一种抑制真菌生长的药物的制作方法

本发明属于抗菌药物领域。

背景技术：

白念珠菌属人体常居真菌，为条件致病真菌，一般以酶母形态存在于机体，当机体免疫功能受到抑制或微生态失衡时，白念珠菌会转变其生长形态，可由酵母相转为菌丝形态，进而对机体产生危害引起急性、亚急性或者慢性感染，主要包括皮肤念珠菌病，粘膜念珠菌病与内脏及中枢神经念珠菌病。皮肤念珠菌病主要侵犯腋窝、腹股沟等位置，引起皮肤潮红、发亮。粘膜念珠菌病主要引起鹅口疮和阴道炎。内脏及中枢神经念珠菌病主要是粘膜皮肤等处病菌散播引起的肺炎、心内膜炎等，偶尔也可发生败血症。

目前白色念珠菌感染的治疗药物主要有多烯类(两性霉素b)、三唑(氟康唑，伊曲康唑，伏立康唑)和棘白菌素类(卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净)。两性霉素b体内代谢消除缓慢，可产生肾毒性。三唑类药物消化系统不良反应明显，可引起厌食、恶心、呕吐等胃肠道反应，且具有一定的妊娠毒性。棘白菌素类抗菌效果好，生物毒性低但价格昂贵。

抗菌肽，泛指天然的或人工合成的具有抗菌活性的多肽，通常一种抗菌肽具有对多种细菌、真菌的抑制能力。唾液富组蛋白是一族存在于灵长类动物腮腺和頜下腺分泌物中富含组氨酸的小分子、阳离子多肽，其中唾液富组蛋白5具有抗白色念珠菌的作用。唾液富组蛋白5虽然不会产生传统抗真菌药物的副作用，但其抗菌作用有限，因此并未广泛应用。

dna四面体(tdns)是一类由dna单链分子通过碱基互补配对自组装形成的四面体结构，也被称为四面体框架核酸(tfna)，可作为核酸类物质的载体，帮助外源核酸进入细胞。dna四面体制备方法简单，只需将特定dna单链通过加热变性，再降温复性，即可得到；dna四面体还具有十分良好的生物相容性。

目前尚未见dna四面体结合抗菌肽类物质形成具有抗菌活性的复合物的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是：提供一种新的抑制真菌生长的药物。

本发明的技术方案如下：

一种抗菌药物，所述药物是由dna四面体与抗菌肽的复合物。

如前述的药物，所述dna四面体是由序列如seqidno.1～4所述的单链dna通过碱基互补配对自组装形成的四面体结构。

如前述的药物，所述抗菌肽是唾液富组蛋白5。

如前述的药物，所述dna四面体和抗菌肽的摩尔比为50:1～200:1，优选的，为50:1～100:1；进一步优选的，为100:1。

dna四面体与抗菌肽孵育得到的复合物在制备抗菌药物的用途。

如前述的用途，所述抗菌药物是指抗真菌药物。

如前述的用途，所述真菌为念珠菌；优选的，为白色念珠菌。

如前述的用途，所述dna四面体是由序列如seqidno.1～4所述的单链dna通过碱基互补配对自组装形成的四面体结构。

如前述的用途，所述抗菌肽是唾液富组蛋白5。

如前述的用途，所述所述dna四面体和抗菌肽的摩尔比为50:1～200:1，优选的，为50:1～100:1；进一步优选的，为100:1。

本发明的药物，是首个将dna四面体与抗菌肽结合在一起的复合物，相比单独的his-5更容易被白色念珠菌摄入，且相比单独的his-5更能加快白色念珠菌的钾离子外流，提高菌体内活性氧水平，抑制由酵母形态向菌丝形态转化，抑制白色念珠菌生长，降低其致病性，总体上产生比his-5更强大的抑菌作用，有望应用于临床，前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：徕卡dm1000显微镜下白色念珠菌形态观察。

图2：扫描电镜下白色念珠菌形态观察。

图3：白色念珠菌与200nmtdns、20μmhis-5和200nmtdns/his-5复合物孵育2小时的共聚焦图像。

具体实施方式

实施例1本发明抑制白色念珠菌的药物的合成

1.合成方法

1.1合成dna四面体

等摩尔浓度的四条单链dna(s1、s2、s3和s4)在tm缓冲液中(10mmtrishcl，50mmmgcl2·6h2o，ph8.0)中混和，离心。再将混合物放入pcr仪中加热至95℃保持10分钟，然后迅速冷却至4℃保持20分钟。用磷酸盐缓冲盐(pbs)超滤(10kda)。

