα、tnf-α、il-6的蛋白表达**p<0.01(与对照组相比)；
[0056]
图5h为p65蛋白入核图；
[0057]
#p<0.05，##p<0.01(与il-1β组)，n＝3。
[0058]
图6.秦皮素对软骨细胞中ecm降解的影响
[0059]
其中，图6a-c为ii型胶原与mmp-13的蛋白表达；
[0060]
图6d为ii型胶原的免疫荧光图像；
[0061]
**p<0.01(与对照组相比)；#p<0.05(与il-1β组相比)，n＝3。
具体实施方式
[0062]
在本实施例中，选取活性物质秦皮素为例进行了如下实验。
[0063]
关于秦皮素其具体结构如下所示:
[0064][0065]
一、动物实验
[0066]
选取3月龄雄性sd大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体重180
–
220g，n＝18，spf级)，单膝mia法建立oa大鼠模型，患膝注射秦皮素干预4周；
[0067]
具体大鼠分组与造模方法：
[0068]
模型组：右膝关节腔注射mia造模；
[0069]
干预组：右膝关节腔注射mia造模；
[0070]
对照组：右膝关节腔注射50μl生理盐水模拟造模；
[0071]
造模方法：大鼠称重后腹腔注射10％的水合氯醛(0.3ml/100g)，右膝关节剃毛后，用碘伏和酒精进行消毒。大鼠右膝关节屈曲90
°
，沿髌骨下缘，髌韧带外侧，朝向关节腔方向进针，针尖有明显突然落空感即为进入关节腔，缓慢推药，拔针后伸直-屈曲3次，活动右膝关节，左侧膝关节均不作处理，术后常规实验室条件及正常饮食饲养。
[0072]
具体干预方式如下：
[0073]
大鼠造模第2天开始治疗干预，给药剂量如下：
[0074]
给药组：大鼠给予秦皮素，关节腔注射(5mg/kg/day，溶于50μl生理盐水中)；
[0075]
模型组：大鼠关节内注射5mg/kg/day的盐水；
[0076]
对照组：大鼠关节内注射5mg/kg/day的盐水；
[0077]
进针方式与造模方式同，即、每天注射1次，连续4周。
[0078]
1.1组织学及影像评估
[0079]
大鼠膝关节切片组织学染色：组织学染色采用h&e与番红固绿染色，以评估软骨变
性的程度。
[0080]
h&e染色用于检测软骨结构，软骨细胞形态，软骨细胞分层，潮线完整性；番红固绿染色用于关节软骨基质中蛋白聚糖浓度。
[0081]
具体步骤如下：
[0082]
用4％多聚甲醛固定大鼠新鲜膝关节软骨。
[0083]
用20％edta脱钙4周。
[0084]
样品包埋在石蜡中。
[0085]
矢状面切片，制备成5μm连续切片。
[0086]
将切片浸入二甲苯中进行脱石蜡处理，并用一系列逐渐降低浓度的乙醇溶液(100-80％)进行水化。
[0087]
脱石蜡后，用苏木精-伊红、番红固绿染色。
[0088]
用流水洗涤后，用一系列逐渐增加浓度的乙醇溶液(80
–
100％)和二甲苯使切片脱水，然后盖上盖玻片。
[0089]
在光学显微镜下观察染色的标本。
[0090]
如前所述，采用mankin评分系统，根据病理学变化评估软骨退化的严重程度。
[0091]
1.1.1he染色结果
[0092]
如图1a所示，sham对照组软骨结构正常，软骨表面光滑，细胞分层规则，潮线完整规则，表明软骨正常。
[0093]
mia组软骨结构紊乱，无法区分分层，软骨表面粗糙，大面积缺损，裂缝深。局部软骨细胞变性伴随核浓缩而明显，表明软骨细胞群体发生凋亡变化，潮线消失。病变已穿透软骨到达软骨下骨和骨小梁，导致软骨下骨致密层变薄，骨小梁塌陷，完全失去秩序，表明软骨严重受损。
[0094]
mia+秦皮素组软骨表面粗糙，局部缺损，裂缝小，潮线轻微紊乱，偶尔断裂，细胞数量，密度和细胞簇增加，可见活跃的细胞增殖，血管穿孔软骨下骨至钙化软骨层，出现成纤维细胞样软骨细胞，表明软骨已进入代偿反应阶段。
[0095]
1.1.2番红固绿染色结果
[0096]
如图1b所示，sham对照组蛋白聚糖的番红染色均匀分布，结构完整，潮线清晰连续，表明软骨正常。
[0097]
mia组软骨基质几乎没有番红染色，软骨结构混乱，无潮线，表明软骨的蛋白聚糖丢失严重。
[0098]
mia+秦皮素组番红染色分布不均匀，深浅不一，局部缺损，潮线不清晰且不连续。表明软骨的蛋白聚糖部分丢失，局部出现活跃的细胞增殖代偿现象。
[0099]
1.1.3mankin's评分结果
[0100]
如图1c和表1所示，mia诱导的oa大鼠的评分显著高于对照组的大鼠(p<0.05)，mia+秦皮素组的评分显著低于mia组(p<0.05)。
