兰花芽胚复合微晶囊体组合物、其制作方法及用于促进细胞排毒、能量活化与抗老化的用途与流程

1.本发明涉及一种微晶囊体组合物，且特别涉及一种兰花芽胚复合微晶囊体组合物。此外，本发明还涉及上述组合物的制作方法与其用于促进细胞排毒、能量活化与抗老化的用途。


背景技术：

2.中国台湾拥有成熟的兰花种植与组织培养技术，其包括繁多且丰富的品种、纯熟的组织培养技巧、病毒检验能力、与大规模量产的工程技术等。而且，中国台湾目前拥有推动兰花产业的优势条件，包括得天独厚的天然地理条件、傲视全球的多元化品种、技术顶尖的育种专家群、超水平的农业科技基础、遍布全岛的农业试验改良及学研等各类农业技术辅助机构、及闻名世界的信息产业与现代化的物流通路等。
3.在中国台湾，蝴蝶兰年产量约1亿3,294万株，年外销总量约4千万株，占全球供应量20％，销售地区遍及欧美与日本，因此需应用精进的生物科技大量繁殖以满足供货需求。兰花的培育繁殖方法，常见的有：播种繁殖法、花梗催芽繁殖法、断心催芽繁殖法、切茎繁殖法、与组织培养法等五种，可按照品种特性及需求选用适当的繁殖方法。“组织培养法”多撷取具分生能力的顶芽部位进行培养；而茎顶生长点部位的生产多采用芽体增殖(芽长芽)或诱导拟原球体分生苗方式，芽体增殖可减低顶芽优势，使侧芽易于长出，并以此方式增殖芽体。
4.兰花除了用于观赏外，近年来也广泛用于作为化妆品或保养品等产品的原料，使得兰花的经济价值大幅提升，且兰花的需求量更大。兰花须经萃取成为萃取物后，再制作成化妆品或保养品。因兰花的萃取部位不同，则须搭配适当的萃取技术，萃取流程如有变化，所萃取的成份也会不同，可达到的美白效果、抗氧化、或抗老化效果也会受到影响。
5.由于人类皮肤经常受到紫外线、空气、或温度等外在环境影响，有加速皮肤老化或罹患皮肤癌的风险。以皮肤老化为例，外因性因素占60％，而其中紫外线又占高达60％。于影响皮肤老化的研究发现，紫外线不只会造成黑色素细胞活跃，导致皮肤呈现斑点，也会使真皮组织退化，并加速皮肤氧化，产生游离自由基，而这些自由基会破坏纤维母细胞、导致胶原蛋白变性或减少其含量、或造成弹性纤维组织退化并产生老化皱纹，更会加速细胞内dna伤害，以降低皮肤细胞的更新能力与新细胞取代旧细胞的速度变慢。
6.目前多针对上述种种的皮肤问题，开发不同的化妆品原料，再配合添加其他具特殊效果的添加物，添加物的活性成份如：花青素、类黄酮、或多酚类等，对于皮肤美白、抗氧化、抗老化、或防皱等功效相当显著，故市面上许多化妆或保养商品常见有各种植物萃取活性成份添加于其中。基于不同的植物种类、不同部位、或所萃取成份要求与功效不同，须采用的萃取技术皆不同。以兰花为例，同样作为化妆品或保养品的添加物，其萃取技术有许多不同方式，且萃取步骤、流程与环境参数也有差异。
7.中国发明专利申请号第201510295194.7号揭露一种兰花萃取物及其制备方法和
应用，所述兰花为蝴蝶兰属，所述兰花萃取物由以下步骤制备而得：(1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1至10：1混合粉碎或破壁取得兰花浆，溶剂为水、醇类、或醇类水溶液，而醇类为乙醇、丙醇、或丁醇；(2)固液分离：将所述兰花浆进行固液分离，留下液态的兰花滤液；(3)活性划分：将所分离的兰花滤液以分子筛纯化，得到兰花萃取筛分液；(4)浓缩：将所纯化的兰花萃取筛分液以分子筛处理浓缩，或以真空或蒸煮方式进行浓缩，得到活性沉淀物或具活性的活性萃取液。
8.中国发明专利公开号第cn105878122a号揭露一种具祛斑美白效果的天然提取物化妆品，其包括功效成份泽兰提取物与石吊兰提取物，所述泽兰提取物与石吊兰提取物的重量比为2至4：1。而提取物的制备方法为：将干燥的泽兰或石吊兰用乙醇热回流提取，并合并滤液浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；再用水稀释后，依次用石油醚、乙酸乙酯、与水饱和的正丁醇萃取；用水溶解正丁醇萃取物并过滤，滤液用大孔树脂聚集活性成份，喷雾干燥即得。此专利所提的祛斑美白化妆品以植物提取物为功效成份，且通过控制泽兰提取物和石吊兰提取物的含量比来最大化去斑美白效果。
