一种双层引导骨再生支架及其制备方法

1.本发明属于骨修复支架技术领域，特别是涉及一种双层引导骨再生支架及其制备方法。


背景技术：

2.由外伤、肿瘤、炎症和先天性疾患等造成的骨缺损在临床中非常常见，由此带来的组织损伤及功能障碍严重影响患者的身心健康和生活质量。目前临床上主要采用植入自体骨、异体骨和人工骨修复材料等方法进行治疗。异体骨有可能在体内引发免疫排斥反应；自体骨存在来源有限、引发二次创伤等局限性。随着组织工程技术的快速发展，应用组织工程学原理进行骨修复，已成为目前的研究热点。其中，引导骨再生(gbr)技术是最常用、最有效的方法之一。该技术的关键在于通过机械屏障膜(gbr膜)物理性地将软组织与骨缺损区域阻隔开，给骨缺损区域创建一个相对稳定的骨再生微环境，保护生长且迁移速度较慢的成骨前体细胞进入骨缺损区，阻止生长且迁移速度较快的纤维结缔组织长入缺损区，促进缺损区域骨质的修复性再生。
3.根据其生物降解性，现有的gbr膜可被分为可吸收膜与不可吸收膜两种。不可吸收膜需要二次手术取出，增加了患者痛苦和感染风险，限制了其临床应用。目前，临床上应用最广泛的可吸收屏障膜是瑞士geistlich公司生产的bio-gide胶原膜。胶原是天然骨中含量最多的有机成分，具有良好的生物相容性和组织修复效果，是制备引导骨再生膜的理想原料。然而，胶原膜也存在一些缺陷，如提纯工艺复杂、成本高；湿态力学强度欠佳，单独使用时易塌陷移位，难以维持修复后期的骨再生空间；体内降解速度过快；单一胶原材料的生物活性及成骨诱导性不足及缺乏抗菌能力等。因此，开发理想的引导骨再生材料已成为当前的研究热点。
4.目前制备引导骨再生膜常用的组织工程技术为静电纺丝、浇铸成型等。浇铸成型制备的膜结构致密，能发挥良好地阻挡结缔组织长入的作用，然而其均质致密的结构不利于营养物质的扩散及细胞的粘附和长入，从而影响骨再生修复效果。静电纺丝法虽然能制备模拟细胞外基质的纳米级纤维，但其无法制备三维立体的支架结构，也无法对支架结构实现精确控制。此外，电纺纤维之间的孔隙较小(约数十微米)，纤维排列较致密，限制了细胞的三维长入及细胞与支架间的相互作用。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双层引导骨再生支架及其制备方法，该双层引导骨再生支架包括疏松层和致密层，所述疏松层采用近场直写打印方法制备获得，利于细胞粘附、细胞与支架间的相互作用及骨组织长入，所述致密层采用静电纺丝方法制备获得，利于阻挡上皮和结缔组织长入，采用上述方法制备的双层引导骨再生支架既具有物理屏障功能又具有引导骨再生功能。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双层引导骨再生支
架，包括疏松层和致密层，所述致密层设于所述疏松层上，所述疏松层的孔隙率为92％～98％，所述致密层的孔隙率为40％～60％。
7.疏松层的孔隙率是指疏松层的孔隙体积与疏松层在自然状态下的总体积的百分比。致密层的孔隙率是指致密层的孔隙体积与致密层在自然状态下的总体积的百分比。
8.优选地，还包括如下技术特征的至少一项：
9.1)所述疏松层与所述致密层的厚度比为2:1～5:1；
10.2)所述疏松层具有规则结构；
11.3)所述疏松层通过近场直写打印方法获得；
12.4)所述致密层由排列方向无规则的纤维构成；
13.5)所述致密层通过静电纺丝方法获得；
14.6)所述疏松层和所述致密层的材料为混有促成骨组分和/或抗菌活性组分的高分子材料。
15.更优选地，特征2)中，所述疏松层包括若干交替设置的第一疏松部件和第二疏松部件，所述第一疏松部件包括若干平行的第一支架单元，所述第二疏松部件包括若干平行的第二支架单元，所述第一支架单元与所述第二支架单元交叉形成微孔。
16.进一步更优选地，其特征在于，还包括如下技术特征中的至少一项：
17.a1)不同第一疏松部件的第一支架单元平行排布；
18.a2)不同第二疏松部件的第二支架单元平行排布；
19.a3)同一第一疏松部件中相邻第一支架单元的间距为50μm～800μm；同一第二疏松部件中相邻第二支架单元的间距为50μm～800μm；
20.a4)第一支架单元为圆柱形，直径为10μm～100μm；第二支架单元为圆柱形，直径为10μm～100μm；
21.a5)相邻第一疏松部件和第二疏松部件中第一支架单元与第二支架单元交叉的角度α大于0
°
且小于180
°
。
22.更优选地，还包括如下技术特征中的至少一项：
23.41)特征4)中，所述纤维的直径为100nm～1500nm；