[0101]
表1大鼠组织学评分
[0102][0103]
**
p<0.01(相对于假手术组)，
#
p<0.05(相对于mia组)，n＝3
[0104]
1.1.4oarsi评分结果
[0105]
如图1d和表2所示，mia诱导的oa大鼠的评分显著高于对照组的大鼠(p<0.05)，mia+秦皮素组的评分显著低于mia组(p<0.05)。
[0106]
表2大鼠血清标志物表达量
[0107][0108][0109]
*p<0.05(相对于sham组)，#p<0.05(相对于mia组)，n＝6
[0110]
1.1.5mri成像结果
[0111]
如图1e所示：sham对照组关节软骨结构完整，厚度均匀；
[0112]
mia组关节软骨出现局灶性肿胀增厚，局部缺损并侵蚀软骨下骨；
[0113]
mia+秦皮素组关节软骨无肿胀，局部较小缺损，厚度与对照组相比稍薄。
[0114]
上述结果表明，秦皮素减轻了大鼠oa模型中的软骨破坏与变性。
[0115]
1.2血清学评估
[0116]
如图2和表2所示的大鼠血清elisa结果表明：
[0117]
基线时：三组大鼠的软骨降解血清标志物ctx-ii(图2a)与血清炎症标志物tnf-α(图2b)表达水平无明显差异，不具有统计学意义(p>0.05)；
[0118]
在造模及干预4周后：
[0119]
mia组大鼠血清ctx-ii与tnf-α的表达与对照组相比均显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)；mia+秦皮素大鼠血清ctx-ii与tnf-α的表达与mia组相比均显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0120]
以上结果表明，秦皮素抑制了oa大鼠体内软骨降解生物标志物comp与ctx-ii的表达。
[0121]
二、细胞实验
[0122]
具体实验方法为：
[0123]
a.采用cck-8检测用于分析秦皮素对软骨细胞活性的影响。
[0124]
具体步骤如下：
[0125]
将软骨细胞接种到96孔板中，每孔5
×
103个细胞，并培养24h。
[0126]
将细胞单独用il-1β(10ng/ml)孵育或与秦皮素(0、1、10、50和100μm)结合孵育24
小时。
[0127]
细胞计数试剂盒8(cck-8)分析用于确定细胞活力，每孔加入10μl cck-8溶液(溶于100μl培养基中)，在37℃，5％co2中孵育1h。
[0128]
使用微板分光光度计(biotek，vermont，usa)在450nm的波长下测量溶液的吸光度。
[0129]
以上实验独立重复3次。
[0130]
b.细胞蛋白提取
[0131]
提前配置裂解液：ripa+10％pmsf+10％磷酸酶抑制剂，放在冰上。
[0132]
弃细胞培养液，pbs轻轻清洗3次，加入裂解液，均匀薄薄铺满细胞培养板，放在冰上。
[0133]
用刮板将细胞刮下，可对光查看是否刮干净，装入1.5mlep管中，吹打混匀。
[0134]
4℃预冷离心机，设置12000rpm，20min，将ep管放入，离心结束后取出，取留上清，部分测定浓度，其余煮沸后-20℃保存。
[0135]
c.bca蛋白浓度测定
[0136]
1.取少量细胞蛋白用蒸馏水稀释为10x。
[0137]
2.将bca试剂盒中a,b两液按50/1比例配置。
[0138]
3.测试板上分别加入0、1、2、4、8、12、16、20μl的标准品，每个孔加蒸馏水至20μl。样品孔每个加稀释后的样品20μl，每个样做3个复孔。
[0139]
4.加工作液200μl于每孔中，室温避光30min后，酶标仪测定562nm波长吸光度值，制作标准曲线，计算出样品蛋白浓度。
[0140]
d.蛋白免疫印迹
[0141]
电泳:
[0142]
1.用900毫升ddh2o稀释100毫升10xtris-甘氨酸电泳缓冲液，制成1x。
[0143]
2.将凝胶玻璃板卡在电泳槽中，将300
–
350ml的1x电泳缓冲液缓缓加到两块凝胶之间。
[0144]
3.轻轻拔出梳子，每个样品吸取20μg上样到凝胶的各个泳道中，左右分别加5μl、3μl的marker做标记。
[0145]
4.连接电源，80v电压下运行，注意观察，至marker清晰分出条带，到达分离胶，此过程约20-30分钟。此时电压调至120v，直至溴酚蓝前沿到达凝胶底部为止。
[0146]
5.立即进行蛋白质转移。
[0147]
转膜:
[0148]
在凝胶电泳结束前几分钟准备进行蛋白质转膜