9.中国台湾发明专利申请号102140137揭露一种白花蝴蝶兰花瓣的萃取物及其制备方法与用途，其借由以下列步骤制得：以超临界二氧化碳萃取白花蝴蝶兰花瓣，借此而得到白花蝴蝶兰花瓣的脂溶性萃取物与残余物；以及以水萃取残余物，以得到白花蝴蝶兰花瓣的水溶性萃取物，可用于促进皮肤美白、提升皮肤保湿能力、与预防或推迟皮肤老化。
10.上述第1案例以整株兰花进行萃取、固液分离、活性划分、及浓缩等流程；第2案例则以整株泽兰或石吊兰进行干燥、热回流提取、浓缩、稀释、溶解、与过滤等步骤；第3案例即利用白花蝴蝶兰的花瓣进行超临界二氧化碳萃取与以水萃取。然而，上述前述案例所采用的兰花部位不同，第1、2案例以整株进行，第3案例则仅用花瓣，且因萃取方法、流程、使用设备、或环境相关参数均不同，所取得的萃取成份与含量也会不同。


技术实现要素：

11.无论以整株兰花或花瓣进行萃取，所萃取的活性成份含量与效果仍受限制。中国发明专利公开号第cn105878122a号与中国台湾发明专利申请号102140137揭露高温进行步骤，恐破坏活性成份的化学结构或造成其他可能有活性的物质挥发，以致后续制成的化妆品或保养品的美白、抗氧化、或抗老化效果受到影响。再者，以往利用整株兰花进行萃取，使得兰花所有部位无论是否提升活性或抑制活性的成份均可能萃取取得，故所取得的萃取物整体活性质量将受限制。
12.植物茎节部位通常具有生长点以提供优异的生长机能，生长点细胞可快速分裂与分化以产生新芽，并可使芽轴不断伸长，犹如动物的干细胞再生功能，如能撷取植物茎节生长点细胞进行萃取，所取得的活性成份含量与效益也可能相当高。然而，熟知兰花相关的萃取技术未有针对茎节部位进行萃取；故本案发明人提供一种兰花生长点萃取技术，以获得活性成份含量高且生物效果佳的兰花芽胚萃取物。
13.于是，本发明的一目的在于提供一种兰花芽胚组织的萃取产物，主要撷取并收集兰花具有高活性成份的芽胚再生细胞进行萃取作业，所制成的萃取物的活性成分含量高，而具有促进细胞排毒、能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促进atp生成、维持端粒作用、及保护修复受uvb造成的光伤害的功效，并可添加于化妆品或保养品中。
14.本发明的再一目的在于提供一种兰花芽胚组织的萃取产物，其萃取过程在非高温下操作，以减少温度所造成的热损失，也可避免低沸点与有效物质挥发及保有生长点组织的生长活性成分。
15.本发明的再一目的在于提供一种含兰花芽胚组织的萃取产物的复合微晶囊体，其可保护兰花芽胚组织的萃取产物，使兰花芽胚组织的萃取产物不变质且保有长时间安定性进而维持生物活性。
16.本发明的又一目的在于提供一种含兰花芽胚组织的萃取产物的复合微晶囊体，其具有高经皮穿透能力以有效地输送兰花芽胚组织的萃取产物至皮内。
17.是以，本发明提出一种兰花芽胚复合微晶囊体组合物，包括：载体，为形成为壳状结构；以及兰花芽胚萃取物，为镶嵌在壳状结构或被壳状结构包覆，而兰花芽胚萃取物的制备方法包含以下步骤：自兰花的顶芽或侧芽撷取生长点芽胚组织；去除生长点芽胚组织的壁膜；低温研磨生长点芽胚组织成粉末；将粉末以水或乙醇覆盖浸泡以得到混合液；在低温下利用超声波振荡萃取设备以总能量300至600w对混合液震荡；对混合液离心以取得上清液；以及去除上清液的溶剂以取得兰花芽胚萃取物。
18.本发明的微晶囊体组合物中的兰花芽胚萃取物为在非高温流程下进行制备的，可避免低沸点与有效物质挥发及保持芽胚组织的生长活性，且所制成的萃取物的总多酚及总黄酮含量高，添加在化妆品或保养品产品中，具有促进细胞排毒、能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促进atp生成、维持端粒作用、及保护修复受uvb造成的光伤害的功效。然而，本发明透过载体形成的壳状结构保护兰花芽胚萃取物，而可提供兰花芽胚萃取物长时间安定性不变质，进而无损于促进细胞排毒、能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促进atp生成、维持端粒作用、及保护修复受uvb造成的光伤害的功效。如此一来，本发明的微晶囊体组合物可制作成促进皮肤细胞排毒与皮肤细胞能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促进atp生成、维持端粒作用、及保护修复受uvb造成的光伤害的组合物，而组合物型态可为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品，但不限于此。
