一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法及其质量控制方法与流程

本发明属于中药配方颗粒
技术领域：
，具体的说，是一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法及其质量控制方法。
背景技术：
：竹叶石膏汤出自《伤寒论辨阴阳易差后劳复病阴受损则嘈杂。阴血不足经络肌肤失养则瘙痒,火热余脉证并治》第397条:“伤寒解后，虚羸少气，气逆欲吐，邪稽留局部则触之疼痛，体内余热未清则小便黄。本病竹叶石膏汤主之。”方由竹叶、石膏、半夏、麦门冬、人病机与竹叶石膏汤主治相符，故用竹叶石膏汤原方加黄参、甘草、粳米组成，具有清热生津、益气和胃之功效。传统竹叶石膏汤采用竹叶二把(10g)、石膏一斤(30g)、半夏半升(12g)、洗麦门冬一升(30g)、去心人参二两(6g)、甘草二两(6g)、炙粳米半生(15g或山药15g代替)的组方，煎服方法为：以水2000ml，煮取1200ml，去药渣，加入粳米再煮，至米熟汤成，去米。分三次温服，每次200ml。随着社会进步和人们生活节奏的加快，传统的煎煮方式存在的不便性和疗效上的不确定性越显突出，在很大程度上影响并制约了中药制剂在市场上的应用和推广，为最大限度的提高药效，降低毒副作用，满足中医临床要求，加强中药复方配方颗粒的质量控制是关键。付要等在“竹叶石膏汤中人参药材鉴别及含量测定”《食品安全质量检测学报》，2019年5月第10卷第9期，中记载了采用薄层色谱法和高效液相色谱法分别对竹叶石膏汤中的人参药味进行定性和定量的测定，测得人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1含量分别为0.25mg/g、0.21mg/g、0.22mg/g，重复性好，操作简单，可用于竹叶石膏汤的质量控制。实践过程中，我们发现，竹叶石膏汤配方颗粒中人参皂苷类成分含量极低，因此，在建立竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制中，检测到的人参皂苷类成分的含量极低，往往低于万分之3，准确性较差。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法，采用加热回流提取、浓缩、干燥、制粒的过程制得配方颗粒，制备过程中，通过合理控制加水量和煎煮时间，能有效提高收膏率和有效物质甘草苷、甘草酸以及总黄酮提取率，解决了现有传统煎煮方式疗效不稳定的技术问题。本发明的另一目的在于提供一种竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制方法，采用薄层色谱法或高效液相色谱法实现对竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制，薄层色谱法中，选择甘草次酸或麦冬为鉴别对象，高效液相色谱法中，选择甘草苷和甘草酸为检测对象，控制方法简单，能有效的控制所生产的竹叶石膏汤配方颗的质量，并应用于日常的质量控制过程中。本发明通过下述技术方案实现：一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法，包括以下步骤：a：按重量份数计，取淡竹叶6份、石膏50份、法半夏9份、麦冬20份、人参6份、炙甘草6份、粳米10份为原料，每次加入原料重量8～12倍的水，煎煮三次，每次煎煮0.5～1.5h，合并煎液，过滤后得提取液；b：将提取液浓缩至相对密度为1.05～1.08的清膏，加入糊精和二氧化硅，混合均匀后得浸膏；c：将浸膏干燥后，加入辅料，再经制粒、60℃以下干燥，制得竹叶石膏汤配方颗粒。所述步骤b中，糊精的加入量为清膏重量的5～15％，二氧化硅的加入量为清膏重量的3～8％。所述步骤c中，对浸膏进行喷雾干燥后再加入辅料，喷雾干燥时，控制浸膏的进料速度为4～6r/min，进风温度为180～195℃，出风温度为90～100℃。一种竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制方法，包括以下步骤：(1.0)取所述制备方法所制得的竹叶石膏汤配方颗粒2.0g，研细，加盐酸2ml，三氯甲烷20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用无水乙醇0.5ml溶解后，制得供试品溶液：(1.1)取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；(1.2)按薄层色谱法，吸取供试品溶液5μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-丙酮-甲酸30：6：5：0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。一种竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制方法，包括以下步骤：(2.0)取所述制备方法所制得的竹叶石膏汤配方颗粒1.0g，研细，加水20ml溶解，再加盐酸2ml，加热回流1小时，放冷，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，制得供试品溶液；(2.1)取麦冬对照药材1g，加水50ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，放冷，加盐酸2ml，加热回流1小时，放冷，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，制得对照药材溶液；(2.2)按薄层色谱法，吸取供试品溶液2μl和对照药材溶液4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸7：3：0.2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。