[0149]
1.用镊子将pvdf膜在甲醇中润湿60s后转移到带有转膜缓冲液的容器中。
[0150]
2.用转膜缓冲液浸泡四个海绵，清除海绵上的所有气泡。
[0151]
3.用转膜缓冲液润湿滤纸，清除气泡。
[0152]
4.打开凝胶盒，切断多余凝胶，放入转膜液。
[0153]
5.按凝胶大小裁剪pvdf膜
[0154]
6.按照海绵-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵的顺序装置成三明治结构
[0155]
7.装入转膜槽，槽中放入冰盒，转膜槽置于冰中吸热。
[0156]
8.连接电源，100v电压下转50分钟
[0157]
封闭:
[0158]
膜蛋白面朝上置于快速封闭液溶液中，摇床上室温封闭1h。
[0159]
抗体孵育:
[0160]
1.提前按照说明书比例，用一抗稀释液配置好一抗溶液，将pvdf膜在一抗溶液中孵育，摇床上4℃过夜。
[0161]
2.膜置于1xtbst溶液中，摇床上室温漂洗10min，共3次。
[0162]
3.提前按照1：2000比例用二抗稀释液配置好二抗溶液，将pvdf膜在二抗溶液中室温孵育1小时。
[0163]
4.膜置于1xtbst溶液中，摇床上室温漂洗10min，共3次。
[0164]
成像与分析:
[0165]
1.在最后一次tbst洗涤期间，根据试剂盒说明避光混合好ecl发光液。
[0166]
2.将pvdf膜蛋白面朝上，轻轻吸取表面残留液体，滴加ecl试剂，室温避光孵育5分钟。
[0167]
3.使用chemidoc mp成像系统(美国加利福尼亚州bio-rad)，将膜放入成像仪中，设置成像仪参数，调整曝光时间，成像并保存。
[0168]
4.使用image j软件进行统计分析。
[0169]
5.以上实验重复3次。
[0170]
e.免疫荧光
[0171]
免疫荧光用于评估软骨细胞中胶原蛋白ii变化。
[0172]
1.将软骨细胞接种到6孔板中，然后将细胞用单纯il-1β(10ng/ml)孵育或与秦皮素(50μm)共孵育24小时。
[0173]
2.使用4％多聚甲醛固定20min，然后将样品在pbs中冲洗3次。
[0174]
3.使用在pbs中稀释的0.1％triton x-100透化15分钟。
[0175]
4.将细胞用5％牛血清白蛋白在37℃封闭1h，
[0176]
5.用pbs冲洗，并与在胶原ii一抗孵育，于4℃过夜。
[0177]
6.pbs冲洗3次后，加二抗在37℃避光孵育1小时。
[0178]
7.用0.1％dapi避光染色5分钟。
[0179]
8.使用荧光显微镜(奥林巴斯，东京，日本)观察软骨细胞。
[0180]
f.tunel
[0181]
tunel用于检测凋亡软骨细胞
[0182]
1.制作细胞爬片：细胞悬液接种至放有盖玻片的6孔板中，每孔1x105密度，至细胞贴壁。
[0183]
2.将软骨细胞用单纯il-1β孵育或与秦皮素(50μm)联合孵育24小时。
[0184]
3.将盖玻片取出，自然干燥后用4％pfa固定30min，结束后用pbs洗涤3次。
[0185]
4.用含0.1％triton x-100的pbs渗透10分钟，结束后用pbs洗涤3次。
[0186]
5.加50μltunel混合反应液，37℃下避光进行反应1h，之后pbs冲洗3次。
[0187]
6.dapi室温避光染色5分钟。
[0188]
7.洗掉染色液后用荧光防淬灭封片剂封片。
[0189]
8.使用荧光显微镜(奥林巴斯，东京，日本)拍摄图像，每张切片取3个视野，计tunel阳性细胞与总细胞数，得出阳性率。
[0190]
g.统计学分析
[0191]
统计分析数据表示为均值
±
标准差。使用tukey的多重比较检验进行单向方差分析(anova)计算统计差异。当p<0.05时表示具有统计学意义。
[0192]
具体结果如下：
[0193]
2.1秦皮素对软骨细胞活性的影响
[0194]
2.1.1细胞毒理实验结果
[0195]
如图3a所示：
[0196]
1、5、10、50、100μm的秦皮素对细胞活性无显著影响，即上述浓度无明显细胞毒性。
[0197]
2.1.2细胞活力实验结果
[0198]
如图4b所示：
[0199]
il-1β(10ng/ml)给药刺激后，细胞活性显著降低(p<0.05)；
[0200]
细胞活性随着秦皮素浓度(1、5、10、50、100μm)增加而升高；当秦皮素浓度为10μm时，细胞活性相比单纯il-1β给药刺激时显著增加(p<0.05)；当秦皮素浓度为50μm和100μm时，细胞活性相比单纯il-1β给药刺激时极显著增加(p<0.01)。