附图说明
19.图1为照片图，以说明兰花芽胚萃取物在不同环境温度下置放不同天数后的外观变化。
20.图2为自由基清除实验统计图，以说明兰花芽胚萃取物在不同环境温度下置放不同天数后的相对自由基清除活性。
21.图3为穿透式电子显微镜照片图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物的外观。
22.图4为高效能液相层析统计图，以说明兰花芽胚萃取物与兰花芽胚复合微晶囊体组合物的兰花芽胚萃取物在水中的稳定度。
23.图5为自噬实验结果图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物对皮肤细胞的自噬作用。
24.图6为ros活性氧化物实验结果图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物对皮肤细胞ros活性氧化物诱发的抑制。
25.图7为atp含量实验结果图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物对皮肤细胞atp含量的促进。
26.图8为sa-β-gal实验结果图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物对皮肤细胞衰老的推迟。
27.图9为pcr电泳照片图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物对sirt-1基因表现的影响。
28.图10为qpcr实验结果图，以说明兰花芽胚复合微晶囊体组合物对mtor、top1、与tpp1等基因表现的影响。
具体实施方式
29.为让本发明上述及/或其他目的、功效、特征更明显易懂，下文特举较佳实施方式，作详细说明如下：
30.本发明的一实施方式提出一种兰花芽胚复合微晶囊体组合物，而其包含：一载体以及一兰花芽胚萃取物。
31.载体为形成为壳状结构，而其实例可为氢化大豆卵磷脂或d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯，但不以此为限。在一较佳例中，载体包含氢化大豆卵磷脂以及d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯，且以载体总重量计，氢化大豆卵磷脂的重量百分比为50至99％，而d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯的重量百分比为1至50％。
32.兰花芽胚萃取物为镶嵌在壳状结构或被壳状结构包覆。在一较佳例中，以复合微晶囊体组合物总重量计，兰花芽胚萃取物的重量百分比为2％至10％。在另一较佳例中，以复合微晶囊体组合物的总体积计，兰花芽胚萃取物与载体的体积莫耳浓度合计为0.1至20mm。而兰花芽胚萃取物的制备方法详如下文所述：
33.首先，自兰花的顶芽或侧芽撷取生长点芽胚组织，而兰花的实例为蝴蝶兰，但不以此为限。
34.其次，去除生长点芽胚组织的壁膜。于一较佳例中，将生长点芽胚组织以液态氮急速冷冻以去除壁膜。
35.然后，低温研磨生长点芽胚组织成粉末。在一较佳例中，先将去除壁膜的生长点芽胚组织切成块，再加入液态氮使组织块凝固，最后将组织块研磨成粉末。为避免研磨工具或研磨过程产生的温度影响后续所得的活性成分，可将研磨工具(如：组织研磨钵与组织研磨器)预置于-80℃中冷却。
36.继之，将粉末以水或乙醇覆盖浸泡以得到混合液。在一较佳例中，粉末与水或乙醇的重量比为1：1至1：10，较佳地为1：5。
