1-茚酮在制备治疗或预防常染色体显性遗传多囊肾病药物的应用的制作方法

本发明提供了1-茚酮在制备治疗或预防常染色体显性遗传多囊肾病的药物的应用，属于生物医药领域。

背景技术：

蕨(学名：pteridiumaquilinum(l.))是凤尾蕨科(pteridaceae)蕨属欧洲蕨的一个变种，1-茚酮(1-indanone)提取自干燥的欧洲蕨菜幼叶，其具有多种生物活性，其中包括抗炎、抗菌、抗病毒、治疗阿兹海默症、抗肿瘤等。之前有研究表明1-茚酮衍生物可以作为乙酰胆碱酯酶抑制剂从而治疗阿兹海默症。并且，1-茚酮可以诱发多种耐药性肿瘤细胞(例如mcf-7,hl-60,mes-sa)的凋亡，对多种恶性肿瘤如结肠癌、乳腺癌、白血病等均展现出了显著的抑制活性。1-茚酮的化学结构如下：

常染色体显性遗传多囊肾病(autosomaldominantpolycystickidneydisease，简称adpkd)是最常见的单基因遗传性肾病，其发病率为1/1000～1/400，是导致终末期肾病(end-stagerenaldisease，简称esrd)的第四位原因，临床病理表现为患者双侧肾脏有进行性充液囊泡生成并不断扩增。囊泡上皮细胞增殖，囊液不断分泌并伴随肾脏组织间质纤维化，逐渐压迫肾实质，最终导致肾脏功能丧失乃至肾衰竭。目前临床上缺乏理想的可以早期干预囊泡发生及生长且副作用较少的adpkd治疗药物，患者只能通过血液透析或移植来维持生命，给患者家庭和社会带来巨大负担。因此，研发可以明显延缓囊泡发生发展的adpkd特异性的治疗药物对于临床疾病的治疗有着重要的指导意义。

目前临床上唯一被批准上市的治疗adpkd的药物为血管紧张素ⅱ型受体(v2r)阻断剂托伐普坦，是通过下调体内camp水平发挥其对囊泡的抑制作用，但临床数据表明v2r拮抗剂只有在集合管源性的囊泡中发挥抑制作用，而对近曲小管细胞源性的囊泡并没有明显影响，并且托伐普坦具有一定的肝脏毒性。目前临床上对于adpkd仍缺乏理想的治疗药物。根据adpkd的发病机制，筛选囊泡形成和生长的抑制剂，研发治疗adpkd的新药物，仍然是目前该领域的研究热点。

技术实现要素：

为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了1-茚酮在制备治疗或预防常染色体显性遗传多囊肾病的药物中的应用。

本发明还提供了1-茚酮在制备治疗或预防pkd1基因突变引发的常染色体显性遗传多囊肾病的药物中的应用。

本发明还提供了1-茚酮在制备抑制mdck囊泡和胚胎肾囊泡产生的药物中的应用。

本发明还提供了1-茚酮在制备抑制肾脏囊泡生成和/或生长的药物中的应用。

本发明还提供了1-茚酮在制备抑制囊泡增殖信号通路的药物中的应用。

以上应用，在体pkd小鼠给药剂量为50～125mg/kg/d，优选剂量为100mg/kg/d；离体实验剂量为1μm～25μm，优选地为1μm、5μm和25μm。

本发明还提供了用于治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病的组合物，所述组合物中包括1-茚酮及其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。

优选地，所述应用中，所述药学上可接受的载体包括为固体载体或液体载体。

有益效果：本发明应用mdck囊泡模型证明1-茚酮能够抑制囊泡的形成和生长，并通过体外胚胎肾囊泡模型确定1-茚酮的肾内药理学活性，对肾脏内囊泡的发展具有显著的抑制作用，最后在多囊肾小鼠模型中进一步证明，1-茚酮在体内同样具有抑制囊泡发生、发展的作用，以上体外和体内的囊泡抑制作用，呈剂量效应关系。

本发明还表明1-茚酮不影响肾脏细胞的活力，说明1-茚酮对多囊肾的抑制作用与其细胞毒性无关；1-茚酮对细胞内增殖信号通路的调节作用，是其抑制肾脏囊泡发生和发展的重要机制之一。

