一种三阴性乳腺癌靶向药物载体及其制备和应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种三阴性乳腺癌(tnbc)靶向药物载体及其制备方法和应用。

背景技术：

三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer，tnbc)是一种高度恶性的肿瘤，目前临床中尚无针对tnbc的靶向性治疗药物。tnbc的临床治疗以化疗为主，药物常用多柔比星(doxorubicin,dox)、紫杉醇等。这些化疗药在tnbc治疗中具有非靶向分布的特点，可引起严重的副作用。因此，针对tnbc的新靶向治疗策略的开发迫在眉睫。

氨基酸在tnbc的生长、侵袭与转移中发挥了重要作用。其中，谷氨酰胺与tnbc的生长及代谢尤其相关。slc1a5是一种重要的谷氨酰胺转运体，研究表明，slc1a5在tnbc中高表达，这与tnbc对谷氨酰胺的高需求密切相关。因此，slc1a5具备作为靶点介导tnbc靶向治疗的潜力。

高分子纳米胶束可作为一种重要的药物载体应用于肿瘤给药。在水相中，两亲性聚合物将形成高分子胶束，同时可以包裹抗肿瘤药物，从而形成稳定的载药纳米胶束。但是，胶束的稳定性是相对的，在特定的酶或酸性环境中，胶束可崩解并释放包裹的药物，从而实现特定条件下的药物释放。因为包括tnbc在内的肿瘤具备酸性ph环境，所以，ph敏感性载药纳米胶束适用于抗肿瘤药物的递送。因此，将肿瘤靶向药物递送可通过主动或被动靶向方法实现。最常用的主动靶向策略是将胶束与小分子配体偶联，从而结合肿瘤细胞过度表达的受体，实现肿瘤细胞的特异性摄取。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer,tnbc)靶向药物载体。所述药物载体可大量负载抗tnbc肿瘤药物且有较好的ph响应能力和tnbc靶向性能。

本发明的另一目的在于提供所述tnbc靶向药物载体的制备方法。

本发明的另一目的还在于提供所述靶向药物载体在制备tnbc靶向药物中的应用。

为了实现本发明的目的，采用如下技术方案：

一种三阴性乳腺癌(tnbc)靶向药物载体，其特征在于，所述的靶向药物载体具有式(1)结构，为谷氨酰胺偶联聚乙二醇-聚(β-氨基酯)得到的嵌段共聚物，记为gln-peg-b-pae，

其中，聚乙二醇(peg)链段的平均分子量m为1000-8000，聚乙二醇-聚(β-氨基酯)(pae)链段的平均分子量n为1000-16000，m:n为1：1-2。

优选地，所述gln-peg-b-pae嵌段共聚物的平均分子量为2040-16452g/mol。

本发明进一步提出了上述tnbc靶向药物载体的制备方法，以聚乙二醇(peg)、正己烷-1,6-二丙烯酸酯(hdd)和4,4-三亚甲基二哌啶(tdp)为原料通过michael加成反应合成得到嵌段共聚物聚乙二醇-聚(β-氨基酯)(peg-b-pae)，随后通过酰胺化反应(如通过dmap/cmpi、dcc/dmap)将谷氨酰胺(gln)的羧基端偶联于peg-b-pae共聚物上得到所述的gln-peg-b-pae共聚物。

所述的tnbc靶向药物载体gln-peg-b-pae的一种合成过程如下：

具体地，上述tnbc靶向药物载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)fmoc-peg-b-pae的合成

取9-芴基甲氧基羰基(fmoc)保护的peg溶于无水二氯甲烷中，加入三乙胺，0℃滴加过量丙烯酰氯并搅拌，恢复至室温并搅拌至反应结束；反应结束后清洗，真空浓缩得到fmoc保护的聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯。

将正己烷-1,6-二丙烯酸酯(hexane-1,6-dioldiacrylate，hdd)和4,4-三亚甲基二哌啶(4,4-trimethylenedipiperidine，tdp)溶解于氯仿中，随后加入fmoc保护的聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯于20-60℃下搅拌反应，反应结束后，向反应液加入过量的甲基叔丁基醚后沉淀并干燥后得到fmoc-聚乙二醇-聚(β-氨基酯)(fmoc-peg-b-pae)嵌段共聚物。