24.61)特征6)中，所述高分子材料为合成高分子材料和/或天然高分子材料；所述合成高分子材料选自聚己内酯、聚己内酯改性材料、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物改性材料、聚乳酸、聚乳酸改性材料、聚羟基乙酸和聚羟基乙酸改性材料中的至少一种，所述天然高分子材料选自海藻酸盐、明胶、基质胶、胶原、壳聚糖、纤维蛋白及上述改性材料中的至少一种；
25.62)特征6)中，所述高分子材料的重量份为5～20；
26.63)特征6)中，所述促成骨组分选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃、介孔硅和石墨烯中的一种或几种；
27.64)特征6)中，所述促成骨组分的重量份为2～5；
28.65)特征6)中，所述抗菌活性组分选自铜、锌、镁、抗菌肽和抗生素中的一种或几种；
29.66)特征6)中，所述抗菌活性组分的重量份为0.1～1。
30.本发明第二方面提供上述双层引导骨再生支架的制备方法，包括如下步骤：
31.1)采用近场直写打印方法制备获得所述疏松层；
32.2)以步骤1)获得的所述疏松层为接收装置，以静电纺丝方法制备获得所述致密层。
33.优选地，步骤1)的打印材料和步骤2)的静电纺丝材料经加热熔融或溶剂溶解后再进行制备。
34.更优选地，还包括如下技术特征中的至少一项：
35.1)步骤1)的打印材料和步骤2)的静电纺丝材料为混有促成骨组分和/或抗菌活性组分的高分子材料；
36.2)所述溶剂选自水、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、六氟异丙醇、丙酮和二甲基亚砜中的一种或几种；
37.3)所述溶剂与步骤1)的打印材料和步骤2)的静电纺丝材料的质量比为74：26～92.9：7.1。
38.进一步更优选地，特征1)中，还包括如下技术特征中的至少一项：
39.11)所述高分子材料为合成高分子材料和/或天然高分子材料；所述合成高分子材料选自聚己内酯、聚己内酯改性材料、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物改性材料、聚乳酸、聚乳酸改性材料、聚羟基乙酸和聚羟基乙酸改性材料中的至少一种，所述天然高分子材料选自海藻酸盐、明胶、基质胶、胶原、壳聚糖、纤维蛋白及上述改性材料中的至少一种；
40.12)所述高分子材料的重量份为5～20；
41.13)所述促成骨组分选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃、介孔硅和石墨烯中的一种或几种；
42.14)所述促成骨组分的重量份为2～5；
43.15)所述抗菌活性组分选自铜、锌、镁、抗菌肽和抗生素中的一种或几种；
44.16)所述抗菌活性组分的重量份为0.1～1。
45.优选地，还包括如下技术特征中的至少一项：
46.1)步骤1)中，打印温度为50℃～400℃；
47.2)步骤1)中，选用g23～g30中的一种打印针头；
48.3)步骤1)中，打印材料的料筒气压为500kpa～2000kpa；
49.4)步骤1)中，高压模块电压为﹣50kv～﹢50kv；
50.5)步骤1)中，打印针头到接收板的距离为1mm～5mm；
51.6)步骤1)中，打印喷头移动速度为20mm/s-200mm/s；
52.7)步骤1)中，打印拉丝直径为10μm～100μm；
53.8)步骤1)中，纤维交织角度大于0
°
且小于180
°
；
54.9)步骤1)中，纤维间距为50μm～800μm；
55.10)步骤2)中，选用g23-g30中的一种打印针头；
56.11)步骤2)中，纺丝过程中打印针头的推进速度为0.1ml/h～3ml/h；
57.12)步骤2)中，高压模块电压为﹣15kv～﹢15kv；
58.13)步骤2)中，打印针头到接收板的距离为3cm～30cm；
59.14)步骤2)中，静电纺丝过程中保证接收板及其上的疏松层相对静止；
60.15)所述制备方法还包括步骤3)：将步骤2)获得的支架进行干燥。
61.如上所述，本发明至少具有以下有益效果之一：
62.1)本发明双层引导骨再生支架中疏松层利于细胞粘附、细胞与支架间的相互作用及骨组织长入，致密层利于阻挡上皮和结缔组织长入，采用上述方法制备的双层引导骨再生支架即具有物理屏障功能又具有引导骨再生功能。
63.2)所述疏松层具有三维立体的支架结构，采用近场直写打印方法制备获得，能精确调控结构和形状，所述致密层采用静电纺丝方法制备获得，从而电纺纤维之间的孔隙较小，纤维排列较致密，本发明将近场直写打印方法和静电纺丝方法相结合，获得本发明的双层引导骨再生支架。