单链dna的序列如下：

s1(seqidno.1):

atttatcacccgccatagtagacgtatcaccaggcagttgagacgaacattcctaagtctgaa

s2(seqidno.2):

acatgcgagggtccaataccgacgattacagcttgctacacgattcagacttaggaatgttcg

s3(seqidno.3):

actactatggcgggtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatcc

s4(seqidno.4):

acggtattggaccctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccg

1.2与抗菌肽唾液富组蛋白5孵育

将溶解在蒸馏水中的唾液富组蛋白5(histatin5，简称：his-5)进行混合，室温下孵育30分钟。之后再将混合物进行超滤以除去未反应的化合物。

his-5的序列(seqidno.5)如下：

dshakrhhgykrkfhekhhshrgy

2.鉴定

8％page实验：随着his-5和dna四面体混合比例的提高，电泳条带位置会发生变化。在200:1的比例下合成，由于电性中和，电泳条带消失，显示组氨酸与dna四面体饱和结合。

zeta电位显示：随着his-5和dna四面体混合比例的提高，his-5和dna四面体复合物(tdns/his-5复合物)电性向正电性方向变化。在200:1的比例下合成，复合物显示为正电性，和page实验相互印证，显示饱和结合。

粒径检测显示：随着his-5和dna四面体混合比例的提高，复合物粒径逐渐增大，显示his-5结合到dna四面体。

合成复合物的his-5和tdns的比例范围在50:1～200:1，均能成功合成；其中，比例在50：1～100:1时，合成效率较高。

以下将用实验例的形式对本发明的有益效果作进一步说明。实验例中合成tdns/his-5复合物的tdns均使用实施例1的方法制备得到。

实验例1复合物抑制白色念珠菌生长实验

方法：使用指数生长相的白色念珠菌(od600＝0.6，sc5314)，用pbs洗涤两次，稀释至10⁷cfu/ml，然后以5×10⁵cfu/ml的初始密度接种菌株，在ypd培养基的96孔板中用200nm的dna四面体(tdns)、20μm的his-5和200nm的tdns/his-5复合物(200nm的tdns和20μm的his-5)处理。ypd培养基单独接种白色念珠菌作为阳性对照，tdns/his-5复合物非细菌培养基作为阴性对照。在37℃下，用自动分光光度计测量真菌生长，24小时内自动检测600nm处的光密度，每小时检测一次od600nm值，抗菌率计算公式为：抗菌率(％)＝(阳性对照od600nm-实验组od600nm)/(阳性对照od600nm-阴性对照od600nm)×100％。

结果：tdns/his-5复合物比tdns和his-5具有更显著的抗菌作用，而tdns对白色念珠菌生长的影响不明显；在对数生长期，真菌生长明显受到抑制。抗菌率结果表明，tdns/his-5组(0.46，95％ci:0.40-0.53)与tdns组(0.068，95％ci:0.017-0.15)和his-5组(0.23，95％ci:0.133-0.341)相比，明显提高了抗菌率。同样，tdns/his-5复合物组的菌落数也较其他组减少。对照组共观察到493±79cfus，菌落数由407±83cfus(tdns组)和338±69(his-5组)减少到228±75cfus(tdns/his-5组)。实验组和对照组之间存在显著差异。

结论：tdns/his-5复合物抑菌能力强，抑菌率为his-5的2倍。

实验例2复合物抑制白色念珠菌形体转变实验

方法：将菌株在rpmi-1640培养基中培养，并在12孔板中稀释至10⁶cfu/ml的浓度。在37℃下，用200nmtdns、20μmhis-5或200nmtdns/his-5复合物处理细菌悬液2h，用pbs冲洗细胞两次，4℃下用4％多聚甲醛固定过夜，固定后用乙醇梯度脱水。标本在徕卡dm1000显微镜和扫描电子显微镜下观察真菌形态。

结果：对照组和tdns组的亮场图像显示大量菌丝。相比之下，经his-5处理的样品中，酵母形态较多，呈萎缩状态；菌丝形态较少，菌丝分枝常形成束。而在tdns/his-5复合物作用下，只检测到少量菌丝和酵母相细胞，说明tdns/his-5对白色念珠菌菌丝生长有抑制作用(图1)。此外，扫描电镜观察显示白色念珠菌的形成更为详细(图2)。与对照组和tdns组正常菌丝形成相比较，his-5组菌丝形成时细胞膜溶解。tnds/his-5组中可见酵母细胞溶胀，白色念珠菌由酵母形态向菌丝形态转化过程收到明显的抑制作用。