[0201]
上述实验说明，秦皮素无明显直接细胞毒性，且部分抑制了il-1β诱导的软骨细胞凋亡，表现出软骨细胞保护作用。
[0202]
2.2秦皮素对软骨细胞凋亡的影响
[0203]
2.2.1caspase3、caspase8表达结果
[0204]
如图4a-4c所示：
[0205]
细胞与il-1β(10ng/ml)孵育后，caspase3和caspase8蛋白表达量显著增加，与对照组相比具有统计学差异(p<0.01)；
[0206]
秦皮素预给药干预(10μm，50μm)后，caspase3和caspase8蛋白表达量与il-1β刺激组相比显著降低，差异具有统计学差异(p<0.05)。
[0207]
2.2.2tunel荧光结果
[0208]
如图4d所示：在同样大小的视野中，细胞与il-1β(10ng/ml)单纯孵育后，凋亡细胞比对照组增多，而秦皮素预处理组相比单纯il-1β处理组，凋亡细胞数减少。
[0209]
如图4e所示：il-1β刺激后，tunel阳性细胞率显著增加(p<0.01)；相对il-1β刺激组，秦皮素预处理组tunel阳性细胞率显著降低(p<0.05)。
[0210]
上述实验结果说明，秦皮素干预减轻了il-1β诱导的软骨细胞凋亡。
[0211]
2.3秦皮素对软骨细胞的炎症蛋白表达的影响
[0212]
如图5a-5g所示：il-1β诱导了tlr4，myd88，nf-κbp65，tnf-α和il-6的蛋白表达水平的增加，并降低iκbα的表达量，相对于对照组具有统计学差异(p<0.05)；
[0213]
与单纯il-1β给药组相比，秦皮素预处理组的tlr4，myd88，nf-κbp65，tnf-α和il-6的蛋白表达水平降低(p<0.05)，而iκbα的蛋白表达增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0214]
如图5h所示：秦皮素减轻了p65入核(即减轻炎症)。
[0215]
上述结果表明，秦皮素通过tlr4/myd88/nf-κb途径抑制了il-1β诱导的软骨细胞炎症。
[0216]
2.4秦皮素对软骨细胞ecm降解的影响
[0217]
2.4.1蛋白质免疫印迹结果
[0218]
如图6a
–
6c所示：
[0219]
单纯il-1β给药组的ii型胶原的表达量相对于对照组降低，差异具有统计学意义(p<0.05)；秦皮素预处理组的ii型胶原表达量相对于单纯il-1β给药组增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0220]
单纯il-1β给药组的mmp-13的表达量相对于对照组增加，差异具有统计学意义(p<0.05)；秦皮素预处理组的mmp-13表达量相对于单纯il-1β给药组降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0221]
2.4.2免疫荧光结果
[0222]
如图6d所示：
[0223]
单纯il-1β刺激组的ii型胶原表达量降低，差异具有统计学意义(p<0.05)；
[0224]
秦皮素预处理组的ii型胶原表达量增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0225]
上述结果说明，秦皮素可抑制il-1β诱导的ii型胶原的降解和mmp-13的分泌，表明秦皮素可有效逆转il-1β诱导的软骨细胞ecm降解。
[0226]
从上述实验过程可以发现：
[0227]
1.秦皮素干预改善了oa大鼠模型患侧膝关节软骨结构缺损破坏、软骨细胞凋亡、蛋白聚糖丢失等oa症状；
[0228]
2.秦皮素降低了大鼠血清软骨转换与炎症生物标志物的表达水平；
[0229]
3.秦皮素未显示细胞毒性作用，并部分抑制了il-1β诱导的软骨细胞凋亡，降低了il-1β诱导的caspase3、caspase8蛋白表达量和tunel阳性细胞率；
[0230]
4.秦皮素降低il-1β诱导的tlr4，myd88，nf-κbp65，tnf-α和il-6的蛋白表达水平，增加了iκbα的表达量；
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5.秦皮素抑制了il-1β诱导的ii型胶原的降解和mmp-13的分泌
[0232]
故而，从上述研究表明，秦皮素可减轻mia诱导的oa大鼠模型中膝关节的软骨破坏与炎症，其作用机制可能是通过抑制软骨细胞凋亡，炎症与细胞外基质分解代谢。