(2)nh2-peg-b-pae的合成

fmoc-peg-b-pae溶于二氯甲烷并加入哌啶，在室温搅拌反应后，洗涤并减压浓缩收集沉淀，干燥即得nh2-peg-b-pae。

(3)gln-peg-b-pae的合成

nh2-peg-b-pae和fmoc-谷氨酰胺溶于氯仿中，加入催化剂(如n，n'-二环己基碳二亚胺(ddc)和4-二甲基氨基吡啶(dmap))，室温反应过夜，在甲基叔丁基醚溶液中沉淀后，收集产物，即得fmoc-谷氨酰胺-聚乙二醇-聚(β-氨基酯)(fmoc-gln-peg-b-pae)。fmoc-gln-peg-b-pae溶于二氯甲烷并加入哌啶，在室温搅拌反应后，洗涤并减压浓缩收集沉淀，干燥即得gln-peg-b-pae嵌段共聚物。

优选地，步骤(1)中，peg平均分子量可为1000-8000，peg与hdd或tdp的摩尔投料比可为1：2.5-40。

步骤(3)中，nh2-peg-b-pae与fmoc-谷氨酰胺投料摩尔比为1：1-10。本发明通过对肿瘤基因组图谱(thecancergenomeatlas，tcga)数据的分析和体外实验，发现溶质载体家族1成员5(slc1a5)在tnbc中高表达。基于tnbc对谷氨酰胺(gln)的需求量大，将谷氨酰胺接枝到适当的高分子载体上，制备得到同时具有肿瘤靶向性和ph响应性的共聚物tnbc的药物载体。

本发明还提出上述ph响应的tnbc靶向药物载体在制备tnbc靶向药物中的应用。

所述的ph响应的tnbc靶向药物载体可以通过亲疏水性及自组装方式将tnbc药物负载在所述载体上，所述tnbc药物可以是任意疏水药物，如阿霉素(dox)、紫杉醇、青蒿素等。

进一步地，本发明还涉及一种tnbc靶向药物，其中包含所述的tnbc靶向药物载体和疏水性tnbc药物。

上述tnbc靶向药物可制成胶束剂，例如负载阿霉素(dox)的gln-peg-b-pae胶束(gln-peg-b-pae@dox)。在体外实验中，gln-peg-b-pae@dox胶束表现出明显的ph依赖性药物释放行为，即在ph为6.0的酸性环境中可快速释放dox，但在生理性ph条件下其释放速度很慢。另外，谷氨酰胺竞争实验表明gln-peg-b-pae@dox胶束具有靶向三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231细胞的能力。gln-peg-b-pae@dox胶束对mda-mb-231细胞的杀伤作用和抗增殖活性显著高于游离dox。在体内实验中，与游离dox和peg-b-pae@dox胶束相比，gln-peg-b-pae@dox胶束明显抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长。因此，gln-peg-b-pae@dox胶束作为肿瘤靶向性给药系统，可能为tnbc的治疗提供一种靶向治疗的新方法。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明制备的聚合物可大量负载药物，具有较好的疏水药物携带能力；

(2)本发明制备的聚合物载体具有可靶向并治疗tnbc；目前tnbc尚无靶向治疗方式；

(3)本发明制备的gln-peg-b-pae聚合物分子量大小及反应过程可控；

(4)本发明制备的gln-peg-b-pae聚合物偶联了gln，使得所述gln-peg-b-pae聚合物载体具有优异的tnbc靶向能力。

附图说明

图1：slc1a5在不同亚型乳腺癌中的表达。(a)slc1a5高低表达的乳腺癌患者总生存率的kaplan-meier分析；(b)从tcga数据库中下载的slc1a5在113例正常人乳腺组织和5种乳腺癌亚型中的mrna表达数据，以pam50乳腺癌固有亚型为基础，共有449个luminala、181个luminalb、69个her2阳性和166个tnbcbasal-like组织和33个tnbcnormal-like样组织样本，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；(c)slc1a5在luminala细胞株(mcf-7)、luminalb细胞株(zr-75-1)、her2阳性细胞株(skbr3)和高侵袭性tnbc细胞株(mda-mb-231、bt549)中mrna的相对表达量，误差条代表至少三个独立实验的平均值±标准差，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；(d-e)slc1a5在luminala细胞系(mcf-7)、luminalb(zr-75-1)、her2阳性(skbr3)和高侵袭性tnbc(mda-mb-231、bt549)中的蛋白表达，误差条代表至少三个独立实验的平均值±标准差，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图2：gln-peg-b-pae共聚物及其负载dox胶束的表征，(a)gln-peg-b-pae共聚物的¹h-nmr；(b)通过测定gln-peg-b-pae共聚物的第一发射峰(i1)与第三发射峰(i3)的强度比(373nm和384nm处的荧光强度)来测定的临界胶束浓度(cmc)；(c)gln-peg-b-pae@dox胶束的透射电镜照片；(d)动态光散射法测定gln-peg-b-pae共聚物的水动力粒度分布；(e)动态光散射法测定gln-peg-b-pae@dox胶束的水动力粒度分布。

