干姜挥发油得到的物质在急性肺部炎症疾病的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是关于干姜挥发油得到的物质在急性肺部炎症疾病的应用。

背景技术：

干姜具有温中散寒，回阳通脉，温肺化饮的功效，炮制后干姜片含挥发油1％左右，现代药理研究表明，干姜挥发油具有：抗氧化活性、镇吐作用、抗炎作用、抗菌作用、对心血管作用等。

复制脂多糖(lps)诱导的急性肺损伤模型依据：目前对于呼吸道疾病的模型，造模方法多样,我们采用复制脂多糖(lps)吸入的方法，无需免疫抑制就能诱导小鼠急性肺炎，其作用原理见图1，模拟引起上呼吸道感染的细菌产生的内毒素脂多糖(lps)，刺激气道上皮细胞，am(粘附因子)分泌il-8(白介素-8)、tnf-α(肿瘤坏死因子)等炎症介质促炎症细胞(中性粒细胞等)趋化和聚集，释放一系列蛋白酶和一系列炎症因子导致气道炎症及实质性肺损伤。目前研究表现，炎症因子pge2，il-8，tnf-α及lt-b4都参与了呼吸道肺部的炎症发展。

tnf-α是lps早期诱导的巨噬细胞施放的炎症因子，并受其他细胞因子直接或间接的影响及调控，tnf-α的显著升高引起机体发热，发热机制类似于糖皮质类固醇。il-8则是另一个与肺部炎症直接相关的由巨噬细胞施放的炎症因子，和tnf-α一起在炎症反应中起关键作用。同时，中性粒细胞在参与炎症反应的众多细胞中，数量大，功能强，在感染炎症中起重要作用，其中pge2作为中性粒细胞释放的细胞因子是炎症反应重要介质之一，与大多数炎症的发生与发展紧密相关，属于非依赖性细胞因子的中枢性发热。lt-b4是磷脂酶a2(pla2)及其活化后产生的花生四烯酸代谢产物之一，和pge2同是导致血管通透性增加，局部水肿的重要原因。

目前关于超临界萃取法或水蒸气提取法提取干姜挥发油得到的物质是否对前列腺素e2(pge2)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、白三烯-b4(lt-b4)、白介素-8(il-8)的释放的急性肺部炎症疾病是否有效，还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种用超临界萃取法提取干姜挥发油得到的物质在制备治疗急性肺部炎症疾病药物中的应用。

本发明的第二个目的是，提供一种用水蒸气提取法提取干姜挥发油得到的物质在制备治疗急性肺部炎症疾病药物中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种用超临界萃取法提取干姜挥发油得到的物质在制备治疗急性肺部炎症疾病药物中的应用，所述的急性肺部炎症疾病是il-8，pge2及lt-b4因子的释放的急性肺部炎症疾病。

所述的超临界萃取法提取干姜挥发油得到物质是由下列方法制备得到的：取干姜饮片，在压力25mpa，萃取温度55℃的条件下萃取2h，挥发油得率为3％。

进一步优先方案：超临界萃取法提取干姜挥发油采用吐温-80对挥发油进行乳化，比例为油：吐温-80：水＝2：1：4.2。

进一步优先方案：所述的急性肺部炎症疾病是复制脂多糖lps诱导的急性肺部炎症疾病

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种用水蒸气提取法提取干姜挥发油得到的物质在制备治疗急性肺部炎症疾病药物中的应用，所述的急性肺部炎症疾病是tnf-α因子的释放的急性肺部炎症疾病。

进一步优先方案：所述的水蒸气提取法提取干姜挥发油得到的物质是由下列方法制备得到的：取干姜饮片300g，粉碎至粒径为60目，加水量为12倍，加入蒸馏水2100ml，置电热套中保持微沸7h后收集，挥发油得率为0.9％。