37.然后，在低温下利用超声波振荡萃取设备以总能量300至600w对混合液震荡。此步骤透过震荡使水或乙醇自生长点芽胚组织萃取出有效成份至溶剂内。在一较佳例中，震荡时间为60分钟。在另一较佳例中，每震荡3分钟，休息2分钟，直到总震荡时间达60分钟(共震荡20次)。在又一较佳例中，震荡温度为50至60℃。
38.最后，对混合液离心以取得上清液，并去除上清液的溶剂以取得兰花芽胚萃取物。在一较佳例中，于4℃下以15,000rpm转速对混合液离心15分钟以取得上清液。在另一较佳例中，对上清液抽真空过滤以制成萃取液后，利用减压浓缩机与冷冻干燥机将萃取液的溶剂去除，以取得兰花芽胚萃取物。
39.此外，本发明的另一实施方式提出一种兰花芽胚复合微晶囊体组合物的制备方
法，详如下文所述：
40.在根据上文取得兰花芽胚萃取物后，使兰花芽胚萃取物与载体原料混合，使载体原料分散形成胶体复合物。在一较佳例中，将载体原料溶解于溶剂中，利用旋转减压浓缩仪去除溶剂以形成脂质薄膜，之后加入兰花芽胚萃取物至脂质薄膜使脂质分散成胶体复合物。
41.接着，利用高功率超声波震荡器震荡胶体复合物，以获得兰花芽胚复合微晶囊体组合物。在一较佳例中，震荡时间为30分钟，震荡温度为45℃。
42.兹以下述实施例，例示说明以上实施方式：
43.＜实施例1：制备兰花芽胚萃取物及安定性试验＞
44.从兰花顶芽或侧芽，撷取生长点芽胚组织。其次，采用“急速液态氮冷冻超声波振荡法”，具体操作如下：将芽胚组织以液态氮急速冷冻去除壁膜，另将组织研磨钵与组织研磨器预置于-80℃中使其冷却；之后，利用刀械将去除壁膜的组织切成块放入研磨钵中，并加入少许液态氮使组织块凝固，再将其研磨成粉末；然后，将组织粉末置入超声波振荡萃取设备，并以纯水或乙醇将组织粉末覆盖浸泡；接着，在低温下以总能量300至600w对溶剂与粉末组成的混合液震荡60分钟(震荡3分钟，休息2分钟，直到震荡时间达60分钟)；在4℃下以15,000rpm转速离心15分钟后，收集上清液并抽真空过滤以制成萃取液。最后，利用减压浓缩机(rotary evaporator r-2000)与冷冻干燥机(eco nomic freeze dryer ct5020d)将萃取液的溶剂去除，以取得兰花芽胚萃取物(下文可与符号“og”交换使用)。
45.为了解兰花芽胚萃取物安定性，将其分别置在25℃或50℃下7天后观察外观并以色差计(met-cm6)测定色泽lab值。
46.如图1与表1所示，og置于25℃7天后外观与色泽lab值均无明显变化；反观，置于50℃、7天后外观变深，且l值自22.3减为20.1，a值自3.4增为4.7，b值自3.4变为4.2。
47.表1、og于不同环境温度下置于不同天数后的外观变化
[0048][0049]
dpph
·
(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)为稳定自由基，利用紫色的dpph乙醇溶液于波长517nm照射下产生特定吸光值。若dpph
·
自由基与样品反应，吸光值则会降低；故，可由吸光值的变化了解样品清除dpph
·
自由基的能力。具体而言，吸光值越低，表示样品清除dpph
·
自由基的能力越强。
[0050]
于此，在og置于50℃前与7天后分别配置成不同浓度，并分别加入90μl新鲜配置的
100μm dpph
·
乙醇溶液于96孔盘中反应。接着，以酵素免疫分析仪检测反应液的517nm吸光值。
[0051]
如图2所示，og在置于50℃前的自由基清除能力为82.3％；经置于50℃7天后自由基清除能力为73.7％。
[0052]
＜实施例2：制备兰花芽胚复合微晶囊体组合物及相关试验＞
[0053]
d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯(d-alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000succinate，tpgs)为维生素e衍生物，为安全的且与有效活性成分之间具有优异的口服生物兼容性。目前应用tpgs在微脂粒的药物传递系统以增加微脂粒稳定性。过往研究以tpgs形成微胞作为抗癌药物载体。过往研究也有添加tpgs在高分子载体中作为抗癌药物控制释放的载体(cao&feng，2008)。因此，tpgs对于本实施例的微晶囊体组合物而言为优异的功效性辅剂，且本身也具有抗老化及抗氧化活性。