图3：胶束的稳定性和药物释放测试。(a)gln-peg-b-pae@dox胶束在ph6.0缓冲液中的累积释放。蓝线：ph6.0，红线：ph7.4；(b)gln-peg-b-pae(顶部)和gln-peg-b-pae@dox胶束(底部)的胶束大小随时间的变化曲线。

图4：gln-peg-b-pae@dox胶束和游离dox对mda-mb-231细胞的影响。(a)不同浓度的游离dox和gln-peg-b-pae@dox胶束对mda-mb-231细胞活力的影响(左)，不同处理时间的mpeg-b-pae胶束和gln-peg-b-pae胶束对mda-mb-231细胞活力的影响(右)；(b)游离dox(1mg/ml)和gln-peg-b-pae@dox(含dox，1mg/ml)胶束处理的mda-mb-231细胞凋亡；(c)gln-peg-b-pae@dox胶束孵育的mda-mb-231细胞内dox的摄取；(d)gln-peg-b-pae@dox胶束和5mg/ml游离谷氨酰胺共孵育的mda-mb-231细胞内dox的摄取；(e)流式细胞仪计数gln-peg-b-pae@dox胶束(上)和gln-peg-b-pae@dox胶束联合5mg/ml谷氨酰胺(下)孵育的mda-mb-231细胞内dox荧光；(f)流式细胞仪计数peg-b-pae@dox胶束(上)、gln羧基偶联peg-b-pae@dox胶束(中)和孵育gln氨基偶联peg-b-pae@dox胶束(下)与mda-mb-231细胞共孵育后的dox荧光。

图5：gln-peg-b-pae@dox在体内的抗肿瘤作用。(a)体内的抗肿瘤实验步骤示意图；(b)生理盐水，游离dox，mpeg-b-pae@dox和gln-peg-b-pae@dox处理荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；用生理盐水(1)，游离dox(2)，mpeg-b-pae@dox(3)，gln-peg-b-pae@dox(4)处理荷瘤小鼠的荧光照片(c)和肿瘤大小图(d)；通过尾静脉注射生理盐水，游离dox组，mpeg-b-pae@dox和gln-peg-b-pae@dox后，小鼠肿瘤的体积(e)，重量(f)和肿瘤荧光强度(g)的比较图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1乳腺癌及不同分型中scl1a5基因表达

通过肿瘤基因组图谱(tcga)数据门户网站，查询并获得slc1a5基因与乳腺癌的数据。通过分析数据寻找乳腺癌患者的生存期及不同分型的乳腺癌中slc1a5基因表达情况。首先，分析乳腺癌患者临床数据及对应的slc1a5转录组表达量，包括113例正常人乳腺组织样本和5种乳腺癌亚型。其中luminala型449例，luminalb型181例，her2阳性69例，166个tnbcbasal-like样本和33个tnbcnormal-like样本基于pam50固有乳腺癌亚型。为了分析各乳腺癌亚型患者的slc1a5基因表达差别，使用患者对应的slc1a5的表达量数据，即每千碱基百万个片段(fpkm)。使用graphpadprism软件(lajolla，美国)以非配对的student'st检验计算两个独立组间差异的统计学意义(p<0.05有统计学意义)。分析slc1a5对乳腺癌患者预后生存的影响，使用graphpadprism软件(lajolla，美国)行kaplan-meier生存分析，采用log-rank检验将患者分为slc1a5高表达组和slc1a5低表达组，采用95％可信区间(ci)的危险比(hr)报告结果，p<0.05具有统计学意义。

分析结果表明，slc1a5高表达患者的总生存期(os)明显低于slc1a5低表达患者(p＝0.048)(见图1a)，表明高表达slc1a5是乳腺癌患者预后不良的因素，使slc1a5成为乳腺癌治疗的潜在靶点。为了研究slc1a5在不同亚型乳腺癌中的表达水平差别，从tcga数据库中获得了slc1a5的表达量数据和各亚型乳腺癌患者临床信息。结果表明slc1a5的表达量在tnbc患者中最高，并且显著高于正常组织和luminala型乳腺癌患者(见图1b)。

