一种基于聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒的制备及应用的制作方法

本发明属于癌细胞治疗剂制备领域，特别涉及一种基于聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒的制备及应用。

背景技术：

肿瘤是危害人类生命健康的第一大杀手，近年来肿瘤呈明显上升的趋势，死亡率及其高。根据最近的调查，已经证明癌症治疗基于单一的方法是不够的和低效的。发展协同治疗方式是具有吸引力的，已经吸引人们巨大的关注。与单一治疗相比，组合疗法能减少耐药性，协同抑制癌症的发展，从而提高对癌症的疗效。纳米载体的穿透深度的提高有利于通过将材料深入肿瘤内部而提高治疗效果。这可以通过各种刺激（如酸h2o2、酶和近红外光）诱导的策略来实现。在此基础上，构建具有上述所有能力的纳米载体具有巨大的潜力，开发毒副作用小且具有良好癌症治疗效果的方法具有迫切的临床需求和重大的现实意义。

相比于化疗、放疗等传统治疗手段，光热疗法（photothermaltherapy，ptt）已经成为新颖、快速发展的癌症治疗方法，光疗加热可以增强细胞膜的渗透性，其利用纳米粒子吸收光能转换成热能，提高局部温度促使细胞凋亡、破坏，从而杀死癌细胞。近红外光能较好的穿透深部组织，具有高度的特异性，因而对正常组织和细胞几乎不会产生伤害和副作用，与传统癌症治疗手段相比具有显著的优势。目前，已有多种光热转化剂被开发和研究，如基于金纳米材料的纳米载体，基于碳纳米材料的光热转化剂，基于金属硫化物的纳米载体，基于半导体的纳米载体，以及基于聚合物的纳米载体等。其中基于聚合物的纳米载体因其良好的特性而受到广泛的关注。这主要是因为聚合物纳米颗粒具有良好的生物相容性，具有潜在的临床应用价值。

在众多基于聚合物的光热转化剂中，聚吡咯（polypyrrole，ppy）纳米颗粒因其优良的光热稳定性和光热转化效率而成为一种极具潜力的光热治疗平台。聚吡咯纳米颗粒很好地克服了某些其它种类聚合物纳米颗粒光热转化效率较低，具有光漂白效应和需要复杂修饰才可应用于生物医学领域等限制因素。此外，聚吡咯纳米颗粒具有良好的尺寸可控性，并显示依赖尺寸的光热转化性能。这为开发聚吡咯纳米颗粒在纳米生物医学中的应用提供了更多可能性。

葡萄糖氧化酶（gox）是一种广泛存在于自然界中的需氧脱氢酶，其中微生物来源占绝大部分，主要为黑曲霉和青霉。由该催化反应过程消耗大量o2并可产生具有酸化性质的葡萄糖酸，gox被广泛应用于食品、纺织、医药等领域。本专利采用聚乙烯醇为稳定剂，制备聚吡咯纳米颗粒，随后分散于磷酸盐缓冲液中生长磷酸铁并负载葡萄糖氧化酶（gox），最后研究该复合纳米颗粒的体外性能。

检索国内外有关聚吡咯纳米颗粒用于癌症治疗方面的文献和专利结果发现：在本发明完成之前，还没有发现基于聚乙烯醇稳定的聚吡咯-磷酸铁-氧化酶复合纳米颗粒的制备及其在癌细胞光热-饥饿联合治疗方面的研究报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒的制备方法。该方法制备过程温和，简单易行，所得产物具有良好的光热转化效率、稳定性，以及良好的体外性能，具有潜在的癌细胞治疗应用前景。

本发明以聚乙烯醇为稳定剂制备得到的聚吡咯-磷酸铁-氧化酶复合纳米颗粒。本发明涉及了两个基本原理：

（1）利用氧化剂三氯化铁作为铁源，原位生长磷酸铁纳米颗粒。

（2）利用磷酸根和蛋白质的吸附作用，实现氧化酶的负载。

一种基于聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒的制备，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制聚乙烯醇水溶液，加热搅拌10min后再冷却10min，其中，聚乙烯醇水溶液浓度为40mg/ml；配制三氯化铁水溶液，随后将其加入到上述冷却后的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌反应1h；将上述反应溶液，在冰浴条件下，加入吡咯单体，氧化聚合4h，离心纯化后得到聚吡咯纳米颗粒ppy；

（2）配制磷酸盐缓冲液，随后将制备好的聚吡咯纳米颗粒ppy加入到其中，使用震荡器震荡反应4h，得到聚吡咯-磷酸铁复合纳米颗粒ppy-fepi溶液；

（3）将上述反应溶液，加入葡萄糖氧化酶gox水溶液，继续震荡反应12h，离心纯化后得到聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒ppy-fepi-gox；其中，葡萄糖氧化酶gox和聚吡咯-磷酸铁复合纳米颗粒ppy-fepi的质量比为0.5：1。