64.3)本发明双层引导骨再生支架的材料为混有促成骨组分和/或抗菌活性组分的高分子材料，抗菌活性成分能有效地预防感染并控制炎症，成骨纳米组分具有促成骨的功能。
65.4)本发明双层引导骨再生支架的力学和降解性能通过改变打印材料的成分和浓度等来进行调节，以满足临床上对力学强度和降解速率的要求。
附图说明
66.图1为双层引导骨再生支架的结构示意图。
67.图2为双层引导骨再生支架中疏松层的结构示意图。
68.图3为疏松层与致密层的大体照片。
69.其中，a为疏松层的大体照片；b为致密层的大体照片。
70.图4为双层引导骨再生支架表面及横断面的扫描电镜图片。
71.其中，a为从双层引导骨再生支架的疏松层侧的扫描电镜图片；b为从双层引导骨再生支架的致密层侧的扫描电镜图片；c为双层引导骨再生支架横断面的扫描电镜图片。
72.图5为双层引导骨再生支架在pbs溶液及人工唾液中的降解曲线。
73.其中，a为双层引导骨再生支架在pbs溶液中的降解曲线；b为双层引导骨再生支架在人工唾液中的降解曲线。
74.图6双层引导骨再生支架的alp染色及alp活性。
75.图7接种在双层引导骨再生支架上细胞的qpcr结果。
76.图8为双层引导骨再生支架对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌圈。
77.其中，a为双层引导骨再生支架对大肠杆菌的抑菌圈；b为双层引导骨再生支架对金黄色葡萄球菌的抑菌圈。
78.附图标记：
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疏松层
[0080]
11
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第一疏松部件
[0081]
111
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第一支架单元
[0082]
12
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第二疏松部件
[0083]
121
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第二支架单元
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致密层
具体实施方式
[0085]
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
[0086]
请参阅图1至图8。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0087]
实施例1
[0088]
一种双层引导骨再生支架，包括疏松层1和致密层2，所述致密层2设于所述疏松层1上，所述疏松层1的孔隙率为96％，所述致密层的孔隙率为55％，所述疏松层1厚度为0.41mm，所述致密层2的厚度为0.19mm，即所述疏松层1与所述致密层2的厚度比为2:1，所述疏松层1包括若干交替设置的第一疏松部件11和第二疏松部件12，所述第一疏松部件11包括若干平行的第一支架单元111，所述第二疏松部件12包括若干平行的第二支架单元121，所述第一支架单元111与所述第二支架单元121交叉形成微孔，不同第一疏松部件的第一支架单元111平行排布，不同第二疏松部件的第二支架单元121平行排布，同一第一疏松部件中相邻第一支架单元的间距为400μm；同一第二疏松部件中相邻第二支架单元的间距为400μm，第一支架单元为圆柱形，直径为10.2μm；第二支架单元为圆柱形，直径为10.2nm，相邻第一疏松部件11和第二疏松部件12中第一支架单元111与第二支架单元121交叉的角度α为90
°
。依据该双层引导骨再生支架的结构预先绘制好cad打印路径。所述致密层2由排列方向无规则的纤维构成，所述纤维的直径为100nm。
[0089]
上述双层引导骨再生支架的制备方法，包括如下步骤：
[0090]
1)将1.5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga、0.75g明胶及50mg含铜介孔硅纳米颗粒溶于六氟异丙醇溶剂中，配成plga、明胶和纳米颗粒总质量分数为20％的打印墨水。
[0091]
2)将步骤1)中配制好的打印墨水装入打印料筒中，并将预先绘制好的cad打印路径导入电脑中，调节近场静电直写工艺参数：设置推进气压为0.18mpa，外加高压为﹣4.5kv，接收距离为3mm，打印喷头移动速度为25mm/s，打印料筒内的材料在高压电场的作用下按照预设的打印路径逐层堆叠，最终得到预设好的(纤维间距400μm，交织角度90