一种竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制方法，包括以下步骤：(3.0)取所述制备方法所制得的竹叶石膏汤配方颗粒，研细，取2.0g，加入70％乙醇25ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液；(3.1)取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品，加70％乙醇制成每1ml含甘草苷20μg、甘草酸铵80μg的对照品溶液；(3.2)分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定，测定条件如下：填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.05％磷酸溶液，进行梯度脱洗，检测波长：237nm。所述步骤(3.2)中，梯度脱洗如下：0～8min：19％流动相a、81％流动相b，8～35min：19～50％流动相a、81～50％流动相b，35～36min：50～100％流动相a、50～0％流动相b，36～40min：100～19％流动相a、0～81％流动相b。所述步骤(3.2)中，经液相色谱仪进行测定，竹叶石膏汤配方颗粒中甘草苷的含量≥0.3mg/g，甘草酸的含量≥0.5mg/g。本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：(1)为克服传统煎煮方式制得的竹叶石膏汤中有效物质含量不稳定的情况，本发明提供了一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法，该制备方法采用加热回流提取、浓缩、喷雾干燥、制粒的过程制得其配方颗粒，并通过合理控制加水量、煎煮时间等工艺参数，实现了处方中甘草苷、甘草酸以及总黄酮的高效率提取，保障了竹叶石膏汤配方颗粒疗效的稳定性。(2)由于竹叶石膏汤配方颗粒是由饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，失去了原有饮片的形态学特征，其真伪鉴别和优劣评价难以评价，为此，本发明建立了针对竹叶石膏汤配方颗粒有效鉴别以及定量控制方法，为竹叶石膏汤配方颗粒的鉴别和质量评价提供了有效的方法。(3)为解决现有竹叶石膏汤配方颗粒中以人参药味进行定性和定量测定时，出现的准确性差的情况，本发明特别选择炙甘草和麦冬对检测对象，分别建立甘草次酸、麦冬的薄层鉴别，以及甘草苷、甘草酸的高效液相色谱的定量检测，可有效提高竹叶石膏汤配方颗粒的鉴别和质量评价的准确性。附图说明图1为竹叶石膏汤配方颗粒中淡竹叶的薄层色谱图。图2为竹叶石膏汤配方颗粒中人参的薄层色谱图(日光)。图3为竹叶石膏汤配方颗粒中人参的薄层色谱图(紫外光)。图4为竹叶石膏汤配方颗粒中法半夏和甘草次酸的薄层色谱图。图5为竹叶石膏汤配方颗粒中甘草次酸点样量考察的薄层色谱图。图6为竹叶石膏汤配方颗粒中麦冬的薄层色谱图。图7为竹叶石膏汤配方颗粒中麦冬点样量考察的薄层色谱图。图8为竹叶石膏汤配方颗粒中甘草苷、甘草酸铵的高效液相色谱图(s1为对照品溶液，s2为竹叶石膏汤配方颗粒)。图9为阴性溶液色谱图。图10为甘草苷、甘草酸对照品色谱图。图11为竹叶石膏汤配方颗粒的色谱图。图12为甘草酸标准曲线图。图13为甘草苷标准曲线图。图14为牡荆苷对照品溶液的紫外光谱图。图15为香草酸对照品溶液的紫外光谱图。图16为异荭草苷对照品溶液的紫外光谱图。图17为流动相i的竹叶石膏汤配方颗粒色谱对比图。图18为流动相ii的竹叶石膏汤配方颗粒色谱对比图。图19为竹叶石膏汤配方颗粒中人参皂苷rg1、人参皂苷re及人参皂苷rb1的高效液相色谱图。具体实施方式下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明所涉及的浓度均为质量浓度，溶质加入量均按溶剂的质量百分比计。竹叶石膏汤配方颗粒依据东汉医家张仲景所著《伤寒论》一书中竹叶石膏汤经过煎煮、浓缩、制粒而成。原方由竹叶二把、石膏一斤、半夏半升，洗、麦门冬一升，去心、人参二两、甘草二两，炙、粳米半升组成。根据汉代度量衡与现代单位的换算，并结合历代医家对本方的使用，确定处方为：淡竹叶6g，石膏50g，法半夏9g，麦冬20g，人参6g，炙甘草6g，粳米10g。我们知道，传统竹叶石膏汤采用煎煮、浓缩、制粒而成，由于制取方式的不便性、疗效不稳定以及毒副作用等缺陷，为满足现代中医的临床诊疗，推广和应用中药复方配方颗粒日渐重要，不仅能够实现中药的现代化，还能确保中药复方质量。为此，本发明提供了一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法，采用水提、浓缩、干燥、制粒等一系列的操作过程制得配方颗粒。为实现该配方颗粒的质量监控，本发明还提供了用于该制备方法所得竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制方法，弥补了现有竹叶石膏汤配方颗粒乏质量监控的不足。