[0054]
具体而言，本实施例以氢化大豆卵磷脂(hydrogenated soybean lecithin，hl)与d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯制备兰花芽胚复合微晶囊体组合物，详细过程如下：依实验设计比例将hl与tpgs添加至溶剂中溶解(以hl与tpgs总体计，hl重量百分比为50至99％，tpgs则为1至50％)，并利用旋转减压浓缩仪去除溶剂，以在烧瓶壁上形成脂质薄膜；之后，加入og与薄膜进行交互作用，使脂质分散而形成胶体复合物；最后，在45℃下利用高功率超声波震荡器震荡胶体复合物30分钟，即获得兰花芽胚复合微晶囊体组合物(下文可与符号“og-l”交换使用)且其体积莫耳浓度为0.1至20mm。
[0055]
借由穿透式电子显微镜(transmission electron microscope，tem)观察og-l的粒子结构型态，观察前利用微脂粒分散液滴附og-l在聚乙烯醇缩甲醛支撑膜(formvar film)上的镀碳铜网上，并静置2分钟使样品粒子嵌于铜网上，再利用拭净纸擦拭去除多余的样品；再滴加0.5wt％醋酸双氧铀在铜网上进行样品染色，并静置2分钟利用拭净擦拭去除多余染剂，并存放在干燥箱12小时后，再利用穿透式电子显微镜观察og-l的形态结构。
[0056]
如图3所示，og-l形成粒径介于50至400nm的胶体粒子复合物。
[0057]
使用动态光散射粒径及界面电位分析仪(dynamic light scattering，dls，型号brookhaven 90plus particle size analyzer，购自brookhaven inc.，u.s.a)量测og-l粒径与界面电位。分析结果为：og-l的平均粒径(average particle size，a.p.s.)为286.13
±
10.17nm，分布系数(polydispersity index，pd.i)为0.217
±
0.01，平均界面电位(average zeta potential，a.z.p.)为-7.13
±
4.51mv，og结合比例(combined percentage，c.p.)为94.31
±
3.76％(og-l中的og浓度比例)。
[0058]
利用高效能液相层析仪(high performance liquid chromatography，hplc)进行og定量分析，使用的帮浦型号为l-7100，自动注射器型号为l-7200，紫外光侦测器(uv-vis)型号为l-4200，皆购自hitachi(japan)，使用的管柱型号为microsorb-mv 100-5c18(250mm x 4.6mm i.d.，5μm颗粒尺寸)。
[0059]
如图4所示，说明og水溶液及og-l水溶液中的og活性成分浓度随着时间而变化；可看出，og-l中的og相较于纯og于水中稳定且易储存。换言之，og-l可改善og于水中活性不稳定的问题。
[0060]
＜实施例3：皮肤细胞自噬作用试验＞
[0061]
细胞自噬作用为将老化的胞器或蛋白质聚集体包覆并送至溶体分解为小分子。细
胞如无法对抗氧化压力造成的伤害时，便会呈现老化状态。
[0062]
将人类皮肤角质株化细胞hacat依密度1.5x105cell/ml培养于96孔盘，并在37℃与5％二氧化碳培养箱中生长24小时以上。之后，添加og-l反应，并在达反应时间后，移除上清液并以pbs清洗。接着，经过20mj/cm
2 uvb照射后，加入含0.1mm过氧化氢的新鲜培养液作用1小时。然后，加入autophagosome detection reagent working solution并置于培养箱反应15分钟至1小时后，使用wash buffer清洗细胞3至4次。最后，加入定量pbs，并以激发光360nm与发射光520nm测吸光值(biotek，synergy
tm
2，usa)。
[0063]