以上结果表明：1-茚酮可以用于治疗常染色体显性遗传多囊肾病。

附图说明

图1为mdck细胞集落与囊泡示意图。

图2为1-茚酮抑制mdck囊泡作用的生长图及统计图；其中，上图为1-茚酮抑制mdck囊泡作用的生长图，下图为1-茚酮对囊泡生长的抑制曲线图。

图3为小鼠胚胎肾囊泡模型示意图。

图4为1-茚酮抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图及统计图；其中，上图为1-茚酮抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图，下图为不同剂量的1-茚酮对小鼠胚胎肾囊泡生长的抑制作用图。

图5为pkd1^flox/flox；ksp-cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片及肾重指数统计图；其中，左图为pkd1^flox/flox；ksp-cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片，右侧为肾重指数统计图。

图6为pkd1^flox/flox；ksp-cre小鼠模型给药后肾脏组织切片he染色图及肾脏的囊性指数图。

图7为1-茚酮促进mdck小管样结构的形成示意图。

图8为1-茚酮对mdck囊泡细胞活力的影响示意图。

图9为1-茚酮对小鼠肾脏增殖信号的影响示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的犬肾细胞(madin-darbycaninekidneycells，mdck)为atcc细胞库产品，编号为ccl-34。其中mdck囊泡和胚胎肾囊泡实验分别采用三个剂量1μm、5μm、25μm的1-茚酮。

实施例11-茚酮对囊泡生长的抑制

体外在三维基质胶(purecolcollagen，inamedbiomaterialsfremont公司，货号5409)中培养犬肾集合管细胞(madin-darbycaninekidneycells，mdck)。

培养液1为在10×mem培养液中添加三维基质胶、hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、青霉素和链霉素得到的三维基质胶浓度为2.9mg/ml、hepes浓度为10mm、青霉素浓度为100u/ml、链霉素浓度为100μg/ml的培养液，ph为7.4。

培养液2为在dmem/f12培养液中添加fbs和forskolin(fsk，弗斯可林，sigma公司，货号f6886)得到的fbs浓度为10％、forskolin浓度为10μm的培养液，dmem/f12培养液为由dmem培养基(美国invitrogen公司,商品目录号12100-046)和f12培养基(美国invitrogen公司,商品目录号21700-075)等体积混合得到的液体。

取24孔板，将mdck细胞混匀于400μl的培养液1中，加入24孔板的一个孔中，每孔细胞数相同，为800个/孔。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液2，置于37℃的5％co2培养箱中培养，培养4天左右即可在显微镜下观察到单层上皮包被的单囊腔囊泡；然后在细胞培养孔中加入终浓度分别为1μm、5μm和25μm的1-茚酮继续培养，每个剂量重复3个孔。每12h更换新鲜的含有1-茚酮和forskolin的培养液，每两天跟踪拍照记录各个囊泡并测量囊泡直径以评价不同浓度的1-茚酮对囊泡生长的抑制作用，共观察8天，每孔计数20个以上囊泡，作囊泡生长曲线。

1-茚酮对囊泡生长的抑制作用结果如图2所示。

上图为1-茚酮抑制mdck囊泡作用的生长图；对照组为1-茚酮浓度为0的处理组。其中，第一排表示第5～12天用仅含forskolin的培养液培养，第二排表示第5～12天用含有1μm的1-茚酮和forskolin的培养液共同培养，第三排表示第5～12天用含有5μm的1-茚酮和forskolin的培养液共同培养，第四排表示第5～12天用含有25μm的1-茚酮和forskolin的培养液共同培养，第五排表示第5～9天用含有25μm的1-茚酮和forskolin的培养液共同培养，第9～12天用只含forskolin的培养液培养。

可以看出，1-茚酮可以显著抑制囊泡的生长，并且1-茚酮对囊泡的抑制作用随浓度的增加而增强，说明1-茚酮对mdck囊泡生长的抑制作用具有剂量效应。

下图左边为1-茚酮对囊泡生长的抑制曲线图；

倒三角曲线代表第5～12天用只含有forskolin的培养液培养，黑色球曲线代表第5～12天用含有1μm的1-茚酮和forskolin的培养液培养，方形曲线代表第5～12天用含有5μm的1-茚酮和forskolin的培养液培养，正三角曲线代表第5～12天用含有25μm的1-茚酮和forskolin的培养液培养。

下图右边为1-茚酮对囊泡生长的抑制作用呈可逆性的曲线图；

黑色球曲线代表第5～12天用只含有forskolin的培养液培养，方形曲线代表第5～9天用含有25μm的1-茚酮和forskolin的培养液培养，第9～12天用只含forskolin的培养液培养。