下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。实施例1：本实施例涉及一种竹叶石膏汤配方颗粒的制备方法。按处方：淡竹叶6g，石膏50g，法半夏9g，麦冬20g，人参6g，炙甘草6g，粳米10g，称取原料，煎煮三次，每次加入原料重量8倍的水，每次煎煮1.0h，合并煎液，过滤后得提取液。将提取液抽入浓缩罐进行浓缩，浓缩至相对密度为1.06的清膏时停止浓缩(温度55～80℃)，向清膏中加入糊精和二氧化硅，混合均匀后得浸膏，其中，糊精的加入量为清膏重量的8％，二氧化硅的加入量为清膏重量的5％。对浸膏进行喷雾干燥后再加入等量的淀粉，再经制粒、60℃以下干燥，制得竹叶石膏汤配方颗粒，喷雾干燥时，控制浸膏的进料速度为6r/min，进风温度为180℃，出风温度为100℃。实施例2～8：按实施例1所述制备过程分别制取竹叶石膏汤配方颗粒，具体参数变化参见下表1所示。表1实施例2～8参数变化表采用正交试验方法对上述竹叶石膏汤配方颗粒制备方法进行验证，考察其工艺控制参数对配方颗粒性能指标的影响。(一)水提工艺考察根据传统汤剂煎煮原则，即以水作溶媒，采用现代煎煮方法即加热回流提取工艺，以收膏率和总黄酮含量为评价指标，选择影响提取效果的加水量(倍)、煎煮时间(小时)、煎煮次数(次)作为主要考察因素，各因素水平如表所示，选择4因素3水平正交表进行试验，正交试验表如表2所示。按处方用量取竹叶石膏汤的各一倍饮片9份，按表3所列试验项进行试验，提取液过滤，滤液放置室温，定容至4000ml，混合均匀后，测定甘草苷、甘草酸、总黄酮的含量，计算各指标成分百分含量；另取25ml溶液浓缩、干燥至恒重，测定收膏率。表2正交试验设计因素水平表表3正交试验表根据上述试验结果分析，收膏率的权重系数为0.5，甘草苷的权重系数为0.2，甘草酸的权重系数为0.2，总黄酮的权重系数为0.1。以综合值进行统计分析,结果见表4和5。其中综合评分y＝0.2x1×100/0.157+0.2x2×100/0.334+0.5x3×100/28.97+0.1x1×100/0.41。正交试验分析结果参见下表4、表5所示。表4正交试验直观分析表表5方差分析表离差来源偏差平方和自由度f比f临界值因素a211.61621.63219因素b1560.029212.03019因素c475.63623.66819误差d129.682--注：f0.05(2,2)＝19上述分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，煎煮时间对竹叶石膏汤的提取效果影响最大，加水量的影响最小，以空白试验作为误差，进行方差分析。结果表明，因素b(煎煮次数)为主要影响因素，因素b影响较小，因素a(加水量)影响最小。根据正交实验综合评分结果优选最佳提取工艺条件为a1b3c3，即加8倍量的水，煎煮3次，每次1.5个小时。考虑生产实际情况，及正交试验结果，确定煎煮时间为每次1小时。综合考虑最佳提取工艺为：a1b3c2，即煎煮3次，时间为1小时，加水量为8倍。对最优提取工艺验证试验按照前述最佳提取工艺，即煎煮3次，时间为1小时，加水量为8倍，进行最优工艺验证，验证结果见下表6所示。表6最优提取工艺验证结果通过三批验证结果得出，最佳工艺稳定。(二)喷雾干燥工艺考察影响喷雾干燥的主要因素有：进料温度、清膏相对密度、进料速度、进风温度、出风温度。为了使干燥工艺更为合理，须对这些因素进行考察。(1)清膏相对密度筛选将清膏相对密度(70℃)分别减压浓缩至1.10、1.15、1.06进行喷雾干燥(进风温度：200℃，出风温度：90-100℃)，观察物料干燥情况，结果见下表7所示。表7清膏相对密度筛选清膏相对密度(70℃)物料粘塔情况1.05部分粘塔1.08部分粘塔1.15粘塔结果表明，清膏相对密度在1.05～1.08(70℃)范围内喷雾干燥可得质量较好的干燥清膏粉末。清膏相对密度较高，易堵塞管道，清膏黏度大，雾化困难。且雾化形成的颗粒大，物料易粘结。但清膏相对密度过低，蒸发的水量也相对过低，生产周期加长，因此将清膏相对密度定为1.05-1.08(室温)。(2)进风温度筛选将清膏(1.08)室温，按5r/min进液速度，分别在不同进风温度下进行喷雾干燥，观察物料干燥情况，结果见下表8所示。表8进风温度、出风温度筛选干燥条件物料粘塔情况a(进风温度195℃)部分粘塔b(进风温度180℃)部分粘塔c(进风温度200℃)粘塔根据上述结果，初步确定进风温度为180～195℃。(3)喷雾干燥条件研究结果通过上述研究，确定喷雾干燥最佳工艺条件是室温；清膏相对密度：1.05-1.08(室温)；进液速度：5r/min；进风温度180～195℃；出风温度：100℃。(三)成型性工艺考察在成型工艺考察过程中，分别对辅料种类和比例进行选择，粘合剂均采用70％乙醇。辅料包括β-环糊精、糊精、乳糖、淀粉，其中β-环糊精、糊精、乳糖所制软材较硬无法制粒。淀粉能够成功的制作软材。因此对淀粉的用量进行了考察。分别考察了浸膏粉和淀粉比例为1：2,1：1,1：0.7,1：0.5，这4个比例均可以成功制作软材，但是1：2制成颗粒溶解之后水溶液呈现乳白色，1：1制成颗粒溶解之后为棕色更接近中药提取液的颜色，1：0.7,1：0.5这两个比例在投料量放大之后软材较硬，1：1的比例更稳定.故最终确定竹叶石膏汤配方颗粒浸膏粉和淀粉的比例为1：1。通过上述试验方法分别对本发明竹叶石膏汤配方颗粒制备方法涉及的水提工艺、喷雾干燥工艺以及成型工艺进行考察，由此得到优化后的配方颗粒的制备工艺条件，为验证该工艺条件所制得的竹叶石膏汤配方颗粒的指标性能，对上述实施例1～8所述竹叶石膏汤配方颗粒进行检测。