进一步优先方案：所述的急性肺部炎症疾病是复制脂多糖lps诱导的急性肺部炎症疾病。

从药效的角度评价水蒸气蒸馏法(sd)和超临界萃取法(sfe)提取干姜挥发油的优劣，初步探求其抗炎机制，并比较两种干姜挥发油的优劣。复制脂多糖(lps)诱导的小鼠急性肺部炎症(ali)模型，对sfe和sd两种方法得到的干姜挥发油进行抗炎活性的比较，并采用elisa法，测定前列腺素e2(pge2)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、白三烯-b4(lt-b4)、白介素-8(il-8)的浓度来探求其抗炎机制。小鼠主要中毒症状为腹部刺激，呼吸急促等。死亡时间多集中在8h以内。干姜经超临界萃取(sfe)提取的挥发油ld50＝6.717ml/kg(4.066-8.108ml/kg)，折算生药为ld50＝223.9g/kg(135.5-270.3g/kg)；经水蒸气蒸馏法(sd)提取的挥发油ld50＝9.111ml/kg(8.133-10.206ml/kg)，折算生药为ld50＝1012.3g/kg(903.7-1134g/kg)。两种方法提取的干姜挥发油对复制脂多糖(lps)诱导的小鼠急性肺部炎症(ali)均有不同程度疗效，其中在抑制tnf-α因子的释放上，水蒸气蒸馏法(sd)组优于超临界萃取法(sfe)组，在抑制il-8，pge2及lt-b4因子的释放上，超临界萃取法(sfe)组优于水蒸气蒸馏法(sd)组。

本发明优点在于：本发明采用balb/c雄性小鼠，复制lps诱导的急性肺炎模型，选取tnf-α、il-8、pge2、lt-b4为评价指标，对比两种方法提取的干姜挥发油的体内实验药效差异。对比两种方法提取的干姜挥发油ld50可以得出，干姜挥发油属于无毒性，且水蒸气蒸馏法(sd)组安全性高于超临界萃取法(sfe)组。对比两种方法提取的干姜挥发油对lps诱导的ali均有不同程度的疗效，且超临界萃取法(sfe)组疗效优于水蒸气蒸馏法(sd)组。

附图说明

图1lps诱导的小鼠急性肺部炎症模型依据。

图2lps剂量与小鼠死亡时间关系。

图3balf中的tnf-α浓度。

图4balf中的lt-b4浓度。

图5balf中的pge2浓度。

图6balf中il-8的浓度。

图7不同组别的小鼠肺部病理切片比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

1.材料与设备

脂多糖(sigma)；地塞米松(上海上药信谊)；磷酸盐缓冲液(pbs)；前列腺素e2(pge2)试剂盒、α肿瘤坏死因子(tnf-α)试剂盒、白细胞介素-8(il-8)试剂盒、白三烯-b4(lt-b4)均购自北京诚林生物科技有限公司；酶标仪mldel680(美国伯乐公司)；正置显微镜cx41(olympus公司)；恒温烘箱dhg-9023a(上海恒一科学仪器有限公司)；其余试剂均购自国药集团。

2.实验方法

2.1实验动物的准备

健康balb/c小鼠，spf级，体重18～22g，雄性，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。动物置于(22±1)℃控温和光暗周期为12h环境下，给予清洁级普通小鼠饲料饲养(上海中医药大学动物试验中心提供)。

2.2干姜挥发油提取

2.2.1水蒸气提取法(水蒸气蒸馏法(sd))：取干姜饮片300g，粉碎至粒径为60目，加水量为12倍，加入蒸馏水2100ml，置电热套中保持微沸7h后收集，挥发油得率为0.9％。

2.2.2超临界co2萃取法(超临界萃取法(sfe))：取干姜饮片，在压力25mpa，萃取温度55℃的条件下萃取2h，挥发油得率为3％。为便于调整剂量，促进小鼠胃部吸收以及保证给药浓度的均一性，因此在灌胃前采用吐温-80对挥发油进行乳化，比例为油：吐温-80：水＝2：1：4.2。且根据实验给药剂量的不同，可以乳化成不同浓度。

2.3复制脂多糖lps诱导急性肺损伤剂量的确定

将balb/c小鼠随机分为4组，每组10只。气管灌注lps的剂量分别为：0.5mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg，假手术组为气管灌注pbs1mg/kg，一共观察5d。选择指标为在灌注剂量尽可能大的前提下保证模型存活率100％进行选择。

2.4复制脂多糖lps诱导的急性肺损伤模型的复制及分组给药

将健康雄性balb/c小鼠随机分为7组，每组10只。组别为：sfe高剂量组、sfe低剂量组、sd高剂量组、sd低剂量组、模型组、阳性药组、空白对照组。造模方法：掐住小鼠颈前方的食道，将灌胃针顶在颈后方的气管部灌注lps，听到小鼠气管有洗液声即提示造模成功，4h后开始给药。给药剂量为：sfe高剂量组0.8ml/kg、sfe低剂量组0.2ml/kg、sd高剂量组0.8ml/kg、sd低剂量组0.2ml/kg、阳性药组5mg/kg，空白对照组给予等体积的pbs(磷酸盐缓冲液)。连续给药6d，末次给药后处理。