实施例21-茚酮对小鼠胚胎肾囊泡生长的抑制

将6周龄以上的c57bl/6小鼠(北京大学医学部实验动物中心)按照1∶1的数量进行雌雄同笼交配，第2天早上观察雌鼠是否有阴栓，若有阴栓则表示雌鼠已怀孕0.5天，将没有阴栓的小鼠先分笼，晚上再合笼，第二日再观察；将怀孕雌鼠继续单独喂养13天，第13天取胚胎肾用transwell板(corning公司，货号3401)培养。

取上述13.5天的小鼠胚胎肾置于transwell的上层小室中，下层培养孔中加入含有终浓度为100μm的8-br-camp(sigma公司，货号b-5386)的dmem培养液进行培养，在8-br-camp的作用下，肾组织内会形成多发性、进行性生长的肾囊泡，可以作为评价1-茚酮预防和/或治疗adpkd的体外整体器官水平筛药模型。

1-茚酮抑制小鼠胚胎肾囊泡作用结果见图4。

其中，上图为1-茚酮抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图，第一行为胚胎肾在加入100μm的8-br-camp持续培养到第6天，第二、三、四行为胚胎肾在加入100μm的8-br-camp刺激的基础上，加入1μm、5μm、25μm的1-茚酮进行处理，培养至第6天，每12h更换新鲜的相应的培养液。第五行为胚胎肾在加入100μm的8-br-camp刺激的基础上，加入25μm的1-茚酮进行处理，培养至第4天，第5～6天在仅含有8-br-camp的培养液中培养，每天跟踪拍照记录肾脏的状况，实验重复三次。

下图左边为不同剂量的1-茚酮对小鼠胚胎肾囊泡的抑制作用。下图右边为1-茚酮对胚胎肾囊泡抑制长作用具有可逆性。

结果发现，1-茚酮明显抑制了肾脏囊泡的发展，并且其对胚胎肾囊泡的抑制作用呈剂量依赖关系。并且当第5～6天药物被去除后，囊泡又重新恢复生长。

实施例3体内实验

所用小鼠按照如下方法得到：将pkd1^flox/flox小鼠和ksp-cre小鼠交配得到子一代pkd1^+/-；ksp-cre小鼠，将pkd1^+/-；ksp-cre小鼠的公鼠和母鼠交配，得到野生型小鼠pkd1^+/+；ksp-cre和pkd1^flox/flox；ksp-cre小鼠(kpkd小鼠)。其中，pkd1^flox/flox小鼠和ksp-cre小鼠的遗传背景均为c57bl/6小鼠，均记载在文献(wangw,lif,suny,etal.aquaporin-1retardsrenalcystdevelopmentinpolycystickidneydiseasebyinhibitionofwntsignaling.fasebj.2015；29(4):1551-1563.)中。pkd1^flox/flox小鼠为在c57bl/6小鼠背景下全肾特异性的敲除pkd1基因得到的小鼠，使小鼠出生后即发生快速进行性发展的adpkd，该种小鼠可在出生后存活约7～10天左右，在小鼠出生后的第一天进行基因鉴定，确定小鼠的基因型。pkd1^flox/flox小鼠对应的野生型c57bl/6小鼠记为pkd1^+/+小鼠。

将野生型小鼠(pkd1^+/+；ksp-cre)和pkd小鼠(pkd1^flox/flox；ksp-cre)均随机分为两组，空白对照组(ctrl)(空溶剂组，即注射生理盐水)及给药组(ind)(小鼠每千克体重每天给药剂量为100mg的1-茚酮)，每组小鼠不少于5只。每只小鼠从出生后第1天开始，每24小时使用胰岛素注射器皮下注射进行给药(每次注射量均为30μl)，空白对照组(ctrl)每只小鼠每次注射30μl的1-茚酮溶液，给药组(ind)每只小鼠每次注射30μl的1-茚酮溶液(1-茚酮溶液为将商品化1-茚酮粉末溶于生理盐水得到的溶液)，一直给药持续到出生后第5天。称重，处死，取组织。

从小鼠的肾脏大小及体重(图5，左图为pkd1flox/flox；ksp-cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片，右侧为体重统计图)来看，各组之间没有显著性差异。从肾脏大小来看，出生后第5天，基因敲除pkd小鼠中，发生明显的多囊肾，给予1-茚酮治疗以后，肾脏体积明显变小。而1-茚酮对正常肾脏大小无明显影响。