如图5所示，仅在氧化诱导剂(uvb与过氧化氢)作用下，可诱导人类皮肤角质株化细胞hacat的自噬作用，但在氧化诱导剂搭配og-l作用下则可提升自噬作用能力，以增加细胞抗氧化压力的能力与提升细胞排毒能力。综上所述，og-l可促进皮肤细胞的自噬作用以对抗氧化压力。
[0064]
＜实施例4：细胞活性氧化物含量试验＞
[0065]
为评估og-l是否降低过氧化氢诱导皮肤细胞所产生的ros活性氧化物，以荧光标记dcfh2da(2’,7
’-
dichlorofluorescin diacetate)定量分析活性氧化物含量，详细过程如下：
[0066]
将人类皮肤角质株化细胞hacat依密度1.5x105cell/ml培养在96孔盘中，并在37℃与5％二氧化碳培养箱中生长24小时以上。之后，添加og-l反应，并在达反应时间后，移除上清液并以pbs清洗。接着，先加入含0.1mm过氧化氢的新鲜培养液作用1小时，再移除培养液，后加入含10μm dcfh2da的新鲜培养液在避光下作用一小时后，再移除培养液。最后，加入定量pbs，并以激发光502nm与发射光524nm测吸光值(biotek，synergy
tm
2，usa)。
[0067]
如图6所示，未经过氧化氢作用下，细胞ros活性氧化物含量设定为基准100.0
±
3.1％；而仅受过氧化氢作用下，细胞ros活性氧化物的相对含量为121.0
±
6.1％；而受过氧化氢搭配og-l作用下，细胞ros活性氧化物的相对含量为113.0
±
4.2％。这表示说，og-l可保护细胞免受到66.3％氧化伤害的功效。综上所述，细胞经og-l作用后能降低经过氧化氢氧化诱导剂诱发的氧化伤害，进而保护细胞免受氧化压力造成的伤害。
[0068]
＜实施例5：三磷酸腺苷活化试验＞
[0069]
atp为核苷酸的一种，作为细胞能量传递的“分子通货”，储存与传递化学能，因此atp是生命活动能量的直接来源，人体所需的能量几乎来自atp，例如：心脏跳动、肌肉运动、及不同细胞执行不同生物功能。反之，缺乏atp人体各器官组织便相继罢工，而出现心脏衰竭、肌肉酸痛、或容易疲劳等生理现象。
[0070]
人类皮肤角质株化细胞hacat依密度1.5x105cell/ml培养在24孔盘，并在37℃与5％二氧化碳培养箱中生长24小时以上。之后，加入og-l作用24小时后，置入培养箱再作用24小时。达反应时间后，先移除培养液及样品，再加入pbs清洗，后换上新的培养液。接着，加入lysis buffer作用30分钟后，以1,500rpm离心2分钟，之后取50μl上清液至白色96孔盘，并使用atp determination kit(molecular probes，eugene，or，usa)测定吸光值(biotek，synergy
t
m2，usa)，评估细胞内atp含量(μmol/g-cell)。
[0071]
如图7所示，经过og-l作用后，细胞atp含量高于未加入og-l的细胞(控制组)。
[0072]
＜实施例6：抗醣化试验＞
[0073]
衰老为人体不可逆的现象，当细胞分裂多代后可能受外界过度刺激而导致生长停
滞进而衰老。senescence-associatedβ-galactosidase(sa-β-gal)会在衰老细胞中会过度表达，而可作为细胞衰老的指标之一。
[0074]
将人类皮肤角质株化细胞hacat依密度1.5x105cell/ml培养在24孔盘，并经24小时细胞贴附后，移除培养液。加入og-l预处理24小时后，先使用50mj/cm
2 uvb照射细胞，再加入不含血清的培养液培养24小时。达反应时间后，用senescenceβ-galactosidase staining kit(cell signaling technology，danvers，ma，usa)染色，之后利用显微镜观察并计数蓝色的老化细胞。
[0075]
如图8所示，显示经uvb照射后，细胞的β-galactosidase大幅增加；而经uvb照射与og-l作用后，细胞能降低uvb造成的β-galactosidase活化。此外，正控制组25μg/ml维他命c可有效抑制β-galactosidase活性，特别是uvb造成的β-galactosidase活化。