(1)性能指标检测如下表9所示。表9竹叶石膏汤配方颗粒的性能指标需要指出的是，上述表9中，甘草酸和甘草苷含量的检测方法采用本发明记载的高效液相色谱法。总黄酮含量的测定方法照紫外-可见分光光度法(通则0401)进行。转化率计算公式具体为：总黄酮含量的测定方法如下：对照品溶液的制备：取芦丁对照品50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)。标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml与6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。总黄酮含量的测定：取待测品约1g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的重量(μg)，计算，即得。(2)粒度测定照粒度测定法(中国药典2010年版一部附录ⅺb第二法双筛分法)测定，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和，不得过15％。竹叶石膏汤配方颗粒检验结果见下表10所示，均符合规定。表10竹叶石膏汤配方颗粒粒度检查结果表(3)水分测定照水分测定法(中国药典2010年版一部附录ⅸh第一法)测定，规定水分不得过6.0％。竹叶石膏汤配方颗粒检验结果见下表11所示，均符合规定。(4)溶化性测定根据中国药典2010年版一部附录ⅰc颗粒剂通则的要求，取供试品1袋，加热水200ml，搅拌5分钟，立即观察，应全部溶化，并不得有焦屑等异物。竹叶石膏汤配方颗粒检验结果见下表11所示，均符合规定。(5)装量差异测定根据中国药典2010年版一部附录ⅰc颗粒剂通则进行检查，本品装量为1.0g，装量差异限度为±10％。竹叶石膏汤配方颗粒检验结果见下表11所示，均符合规定。表11竹叶石膏汤配方颗粒水分、溶化性、装量差异检查结果表水分溶化性装量差异实施例14.3全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例23.6全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例35.4全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例46.1全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例53.8全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例64.9全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例76.1全部溶化，无焦屑等异物符合规定实施例83.5全部溶化，无焦屑等异物符合规定(6)微生物限度测定根据中国药典2010年版一部附录ic颗粒剂通则，照微生物限度检查法(中国药典2010年版一部附录xiiic)检查，规定细菌数小于1000cfu/g，霉菌数小于100cfu/g，大肠埃希菌不得检出，竹叶石膏汤配方颗粒检验结果均符合规定。本发明还涉及对实施例1～8所述制备方法所制得的竹叶石膏汤配方颗粒进行质量控制的方法，下面以实施例9～11为典型实施例来列举说明其质量控制方法的具体实施方式。具体实施时，可采用实施例9、10的方法对竹叶石膏汤配方颗粒进行鉴别，同时采用实施例11的方法对竹叶石膏汤配方颗粒进行含量测定，实现对竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制。(一)鉴别仪器：jy20002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，bt25s电子天平(赛多利斯)，dzkw-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，kq-500db超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，展开缸，硅胶g板(青岛海洋化工厂，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂，烟台市化学工业研究所)。药品与试剂：竹叶石膏汤配方颗粒(按实施例2所述方式自制，141101)，麦冬对照药材(批号：121013-201310中国药品生物制品检定所)、牡荆苷(批号：111687-200602中国药品生物制品检定所，含量测定用)、异荭草苷(批号：111974-201401中国药品生物制品检定所，含量测定用)、香草酸(批号：110776-200402中国药品生物制品检定所)、甘草次酸(批号：110723-201413中国药品生物制品检定所)，人参皂苷rg1(批号：110703-201128中国药品生物制品检定所)、人参皂苷re(批号：110754-201324中国药品生物制品检定所)、人参皂苷rb1(批号：110704-201424中国药品生物制品检定所)、人参皂苷rf(批号：110704-201424中国药品生物制品检定所用)，人参对照药材(批号：120917-201110中国药品生物制品检定所)，半夏对照药材(批号：121272-201404中国药品生物制品检定所)。