结论：tdns/his-5复合物可抑制白色念珠菌由酵母形态向菌丝形态转化，进而抑制其对机体的危害。

实验例3白色念珠菌摄取复合物的定性分析

方法：用cyanine-5(cy-5)标记的tdns和fam标记的his-5作为荧光标记物。将白色念珠菌在ypd培养基中96孔板中培养，稀释至10⁶cfu/ml的密度。另外，将200nmcy5-tdns、20μmfam-his-5和200nmcy5-tdns/fam-his-5分别加入不同的孔中，在37℃下培养2小时。反应结束后，用pbs冲洗细胞三次，然后用hoechst染色30分钟，悬浮液重新灰化并悬浮在pbs中。将10微升的样品加入一张载玻片中，并覆盖一张盖玻片，使用共聚焦显微镜进行观察。

结果：白色念珠菌与200nmtdns、20μmhis-5和200nmtdns/his-5复合物孵育2小时的共焦图像如图3所示。与tdns和his-5组相比，tdns/his-5复合物组的cy5和fam的荧光信号更强，表明菌体对tdns/his-5复合物的摄入量更大。此外，cy5发出的红色荧光与fam发出的绿色荧光之间的空间重叠，推测了tdns与组氨酸蛋白5的共缩合反应，揭示了tdns/his-5配合物的稳定合成。

结论：tdns/his-5复合物相比单独的tdns或his-5，更容易被白色念珠菌摄入，说明tdns可以有效突破真菌细胞壁进入真菌内。

实验例4白色念珠菌摄取tdns/his-5的定量分析

方法：将多组白念珠菌(1×10⁶cfu/ml)分别用cy5-tdns(200nm)、his-5(20μm)和cy5-tdns/his-5(200nm)在生化培养箱中培养3h或6h，取标本用pbs冲洗3次。样品以10⁶cfu/ml的浓度在流动管中在pbs中再悬浮。制备的样品用流式细胞仪进行检测。

结果：流式细胞结果表明，与his-5组(52％，95％ci:44.1％-59.8％)相比，tdns/his-5复合物组(81.2％，95％ci:69.4％-92.9％)在孵育3小时后摄取更多。暴露6h后，虽然两组的摄取率没有明显差异，但tdns/his-5组(13.0，95％ci:11.05-14.94)的荧光强度强于his-5组(7.81，95％ci:6.05-9.58)。

结论：定量分析结果进一步证明，tdns/his-5复合物相比单独的his-5，更容易被白色念珠菌摄入。

实验例5细胞内活性氧水平的测定

方法：将密度为10⁵cfu/ml的白色念珠菌一半在ypd培养基中培养以保持酵母样形态，另一半在rp培养基中培养以形成菌丝。24小时后，用cy5-tdns(200nm)、his-5(20μm)和cy5-tdns/his-5(200nm)孵育3小时，然后用pbs冲洗3次，用hoechst染色30分钟，再用pbs再次冲洗，用dcfh-da孵育25分钟。最后使用共聚焦显微镜观察免疫荧光图像。

结果：结果显示，与tdns组和his-5组相比，tdns/his-5组的细胞内活性氧的产生明显增加(图3)，tdns组与对照组比较无显著性差异。

结论：活性氧对细胞有害，而tdns/his-5复合物相比his-5，可以增加白色念珠菌内活性氧水平，表明tdns/his-5复合物抗白色念珠菌的能力强于his-5。

实验例6白色念珠菌钾外流的测定

方法：将白色念珠菌在ypd培养基中孵育过夜后，以10⁶cfu/ml的浓度在pbs中漂洗和悬浮。将细胞与cy5-tdns(200nm)、his-5(20μm)和cy5-tdns/his-5(200nm)在37℃下孵育4h。孵育后，离心试管，收集上清液，并用双蒸水按1:2的比例稀释以供测试。上清液通过原子吸收光谱法测定钾浓度。

结果：细胞与tdns/his-5共孵育后，tdns/his-5组细胞外培养液(44.45,95％ci:43.38-45.51)中的钾浓度较其他组明显升高。tdns组(40.76,95％ci:40.16-41.35)和his-5组(41.503,95％ci:40.47-42.53)细胞外钾水平较对照组(37.10,95％ci:34.80-39.40)明显升高。

结论：钾离子外流对白色念珠菌有害，而tdns/his-5加快白色念珠菌的钾离子外流，效果强于单独使用his-5。表明tdns/his-5比his-5具有更强的抑制白色念珠菌的作用。

综上，本发明的tdns/his-5复合物，相比his-5更容易被白色念珠菌摄入，且相比his-5更能加快白色念珠菌的钾离子外流，提高菌体内活性氧水平，抑制由酵母形态向菌丝形态转化，抑制白色念珠菌生长，因而比his-5具有更强大的抑菌作用。

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<110>四川大学

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