各组小鼠之间体重无明显差异，但是在pkd小鼠中，给予1-茚酮治疗显著降低了多囊肾小鼠的肾重指数(双侧肾重/体重)(图5右图)。

小鼠肾脏切片h&e染色的结果显示，在pkd小鼠中，小鼠肾脏中有大量囊泡，给予1-茚酮，小鼠肾脏明显变小，肾脏组织结构得到改善(图6)。

实施例41-茚酮促进mdck小管样结构的形成。

在mdck细胞小管生成实验中，将mdck细胞种于三维基质胶中，直接加入3t3条件培养液(3t3成纤维细胞在完全培养液中培养2～3天，所得培养液即为3t3条件培养液，其中含有肝细胞生长因子，具有促进细胞分化的作用)进行培养，每24h更换新鲜培养液，培养至第12天，由于肝细胞生长因子可以促进内皮细胞的分化，mdck细胞集落上会逐渐形成小管样结构。在3t3条件培养液中同时加入不同终浓度的1-茚酮(浓度分别为1μm、5μm、25μm)，每24h更换新鲜的含有1-茚酮的培养液，每组至少3个复孔，每孔至少跟踪10个以上细胞集落，每2天进行跟踪拍照，在第12天，统计每个细胞集落上形成的小管数目及每个集落上最长小管的长度，以此来研究不同浓度1-茚酮对mdck细胞分化的影响。

结果如图7所示，上图为mdck细胞在3t3条件培养液刺激下形成分支结构；并在给予不同浓度的1-茚酮以后显著促进mdck细胞上分支结构的形成和延长。对小管数目和长度的统计结果显示，ind剂量依赖性的促进mdck细胞上小管结构的形成(下图左边)和延长(下图右边)，具有统计学差异。

实施例5细胞毒性实验

通过cck-8法确定1-茚酮的细胞毒性

将对数期的mdck细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含有1×10⁴个细胞，每孔给予100μl含有10％胎牛血清(fbs，荷兰gibcofisherscientific公司)的dmem培养基(美国invitrogen公司,商品目录号12100-046)，置于37℃的5％co2培养箱中培养24小时。去除fbs，血清饥饿24小时。之后向细胞培养孔(给药孔)中加入1-茚酮溶液，每孔加入的体积均相同，1-茚酮的浓度分别为0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm和200μm。每孔一种浓度，培养24小时。除去上清液，加入含有10％cck-8试剂的dmem培养液，37℃的5％co2培养箱中继续培养1小时，酶标仪检测各孔od值(检测波长450nm),设置调零孔(含有等量的培养基、cck-8和dmso，不含有1-茚酮)和对照孔(含有等量的细胞、培养基、cck-8和dmso，不含有1-茚酮，即1-茚酮为0μm的给药孔)，每组设定至少5个复孔。按照下述公式计算细胞活力，细胞活力＝(给药孔-调零孔)]/(对照孔-调零孔)×100％。实验重复3次。

图8为cck-8为1-茚酮对mdck细胞的细胞毒性检测结果图，结果显示：不同浓度给药组(ind)与对照组(0μm)之间无明显差异,浓度为200μm的1-茚酮尚不抑制mdck细胞的细胞活力，对mdck细胞无毒性作用，说明1-茚酮抑制囊泡生长的作用与其细胞毒性无关。

实施例5westernblot实验

实验方法：分别取kpkd1(-/-)、kpkd1(+/+)小鼠肾脏，用westernblot方法研究1-茚酮对肾脏增殖信号表达水平的影响。

westernblot方法：用ripa裂解液处理肾脏组织，收取蛋白、用bca法进行蛋白定量。调整样品的蛋白量进行sds-page，将电泳分离的蛋白转移到pvdf膜上。pbst洗膜5min×3。室温下用5％脱脂奶粉(pbst溶解)封闭pvdf膜1h。随后加入抗增殖和纤维化等信号分子抗体，4℃孵育过夜。pbst洗脱3次，加入相应的二抗，孵育1h，漂洗3次。将pvdf膜用发光试剂ecl显色，bio-rad凝胶成像胶采集图像，用quantityone对图像进行灰度分析。上述实验均重复3～5次。

实验结果：图9为1-茚酮对小鼠肾脏增殖信号的影响示意图，结果表明：1-茚酮可以明显抑制肾脏增殖信号分子的表达水平，包括erk1/2、s6、pcna等。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。