进一步，所述步骤（1）中聚乙烯醇的mw为9-10k，加入三氯化铁和吡咯单体后反应体系中聚乙烯醇的最终浓度为12mg/ml。

进一步，所述步骤（1）中所用的三氯化铁的浓度为90.2mg/ml。

进一步，所述步骤（2）中所用磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/l。

进一步，所述步骤（2）中所用聚吡咯溶液的终浓度是1mg/ml。

进一步，所述步骤（3）中聚吡咯-磷酸铁纳米颗粒ppy-fepi溶液的浓度为0.9-1.2mg/ml。

进一步，所述步骤（3）中所用葡萄糖氧化酶gox水溶液的浓度为10mg/ml。

进一步，所述的基于聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒在体内外癌细胞光热-饥饿联合治疗中具备应用潜力。

有益效果

（1）本发明的制备过程简便，易操作。

（2）本发明方法制备的聚吡咯-磷酸铁-氧化酶纳米颗粒具有良好的体外性能。

附图说明

图1为实施例1制备的ppy-fepi-gox复合纳米颗粒的明场（a）和暗场（b）tem图。

图2为实施例2制备的ppy（a）和ppy-fepi-gox（b）的水动力学粒径。

图3为实施例3中的ppy-fepi-gox复合纳米颗粒在不同浓度葡萄糖溶液中的产酸情况。

图4为实施例4中的ppy-fepi-gox复合纳米颗粒在不同浓度葡萄糖溶液中的产过氧化氢测试结果。

图5为实施例5中的ppy-fepi-gox复合纳米颗粒在不同过氧化氢浓度和不同缓冲液中的产生羟基自由基测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

取聚乙烯醇（poly(vinylalcohol)，pva）241.0mg溶于6.025ml水中，磁力加热搅拌10min使之充分混匀，冷却10min。加入fecl3·6h2o（90.2mg/ml）13.919ml搅拌反应1h。在冰浴的条件下，加入吡咯单体139.5μl，氧化聚合4h。离心纯化后所得聚吡咯纳米颗粒保存于4℃备用。

tem图表明聚吡咯纳米颗粒的尺寸和形貌。参照说明书附图1。tem图显示，聚吡咯纳米颗粒分散于磷酸盐缓冲液中生长出磷酸铁后负载葡萄糖氧化酶（图1a、图1b），可以看到大球上生长出小球状，说明磷酸铁的成功生长在聚吡咯纳米粒子上面。

实施例2

取聚吡咯（polypyrrole，ppy）40.0mg，溶于31ml超纯水中，加入磷酸盐缓冲液(0.1mol/l)4.0ml，使用震荡器震荡4h，充分混合。反应结束后，对所得溶液直接加入葡萄糖氧化酶溶液2ml(10mg/ml)，离心纯化后得到聚吡咯-磷酸铁-葡萄糖氧化酶（ppy-fepi-gox）纳米颗粒，4℃保存。

激光粒度仪（dls）测试结果显示了所得复合纳米颗粒的水动力学尺寸及均一程度。参照说明书附图2。图2a表明ppy纳米颗粒的平均尺寸为168.4±8.7nm，单分散度为0.203±0.042。图2b表明ppy-fepi-gox复合纳米颗粒的平均尺寸为232.1±21.8nm，单分散度为0.232±0.014。

实施例3

取实施例2制备的ppy-fepi-gox纳米颗粒0.5ml（3mg/ml），葡萄糖终反应浓度分别设定为50、100、200、400、600ppm。使用ph计测试其反应期间产生的酸强度，设定时间为0、0.5、1、2、3、4、5、6h。测试结果如图3所示，在此反应过程中gox消耗葡萄糖产生葡萄糖酸，溶液ph随着反应时间的延长而降低，且与葡萄糖浓度呈正相关。

实施例4

取实施例2制备的ppy-fepi-gox纳米颗粒0.107ml（14mg/ml），葡萄糖终反应浓度分别设定为0、50、100、200、400、600、800ppm。分别在0.5、1、2、4h取1ml离心，收集上清0.8ml加入过氧化氢探针草酸钛酸铵0.2ml（0.01m）测试其吸光度值。如图4所示，在此反应过程中gox消耗葡萄糖，可以显著的产生过氧化氢，是潜在的化学动力治疗底物。

实施例5

取实施例2制备的ppy-fepi-gox纳米颗粒，过氧化氢终浓度设定为0、0.05、1.0、2.0、4.0mm，缓冲液分成四组分别为4.0、5.0、6.0、7.4，同时加入检测羟基自由基的探针亚甲基蓝（methyleneblue，mb）。设定时间取样离心，收集上清，测试紫外，如图5所示，羟基自由基的产量与过氧化氢浓度呈正比，与溶液ph成反比。