为了验证上述结果，使用总rna试剂盒(dd419，天根生物科技，北京)和细胞裂解缓冲液(ripap0013k，碧云天，上海)从luminala亚型(mcf-7细胞)、luminalb亚型(zr-75-1细胞)、her2阳性亚型(skbr3细胞)和tnbc亚型(mda-mb-231、bt549细胞)细胞株中提取总rna和蛋白检测了其中slc1a5基因的表达情况，具体操作如下。

使用hiscriptⅱqrtsupermix行qpcr(r222-01，诺唯赞，南京)反向转录500ng总rna。使用steponeplus实时pcr系统(4376600，thermofisherscientific，美国)及aceq-qpcrsybrgreenmastermix(高rox预混料)(q141-02，诺唯赞，南京)进行rt-qpcr。循环参数包括一个完整的熔体曲线阶段，设置如下：95℃持续10分钟，之后95℃持续10秒，紧接着60℃持续30秒。用于扩增slc1a5的引物为(正向：5'-tattttggcggctagttgtgtg-3'，反向：5'-cctgggggtgtttcttttttttgtg-3')，并以gapdh作为内参。所有引物均购自锐博生物(中国广州)。所有的样本对每个特定基因进行了一式三份的分析。将每个基因的ct值经内参对照标准化，并用δδct法计算相对表达水平。

使用multiskanfc分光光度计(51119050，thermofisherscientific，美国)测定蛋白质含量，然后将蛋白质与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)缓冲液(pg12，雅酶，上海)煮沸5分钟。用10％的sds-page电泳分离等量蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(ffp32，merckmillipore，darmstadt，德国)。在5％无脂奶粉中封闭2小时后，在室温下用以下主要抗体再孵育2小时：抗slc1a5(1:1000)(ab84903，abcam，英国)和抗gapdh(1:10000)(60004-1-ig，proteintech，美国)。将聚偏氟乙烯膜用tween20(ipvh00010，biofroxx，德国)/tbs(tbst)洗涤三次(每次洗涤10分钟)，并用适当稀释的辣根过氧化物酶连接的二级抗体：山羊抗兔(1:1000)(a0208，碧云天，上海)和山羊抗鼠(1:1000)(a0216，碧云天，上海)在室温下孵育1小时。紧接着用tbst清洗后，使用增强化学发光(ecl)试剂盒(p00185，碧云天，上海)显示蛋白质条带。

结果发现slc1a5的表达量在tnbc亚型中明显高于其他细胞系，尤其高于luminala和luminalb亚型细胞系(见图1c)。此外，通过westernblot分析，比较slc1a5在不同亚型乳腺癌细胞系，包括：luminala亚型(mcf-7细胞)、luminalb亚型(zr-75-1细胞)、her2阳性亚型(skbr3细胞)和tnbc亚型(mda-mb-231、bt549细胞)中的蛋白表达水平(见图1d-1e)。与pcr结果一致，westernblot结果也显示slc1a5在tnbc细胞系中，特别是在mda-mb-231中的蛋白表达水平，明显高于其他亚型。

通过对tcga数据库中不同亚型乳腺癌slc1a5表达量数据的分析，证实slc1a5在人类tnbc组织样本中与其他亚型相比均更高表达。另外，证实了在不同亚型乳腺癌细胞系中，tnbc亚型细胞显著更高表达slc1a5。这些结果可以解释为由于tnbc亚型需要更高的谷氨酰胺供应，来为其高度侵袭性的生物学行为提供能量。tnbc亚型对谷氨酰胺的需求量大，意味着其受体是治疗的潜在靶点。基于上述发现进一步探索以谷氨酰胺接枝嵌段的共聚物为药物载体的tnbc靶向治疗策略。

实施例2gln-peg-b-pae共聚物的合成

通过michael加成反应设计并合成peg-b-pae，然后，通过dcc/dmap将谷氨酰胺偶联于nh2-peg-b-pae共聚物上得到ph响应药物递送载体gln-peg-b-pae共聚物，实现其靶向tnbc的功能，具体合成过程如下。

(1)fmoc-peg-b-pae的合成

取fmoc保护的peg1000(0.1mmol)溶于10ml无水二氯甲烷中，加入2倍当量的三乙胺，后将反应瓶置于0℃冷肼中，向反应瓶中缓慢滴加丙烯酰氯(0.5mmol,aladdin,中国上海)并在冷肼中搅拌2h。随后，取出反应瓶使溶液恢复至室温并搅拌反应24h。反应结束后用稀盐酸清洗，真空浓缩得到fmoc保护的聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯。