[0076]
＜实施例7：长寿基因sirt-1表现试验＞
[0077]
衰老虽然为人体不可逆的现象，但部分基因的活化可维持细胞机能，促进个体健康，而这些基因称为“长寿基因”，sirt-1为典型代表例之一。以往的研究证实，向上调节sirt-1的表现可有效保护细胞修护并维持正常功能，免于细胞走向衰老而引起疾病。
[0078]
利用反转录聚合酶连锁反应(reverse transcription-pcr，rt-pcr)进行试验，分析og-l调控长寿基因sirt-1的表现。
[0079]
将人类皮肤角质株化细胞hacat依密度1.5x105cell/ml培养在24孔盘，并经24小时细胞贴附后，移除培养液。接着，加入og-l预处理24小时，再使用50mj/cm
2 uvb照射细胞，后加入不含血清的培养液再培养24小时。之后，移除培养液后，以trypsin取下细胞，并以pbs收集细胞并离心移除上清液。然后，加入1ml rezol
tm
c&t并于室温均匀混合5分钟溶解细胞。加入200μl氯仿均匀混合15秒后，置于4℃反应5分钟萃取出rna。然后，于4℃下以转速12,000rpm离心10分钟后，取上层透明层至浸泡过depc水并灭菌过的微量离心管中。之后，加入等体积的异丙醇混合均匀并在4℃静置5分钟使rna沉淀。再在4℃下以转速12,000rpm离心10分钟并去除上清液。加入200μl75％冰酒精清洗rna后，在4℃下以转速12,000rpm离心10分钟，并去除上清液。最后，在无菌操作台中倒置阴干，使离心管中剩余的水气完全挥发，并加入100μl 0.1％depc水分散溶解rna，并储存于-80℃。此外，取2μl rna至198μl 0.1％depc水中后，混合均匀取100μl在微量石英管中，以分光亮度计测od260nm与od280nm的吸光值(biotek，synergy
tm
2，usa)。
[0080]
取3μg rna与适量depc水混合后，加入1μl oligo(dt)
18
primer置于70℃作用2分钟并迅速移至冰上。接着，分别加入4μl 10xmmlv rt buffer solution、1μl dntp mixture(每种dntp 10mm)、0.5μl recombinant rnase inhibitor(1unit/ml)、1μl mmlv reverse transcriptase(5unit)，使总体积为20μl。将混合液均匀混合后，于42℃下作用1小时，再在94℃加热5分钟，去除mmlv reverse transcriptase活性终止反应，完成cdna模板制备。最后，加入80μl depc水，并保存在-20℃备用。
[0081]
取1μl cdna至微量离心管中，并加入5μl 10x reaction buffer、0.8μl 10mm dntp(每种dntp 200mm)与各1μl的50mm正向引子(5
’-
tcgcaactatacccagaacatagaca-3’)与反向引子(5
’-
ctgttgcaaaggaaccatgaca-3’)、taq dna polymerase(5unit/μl)，最后加入去离子水使总体积达50μl。混合均匀后，置于自动温度循环机(techne progene)进行pcr反应，反应条件如下：变性反应(denaturation)，98℃，3分钟；接着，包含变性反应，94℃、黏合
反应，60℃、合成反应，72，且各1分钟的聚合酶链反应，聚合酶链反应共进行35个循环。反应完毕后，取适量反应产物进行2％琼脂凝胶电泳分析参照基因(β-actin)和目标基因。此外，利用影像软件(image j)进行定量。
[0082]
如图9所示，未经过uvb伤害下，sirt-1表现量定为1.0(控制组)，而经uvb照射后，其表现量明显降低至0.2。另外经uvb照射与og-l作用后，则可明显提升sirt-1的表现量至0.6，表示og-l可有效调控保护皮肤细胞免于uv对长寿基因sirt-1的伤害。
[0083]
＜实施例8：细胞回春基因mtor与端粒酶调控基因tert表现试验＞
[0084]