2.5balf(支气管肺泡灌洗液)的收集

剪开小鼠喉部表皮及胸腔，分离气管及肺脏。用止血钳夹住右肺气管，细线固定经磨平针口的针头，用注射器对肺部灌洗pbs0.5ml/次，连续灌洗两次，回收balf约0.6ml，回收率为60％。将回收的balf置于低温高速离心机内，离心条件为：3000r·min^﹣1，10min，取上清液储存入-80℃冰箱冻存。剪下右肺经生理盐水洗净后放置福尔马林溶液固定留作切片。

2.6elisa法检测细胞因子的浓度

采用elisa法检测balf中细胞因子的浓度。根据elisa试剂盒操作说明配制标准品，建立标准曲线并在492nm处测吸光值。

样品的计算：将样品的od值带入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数5，即为样品的实际浓度。

2.7肺组织切片的染色方法

将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片30min；置于二甲苯i中浸泡15min，再置于二甲苯ii中浸泡15min。将脱蜡后的切片经100％酒精、95％酒精、85％酒精、75％酒精分别浸泡5min，自来水冲洗10min。将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5min，氨水中分色，数秒钟。流水冲洗15min，入70％和90％酒精中脱水各10min。入酒精伊红染色液染色1-2min，染色后的切片经纯酒精脱水。将玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱中15min，染色完成。

3.结果

3.1lps剂量的试验结果

气管灌注不同剂量lps复制急性肺损伤模型的小鼠存活率及死亡时间见图4-6，最终选定0.5mg/kg为复制急性肺损伤模型的lps剂量。

3.2标准曲线计算

tnf-α在balf(支气管肺泡灌洗液)中的标准曲线为y＝0.0049x+0.0924(r＝0.9964)；lt-b4在balf中的标准曲线为y＝0.0175x-0.0058(r＝0.9950)；pge2在balf中的标准曲线为y＝0.0115x-0.0711(r＝0.99678)；il-8在balf中的标准曲线为y＝0.0255x-0.0413(r＝0.9966)均符合样本检测要求。

3.3干姜挥发油对balf中tnf-α的影响

结果见图3，应用spss软件统计数据，采用独立样本t检验的方法，对比空白组与模型组得到p﹤0.05，即说明造模成功。采用单因素方差分析的方法，对比模型组、sfe高、sfe低、sd高、sd低、阳性药(低塞米松)进行lsd两两比较均得到p﹤0.05，组间均有差异，说明两种方法提取的干姜挥发油之间以及高低剂量组之间balf的tnf-α浓度均有显著性差异：干姜挥发油对balf中的tnf-α的浓度升高有明显抑制作用，且sd组的效果优于sfe组，并与剂量成正相关。

3.4干姜挥发油对balf中lt-b4的影响

结果见图4，应用spss软件统计数据，采用独立样本t检验的方法，对比空白组与模型组得到p﹤0.05，即说明造模成功。采用单因素方差分析的方法，对比模型组、sfe高、sfe低、sd高、sd低、阳性药进行lsd两两比较均得到p﹤0.05，组间均有差异，说明两种方法提取的干姜挥发油之间以及高低剂量组之间balf的lt-b4浓度均有显著性差异：干姜挥发油对balf中的lt-b4的浓度升高有明显抑制作用，且sfe组的效果优于sd组，并与剂量成正相关。

3.5干姜挥发油对balf中pge2的影响

结果见图5，应用spss软件统计数据，采用独立样本t检验的方法，对比空白组与模型组得到p﹤0.05，即说明造模成功。采用单因素方差分析的方法，对比模型组、sfe高、sfe低、sd高、sd低、阳性药进行lsd两两比较得到，sd低与模型组之间p＝0.226﹥0.05、sfe高与sfe低之间p＝0.102﹥0.05、sfe高与阳性药之间p＝0.056﹥0.05，其他对比均p﹤0.05，说明：sfe高，sd高，sfe低组对balf中的pge2浓度升高有显著抑制作用，且sfe组的高低剂量之间结果并无显著差异，同时sfe高组的抑制效果与阳性药组并无显著差异。