°
，堆叠10层)疏松层(三维纤维支架)。
[0092]
3)待疏松层制备好后，以此疏松层作为接收装置，调节近场直写打印机的工艺参数：推进泵的推进速率为2.0ml/h，外加高压为10kv，调节纺丝头与接收板之间的距离约为12cm，在其上利用静电纺丝的方式制备致密层纳米纤维膜。将最终制备得到的近场直写打印/静电纺丝双层纳米纤维支架置于真空干燥箱中常温处理12h，以除去未挥发的有机溶剂，备用。
[0093]
实施例2
[0094]
将上述实施例1中利用近场直写打印结合静电纺丝技术制备得到的双层引导骨再生支架进行形貌表征，结果如图3所示。疏松层和致密层的大体照片显示，疏松层纤维支架
结构规则，纤维呈90
°
交织，纤维间孔隙大而清晰(图3a)；致密层纤维结构致密，纤维排列方向无规则(图3b)。扫描电镜结果显示，疏松层结构规则，单根纤维直径为10.2
±
0.5μm，纤维之间呈90
°
交织的方式层层堆叠，纤维间距为400μm，透过疏松层可以看到底部纤维之间紧密交织的致密层(图4a)。相比于疏松层，致密层纤维细小、光滑且排列紧密，单根纤维直径为96.5
±
11.8nm，交织角度无规律，纤维间的孔隙明显减小(图4b)。从双层引导骨再生支架横断面的扫描电镜图片(图4c)中可以看出，疏松层和致密层之间结合紧密，没有分层现象。疏松层断面纤维间排列疏松，而致密层断面结构致密。
[0095]
实施例3
[0096]
将上述实施例1中利用近场直写打印结合静电纺丝技术制备得到的双层引导骨再生支架进行降解性能表征。将制备得到的纤维支架裁剪成10mm
×
10mm的正方形。测量开始前，将每块膜精确称重，记录质量为m0。随后，将各样品分别放在含有5ml pbs(ph 7.4)或5ml人工唾液(ph 7.4)的离心管中，再将离心管放在37℃恒温振荡器中孵育，振荡速度为100rpm。到达预定时间点时，用去离子水将纤维膜表面的残余盐或酶溶液彻底清洗干净后冻干并称重，记录质量为m1。则各时间点各样品的降解百分比可以根据以下公式进行计算：降解百分比(％)＝[(m
0-m1)/m0]
×
100％
[0097]
降解实验结果如图5所示，双层引导骨再生支架在人工唾液中的降解速度比在pbs溶液中快，且双层引导骨再生支架在前2周即出现明显的降解现象。在pbs溶液中，4w时双层引导骨再生支架的降解量为26％左右，12w时降解量为45％左右(图5a)；而在人工唾液中，4w时，双层引导骨再生支架的降解量为40％左右，8w时，降解量为57％左右；12w时，降解量达到70％左右(图5b)。据此推测，双层引导骨再生支架能在4-6个月内完全降解，与临床上理想的双层引导骨再生支架降解周期相吻合。
[0098]
实施例4
[0099]
将上述实施例1中利用近场直写打印结合静电纺丝技术制备得到的双层引导骨再生支架进行体外成骨活性检测。将制备的双层引导骨再生支架裁剪成24孔板大小的圆片，经环氧乙烷消毒后备用。将大鼠骨髓间充质干细胞以5
×
104细胞/孔的密度接种于24孔板内的纤维膜上(利用近场直写打印方式制备的疏松层支架朝上)，每组设置3个平行。待bmscs在纤维膜上贴壁24h后，吸弃旧培养基，换成骨诱导培养基，待到预定的时间点(诱导4、7d)，分别对膜上的细胞进行alp染色和半定量检测。结果如图6所示，与对照组相比，双层引导骨再生支架上alp染色明显加深，且alp活性明显增强。此外，体外成骨诱导7d后的qrt-pcr结果也表明，制备的双层引导骨再生支架上runx2、col i、ocn等成骨相关基因的表达明显增强(图7)。
[0100]
实施例5
[0101]
将上述实施例1中利用近场直写打印结合静电纺丝技术制备得到的双层引导骨再生支架进行体外抗菌活性分析。将制备的双层引导骨再生支架裁剪成96孔板大小的圆片，经环氧乙烷消毒后备用。将各组纤维膜分别放在涂有大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌液的固体培养基上，24h后观察抑菌圈的形成情况并拍照。结果如图8所示，与对照组相比，实验组周围对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都形成了明显的抑菌圈，表明其具有有效的广谱抗菌效能。
[0102]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟
悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。