取2.5摩尔份的hdd和2.5摩尔份的tdp溶解于10ml氯仿的反应瓶中，随后加入1摩尔份的fmoc保护的聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯于50℃下搅拌反应48小时。反应结束后，向反应液加入过量的甲基叔丁基醚后沉淀并干燥后得到fmoc-聚乙二醇-聚(β-氨基酯)嵌段共聚物(fmoc-peg-b-pae)。

(3)gln-peg-b-pae的合成

取0.1mmolfmoc-peg-pae溶于8ml二氯甲烷并加入5ml哌啶，在室温搅拌反应1h后，加入稀盐酸水溶液进行洗涤并减压浓缩收集沉淀，干燥即得nh2-peg-b-pae。

取0.1mmolnh2-peg-b-pae和0.2mmolfmoc-谷氨酰胺溶于15ml氯仿中，加入0.2mmoln，n'-二环己基碳二亚胺(ddc,aladdin,中国上海)和0.05mmol4-二甲基氨基吡啶(dmap,aladdin,中国上海)，室温反应过夜，在甲基叔丁基醚溶液中沉淀后，收集产物，即得fmoc-谷氨酰胺-聚乙二醇-聚(β-氨基酯)(fmoc-gln-peg-pae)。

取0.1mmolfmoc-gln-peg-b-pae溶于8ml二氯甲烷并加入2ml哌啶，在室温搅拌反应1h后，加入稀盐酸水溶液进行洗涤并减压浓缩收集沉淀，干燥即得gln-peg-b-pae嵌段共聚物。

(4)gln-peg-b-pae共聚物表征

上述反应获得的gln-peg-b-pae共聚物，其化学结构和分子量分别通过¹h-nmr和gpc确认。结果表明，成功合成了gln-peg-b-pae共聚物，共聚物的mw为2040，pdi为1.17。

实施例3gln-peg-b-pae共聚物的合成

通过michael加成反应设计并合成peg-b-pae，然后，通过dcc/dmap将谷氨酰胺偶联于nh2-peg-b-pae共聚物上得到ph响应药物递送载体gln-peg-b-pae共聚物，实现其靶向tnbc的功能，具体合成过程如下。

(1)fmoc-peg-b-pae的合成

取fmoc保护的peg5000(0.2mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，加入2倍当量的三乙胺，后将反应瓶置于0℃冷肼中，向反应瓶中缓慢滴加丙烯酰氯(0.4mmol,aladdin,中国上海)并在冷肼中搅拌2h。随后，取出反应瓶使溶液恢复至室温并搅拌反应24h。反应结束后用稀盐酸清洗，真空浓缩得到fmoc保护的聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯。

取25摩尔份的hdd和25摩尔份的tdp溶解于30ml氯仿的反应瓶中，随后加入1摩尔份的fmoc保护的聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯于50℃下搅拌反应48小时。反应结束后，向反应液加入过量的甲基叔丁基醚后沉淀并干燥后得到fmoc-聚乙二醇-聚(β-氨基酯)嵌段共聚物(fmoc-peg-b-pae)。

(2)nh2-peg-b-pae的合成

取0.1mmolfmoc-peg-pae溶于10ml二氯甲烷并加入2.5ml哌啶，在室温搅拌反应1h后，加入稀盐酸水溶液进行洗涤并减压浓缩收集沉淀，干燥即得nh2-peg-b-pae。

(3)gln-peg-b-pae的合成

取0.1mmolnh2-peg-b-pae和0.2mmolfmoc-谷氨酰胺溶于15ml氯仿中，加入0.2mmoln，n'-二环己基碳二亚胺(ddc,aladdin,中国上海)和0.05mmol4-二甲基氨基吡啶(dmap,aladdin,中国上海)，室温反应过夜，在甲基叔丁基醚溶液中沉淀后，收集产物，即得fmoc-谷氨酰胺-聚乙二醇-聚(β-氨基酯)(fmoc-gln-peg-b-pae)。

取0.1mmolfmoc-gln-peg-b-pae溶于8ml二氯甲烷并加入2ml哌啶，在室温搅拌反应1h后，加入稀盐酸水溶液进行洗涤并减压浓缩收集沉淀，干燥即得gln-peg-b-pae嵌段共聚物。