3.6干姜挥发油对balf中il-8的影响

结果见图6，应用spss软件统计数据，采用独立样本t检验的方法，对比空白组与模型组得到p﹤0.05，即说明造模成功。采用单因素方差分析的方法，对比模型组、sfe高、sfe低、sd高、sd低、阳性药进行lsd两两比较得到，模型组与sfe高、sfe低、sd高、sd低、阳性药组均p﹤0.05，但这些组间的差异均p﹥0.05，说明两种方法提取的干姜挥发油对balf中il-8的浓度升高均有显著抑制作用

3.7病理切片的观察

各实验组肺部切片的显微观察见图7：7d后对比空白组与模型组，可以看出空白组的肺泡清晰且大，模型组肺泡隔膜增厚，且明显出现灶性出血。阳性药恢复效果最佳，肺泡隔膜较清晰，出血点较少。

对比sfe高低剂量组、sd高低剂量组、sfe低剂量组、sd低剂量组的切片情况，依次可见肺泡隔膜逐渐增厚，出血点及出血面积逐渐增大，总体恢复程度呈顺次递减趋势。

3.8干姜挥发油提取工艺：本发明的挥发油提取方法，本发明均使用正交实验进行了考察，为最佳提取工艺。

3.9实验动物的选择

balb/c小鼠是白变种实验室老鼠，起源于小家鼠musmusculus。因其近交繁殖，有免疫缺陷，个体差异小，因而易患肺部疾病，且发病率雄性高于雌性。固选择balb/c雄性小鼠作为此次造模动物。

3.10干姜挥发油对balf中tnf-α的影响

tnf-α是参与全身炎症反应中重要的促炎因子，并且是ali/ards发病过程中最早释放的细胞因子之一，也被认为是启动因子，在炎症初期迅速达到顶峰。通过实验可以看出，两种方法提取的干姜挥发油对tnf-α的释放均有抑制作用，并且sd组tnf-α的浓度低于sfe组。但是由于该数据为给药第7d得到，并不能完全反映ali发病初期tnf-α在两组间的效果差异，固推测在炎症反应末期sd组在抑制tnf-α因子的效果上优于sfe组。

3.11干姜挥发油对balf中lt-b4的影响

lt-b4是中性粒细胞释放的炎症因子之一，也是磷脂酶a2(pla2)及其活化后产生的花生四烯酸代谢产物之一，lt-b4可引起气道平滑肌收缩和血管通透性的增加，并促进整个炎症过程发展，尤其在炎症发展的4d后，肺功能进入失代偿期，肺含水量和血管通透性显著增加，继而出现严重肺水肿。根据实验结果和病理观察情况可以看出，两种方法提取的干姜挥发油对抑制lt-b4的释放均有显著效果，其中sfe组效果优于sd组，故推测针对lt-b4引起的后期肺水肿等反应，sfe组效果优于sd组。

3.12干姜挥发油对balf中pge2的影响

pge2作为中性粒细胞释放的细胞因子是炎症反应重要介质之一，是ali发病过程中导致肺损伤的重要效应细胞。pge2在肺泡中浓度升高会释放更多损伤介质，引起弥漫性肺泡损害以及中枢性发热。根据实验结果和病理观察情况，sfe高低剂量组及sd高剂量组对balf中pge2浓度有显著抑制效果，且sfe组优于sd组。

3.13干姜挥发油对balf中il-8的影响

il-8是受tnf-α刺激后启动与肺部炎症直接相关的炎症因子，由巨噬细胞施放，和tnf-α一起在炎症反应中起关键作用，同时il-8还可致机体局部炎症反应。根据实验结果和病理观察情况，可以看出两种提取方法提取的干姜挥发油对抑制il-8均有显著效果，且sfe组优于sd组。

3.14sfe组优于sd组的原因

干姜中挥发油主要成分为萜类，而姜辣素成分属于倍半萜类，已有研究证实具有抗炎作用，对cox-2和inos的表达有抑制作用，其中cox-2是一种pge合成中关键作用的酶，已经成为抗菌素药物作用的靶分子。讨论得出：sfe组可以对部分姜辣素成分进行提取，而sd组不能。sfe组抑制效果好于sd组和姜辣素类成分的提取有关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。