mtor是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，为造成老化与癌化的重要因子，其会促进细胞吸收热量、关闭自噬机制进而阻止细胞更新，故近年来有针对抑制mtor表现相关研究指出透过抑制老化细胞中mtor的表现可使细胞新生。
[0085]
端粒作用为维持真核生物染色体完整性与控制细胞分裂周期，并于细胞分裂后，端粒会稳定所复制的dna，确保遗传序列完整性。然而，细胞每次分裂后，端粒便会缩短；当端粒消耗殆尽时，细胞便启动凋亡，故视端粒为老化的最佳标记。端粒酶可补充端粒，延长细胞分裂次数，减缓老化速度。top1与tpp1为端粒保护蛋白，促进其表现可提升对端粒体的保护。
[0086]
于此，利用实时定量pcr(qpcr)进行试验，分析og-l调控回春基因mtor与端粒酶调控基因tert相关基因的表现。
[0087]
将人类皮肤角质株化细胞hacat依密度1.5x105cell/ml培养于6孔盘，并经24小时培养后，加入og-l混合无血清培养液作用72小时。之后，移除培养液后，以trypsin取下细胞，并以pbs收集细胞并离心移除上清液。然后，加入1ml rezol
tm
c&t并于室温均匀混合5分钟溶解细胞。加入200μl氯仿均匀混合15秒后，置于4℃反应5分钟萃取出rna。然后，在4℃下以转速12,000rpm离心10分钟后，取上层透明层至浸泡过depc水并灭菌过的微量离心管中。之后，加入等体积的异丙醇混合均匀并于4℃静置5分钟使rna沉淀。再在4℃下以转速12,000rpm离心10分钟并去除上清液。加入200μl 75％冰酒精清洗rna后，在4℃下以转速12,000rpm离心10分钟，并去除上清液。最后，在无菌操作台中倒置阴干，使离心管中剩余的水气完全挥发，并加入100μl 0.1％depc水分散溶解rna，并储存于-80℃。此外，取2μl rna至198μl 0.1％depc水中后，混合均匀取100μl在微量石英管中，以分光亮度计测od260nm与od280nm的吸光值(biotek，synergy
tm
2，usa)。
[0088]
取3μg rna与适量depc水混合后，加入1μl oligo(dt)
18
primer置于70℃作用2分钟并迅速移至冰上。接着，分别加入4μl 10x mmlv rt buffer solution、1μl dntp mixture(每种dntp 10mm)、0.5μl recombinant rnase inhibitor(1unit/ml)、1μl mmlv reverse transcr iptase(5unit)，使总体积为20μl。将混合液均匀混合后，在42℃下作用1小时，再在94℃加热5分钟，去除mmlv reverse transcriptase活性终止反应，完成cdna模板制备。最后，加入80μl depc水，并保存在-20℃备用。
[0089]
取10μl cdna至微量离心管中，并加入omicsgreen 5x qpcr mastermix(rox)(omics bio)及各5μl的50mm正向引子与反向引子均匀混合进行qpcr分析。置于qpcr机器(mygo pro)进行实时定量pcr反应，反应条件如下：变性反应(denaturation)，98℃，3分钟；继之，包含变性反应94℃、黏合反应(annealing)，60℃、合成反应(extension)，72℃各1分钟的聚合酶链反应，聚合酶链反应共进行25至35个循环。数据使用2-δδct
表达来计算基因的
相对表现量值。
[0090]
如图10所示，og-l会向下调节mtor基因表现而向上调节top1及tpp1等端粒保护蛋白的基因表现，表示og-l具有抗老化的潜力。
[0091]
惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施之范围；故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作之简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明专利涵盖之范围内。