(4)gln-peg-b-pae共聚物表征

上述反应获得的gln-peg-b-pae共聚物，其化学结构和分子量分别通过¹h-nmr(见图2a)和gpc确认。结果表明，成功合成了gln-peg-b-pae共聚物，共聚物的mw为16452，pdi为1.25。

实施例4负载阿霉素(dox)的gln-peg-b-pae胶束的制备与表征

通过溶剂蒸发法制备gln-peg-b-pae@dox胶束。首先，称取1mgdox和10mggln-peg-b-pae，溶解于氯仿中，充分混合。将上述混合溶液通过旋转蒸发仪蒸发除去溶剂，随后向圆底烧瓶中加入5ml磷酸盐缓冲溶液(pbs,10mm,ph7.4)并旋转3小时，得到载有dox的胶束。

将胶束溶液置于探针型超声仪中超声分散后，在pbs中用尺寸排阻离心过滤器(0.5离心过滤器，merckmillipore，darmstadt，德国，5000rcf，10分钟)洗涤3次，以除去胶束溶液中的游离dox得到负载阿霉素(dox)的gln-peg-b-pae纳米胶束。另在不添加dox的情况下获得空gln-peg-b-pae胶束。

上述负载dox的gln-peg-b-pae胶束(记为gln-peg-b-pae@dox)的平均粒径和形态通过透射电子显微镜(tem,feitecnaif-20,usa)和动态光散射仪(dls,brookhaven,usa)来测量。gln-peg-b-pae的临界胶束浓度(cmc)以芘荧光探针，通过荧光分光光度仪(infinite200pro，tecan，瑞士)测量得到。

将gln-peg-b-pae共聚物溶解在氯仿中，使共聚物的浓度从0.00187mg/ml到1mg/ml不等。然后，将100μl的芘(1mg/l)添加到共聚物溶液中，蒸发有机溶剂后，混合物以pbs定容至1ml。随后，测量混合物在373nm和384nm下的荧光强度并计算cmc。gln-peg-b-pae共聚物的cmc是根据第一发射峰(i1)与第三发射峰(i3)的强度比(373nm和384nm处的荧光强度)于相对测试浓度的以10为底的对数来绘制图并计算的。结果表明，在生理ph值为7.4时，gln-peg-b-pae共聚物的cmc约为0.016mg/ml(见图2b)，这表明gln-peg-b-pae共聚物在生理环境下形成了稳定的胶束。

随后，通过动态光散射(dls)和透射电子显微镜(tem)表征gln-peg-b-pae共聚物和载有dox的胶束的形态。结果表明，gln-peg-b-pae@dox胶束的直径为75.4nm，比空的gln-peg-b-pae共聚物大10nm(见图2d-2e)。这表明，由于夹带的dox分子，增加了dox负载的聚合物胶束的平均尺寸。tem还显示，装载dox的聚合物胶束呈球形(见图2c)，平均大小约为45nm。这些结果表明，上述已经成功地制备了dox负载的聚合物胶束gln-peg-b-pae@dox，并且能在水性介质中形成均匀分布的纳米级胶束结构。

实施例5gln-peg-b-pae@dox的药物释放及稳定性测试

通过制备的正常组织环境ph＝7.4和肿瘤酸性环境ph＝6.0的两种pbs缓冲液，模拟测试了gln-peg-b-pae@dox胶束在不同生理环境中的药物释放效率。用透析法测定gln-peg-b-pae@dox胶束中dox的ph值响应性释放量。ph依赖性的dox释放曲线如图3a所示。在最初的8小时内，dox在ph值为6.0时大量释放，约占总量80％，这一结果表明，负载dox的胶束在酸性环境中迅速解聚并释放药物。但在ph值为7.4时，dox从胶束中缓慢释放。在最初约30％的爆发后，累积释放量增长缓慢，逐渐达到平台。gln-peg-b-pae@dox聚合物表现出明显的ph依赖性的解胶束化，即胶束在ph6.0的酸性环境中快速释放dox，但在生理条件下释放速度很慢。

为了测试gln-peg-b-pae@dox胶束形貌及其在生理环境中(ph＝7.4)的稳定性，采用透射电子显微镜(tem，feitecnaif-20，usa)和粒度分析仪(zetaplus，brookhaven，usa)来测量。如图3b所示，gln-peg-b-pae和gln-peg-b-pae@dox胶束在ph7.4缓冲溶液中可以24小时内保持稳定，提示gln-peg-b-pae@dox胶束具有较好的稳定性。如图3a所示gln-peg-b-pae@dox胶束在酸性条件下可有效释放dox，表现出明显的ph依赖性解胶束行为。重要的是gln-peg-b-pae@dox胶束在生理ph条件下dox的释放较少，从而减少药物副作用。另外，gln-peg-b-pae@dox胶束在ph7.4缓冲溶液中在24小时内保持了稳定的大小，表明gln-peg-b-pae@dox胶束在药物分布过程中能够维持生理环境中的结构稳定性，保证了gln-peg-b-pae作为dox药物载体的可行性。

实施例6gln-peg-b-pae@dox胶束的体外效应

采用cck8法检测gln-peg-b-pae@dox胶束，对mda-mb-231细胞的增殖抑制作用。首先，将mda-mb-231细胞接种于96孔板中，密度为8×10³/孔，每孔100μl完全培养基。铺板24小时后，分别加入gln-peg-b-pae@dox胶束或游离dox，使其终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20μgdox/ml，共孵育24h后加入cck8检测液，用multiskan-fc分光光度计(51119050，thermofisherscientific，usa)计算490nm处的吸光度并计算细胞活力。另取gln-peg-b-pae和peg-b-pae胶束，加到接种了mda-mb-231细胞的96孔板中，共孵育1、5、10、15、20或25小时后加入cck8检测液，用multiskan-fc分光光度计计算490nm处的吸光度并计算细胞活力。如图4a所示，与游离dox相比，gln-peg-b-pae@dox胶束表现出更多的抗增殖活性。因此，gln-peg-b-pae@dox胶束能有效地抑制mda-mb-231细胞的增殖活性。此外，gln-peg-b-pae胶束和peg-b-pae胶束对mda-mb-231细胞的活力无明显抑制作用，说明gln-peg-b-pae和mpeg-b-pae共聚物具有良好的生物相容性，可作为药物载体。

用流式细胞仪分析gln-peg-b-pae@dox胶束对mda-mb-231细胞凋亡的影响。首先，将mda-mb-231细胞分别与gln-peg-b-pae@dox胶束(含dox，1mg/ml)和游离dox(1mg/ml)在10μg/mldox的终浓度下共孵育48小时。收集细胞，4℃pbs洗涤两次，用annexin-v-alexafluor647(fmsav647-2-50，fcmacsbiotech，中国)和dapi(dapi溶液，1mg/ml，bdbiosciences，usa)在暗室中共孵育15分钟后，应用流式细胞仪(facsverse，bd，usa)分析细胞凋亡。结果如图4b所示，右下象限和右上象限分别代表早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的数量。用gln-peg-b-pae@dox胶束处理48h后，细胞死亡率比游离dox处理组高1.57倍，说明胶束中的谷氨酰胺配体改善了细胞内吞作用，增强了gln-peg-b-pae@dox胶束的细胞毒性。值得注意的是，gln-peg-b-pae胶束本身对mda-mb-231细胞的抗增殖作用有限，与游离dox相比，gln-peg-b-pae胶束在抑制细胞增殖和促进细胞凋亡方面的作用明显增强。因此，gln-peg-b-pae胶束是一种生物相容性好的tnbc治疗药物载体。

进一步，通过谷氨酰胺竞争实验验证gln-peg-b-pae@dox胶束的tnbc靶向性。首先，将对数生长期的mda-mb-231细胞以5×10⁵/孔的密度铺在6孔板上。24h后，pbs洗涤两次，加入无血清培养基孵育1h，在六孔板中加入gln-peg-b-pae@dox胶束，同时在其中一组细胞中加入5mg/ml谷氨酰胺。共培养6h后，用pbs清洗细胞三次，并用axiovert.a1荧光显微镜(德国蔡司)观察细胞(如图4c，4d)。此外，还用用流式细胞仪(accuric6，bd，usa)的fl1通道检测mda-mb-231细胞的荧光强度。结果如图5e所示，与单纯gln-peg-b-pae@dox胶束共孵育6h后，mda-mb-231细胞吸收了胶束释放的大量dox，荧光强度明显强于胶束联合5mg/ml游离谷氨酰胺处理组。以上结果证实，谷氨酰胺可以竞争mda-mb-231细胞上的slc1a5受体，同时降低gln-peg-b-pae@dox胶束释放dox的细胞摄取。因此，gln-peg-b-pae@dox胶束具有对tnbc的主动靶向能力。

实施例7gln-peg-b-pae@dox胶束在体内的抗肿瘤作用

将状态良好的mda-mb-231细胞以3～5×10⁴个/ml的密度接种于六孔板，每孔2ml，24小时后更换1ml事先准备好的luc病毒感染液(moi值为10，病毒体积＝moi×细胞数目/病毒滴度)，感染8～12h后观察细胞状态，更换为常规培养基继续培养，感染72h后在荧光显微镜下观察细胞，选择构建成功的mda-mb-231-luc细胞进行体内实验。

将1.0×10⁵个mda-mb-231-luc细胞接种到雌性blab/cnu/nu小鼠的右侧腋窝中。当肿瘤体积达到约100mm³时，将小鼠随机分为4组(每组6只)即生理盐水组、游离dox溶液(2mg/kg)组、mpeg-b-pae@dox胶束(dox2mg/kg)组和gln-peg-b-pae@dox胶束(dox2mg/kg)组。随后，将上述四种药物通过尾静脉注射入荷瘤小鼠，每4天注射1次，共计4次。每天用数字卡尺测量肿瘤长短径，并通过公式计算肿瘤体积(肿瘤体积＝a×b²/2，其中a为最大直径，b为最小直径)，最后一次注射后5天，用体内成像系统记录肿瘤的荧光信号。

结果如图5b所示，用gln-peg-b-pae@dox胶束处理的小鼠，其肿瘤生长速度明显慢于用游离dox和生理盐水处理的小鼠，说明较游离dox和生理盐水，gln-peg-b-pae@dox胶束对移植肿瘤生长有更强的抑制作用。如图5d-5f所示，17天后，与对照组相比，2mg/kg游离dox肿瘤体积抑制率为45.6％，而2mgdox/kg的mpeg-b-pae@dox胶束肿瘤体积抑制率为63.7％，gln-peg-b-pae@dox胶束在2mgdox/kg下对肿瘤大小有78.3％的抑制率。用mpeg-b-pae@dox胶束处理的小鼠肿瘤体积明显小于用游离dox处理的小鼠，这是因为mpeg-b-pae@dox胶束更有可能在肿瘤中积累。如图5c、5g所示，与生理盐水和游离dox处理的小鼠相比，用gln-peg-b-pae@dox胶束处理的小鼠具有明显较低的荧光强度。而肿瘤体积越大，荧光强度越高，提示较游离dox、生理盐水和mpeg-b-pae@dox胶束，gln-peg-b-pae@dox胶束可以明显抑制移植肿瘤的生长。总的来说，gln-peg-b-pae@dox胶束对移植肿瘤的抗肿瘤作用最大。dox的ph依赖性释放和谷氨酰胺介导的靶向能力使gln-peg-b-pae@dox胶束不仅在体外而且在体内都表现出优异的抗肿瘤作用。

对比例8gln偶联peg-b-pae嵌段聚合物

本发明式(1)的tnbc靶向药物载体gln-peg-b-pae外，基于peg-b-pae嵌段聚合物，与谷氨酰胺氨偶联还可以得到另外两种产物。其中一种结构式如下式(2)，该产物为gln上两个氨基均被peg-b-pae嵌段聚合物偶联。这种聚合物分子量较大，溶于水后形成水凝胶状物体，与dox孵育后形成的复合物其水动力学尺寸在1510nm，失去了此类药物载体的最佳尺寸(50-300nm)，难以作为药物载体应用于治疗tnbc中。

另一种结构式如下式(3)，该产物为gln上两个氨基的其中一个氨基被peg-b-pae嵌段聚合物偶联。用该聚合物与dox复合后与tbnc共孵育，其细胞摄取实验结果表明(图4f)，mda-mb-231细胞对该复合物(gln氨基偶联peg-b-pae@dox复合物)和未接枝gln的peg-b-pae@dox复合物的摄取无显著差异。这种结果产生的原因是gln上的氨基被peg-b-pae嵌段聚合物偶联后，gln与231细胞表面的scl1a5受体结合位点(asp136和thr140)被peg-b-pae嵌段聚合物占据，导致该复合物无法靶向至231细胞并通过表面的scl1a5受体进入细胞而丧失靶向性。

因此，gln偶联至peg-b-pae嵌段聚合物上所得到的三种不同结构的gln-peg-b-pae，只有gln羧基端与peg-b-pae嵌段聚合物具有靶向tnbc的功能。