实施例9：本实施例涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中甘草次酸的薄层色谱鉴别。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒2.0g，研细，加盐酸2ml，三氯甲烷20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用无水乙醇0.5ml溶解后，制得供试品溶液。对照品溶液：取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。鉴别：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液5μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-丙酮-甲酸30：6：5：0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实验一：本实验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中淡竹叶的薄层色谱鉴别。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒2.0g，研细，加入70％乙醇30ml，超声处理20min，过滤，滤液蒸干，残渣加入甲醇1ml，使溶解，制得供试品溶液。对照品溶液：取牡荆素、香草酸、异荭草苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml各0.3mg的对照品溶液，制得对照品溶液。鉴别：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水5:0.8:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱参见图1所示，图中，1-3：竹叶石膏汤配方颗粒，4-5：异荭草苷，6-7：牡荆素，8-9：香草酸。由图1可以看出，淡竹叶中的黄酮类成分牡荆素、香草酸、异荭草苷在竹叶石膏汤配方颗粒中无法检出，可能是因为淡竹叶中这些成分含量极低，且黄酮类成分一般难溶或不溶于水，水煎煮无法提取出黄酮类成分。因此，无法通过淡竹叶的薄层色谱法对竹叶石膏汤配方颗粒进行有效鉴别。实验二：本实验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中人参的薄层色谱鉴别。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒2.0g，研细，加水10滴，搅匀，再加水饱和的正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液，加入3倍量的氨试液，摇匀，放置使分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制得供试品溶液。对照药材溶液：取人参对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至近干，再加水饱和的正丁醇10ml，同法制成对照药材溶液。对照品溶液：取人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rg1、人参皂苷rf对照品适量，加甲醇制成每1ml个含2mg的混合溶液，制得对照品溶液。鉴别：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水15:40:22:10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯365nm下检视。供试品色谱参见图2、图3所示，图中，1-3：竹叶石膏汤配方颗粒，4-5人参对照药材，6：人参皂苷rf，7：人参皂苷rg1，8：人参皂苷re，9：人参皂苷rg1、re、rb1。由图2、图3可以看出，竹叶石膏汤配方颗粒的色谱图中只有人参皂苷rg1、re的成分与对照药材和对照品相应的位置上显相同颜色的斑点，其余斑点不能检出。实验三：本实验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中法半夏和甘草次酸的薄层色谱鉴别。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒2.0g，研细，加盐酸2ml，三氯甲烷20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5ml，制得供试品溶液。对照药材溶液：取半夏对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至干，再加盐酸2ml，同法制得对照药材溶液。对照品溶液：取甘草次酸对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，制得对照品溶液。鉴别：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液5μl、对照药材溶液5μl和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-丙酮-甲酸30：6：5：0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视。供试品色谱参见图4所示，图中，1-2：甘草次酸，3：半夏对照药材，4-6：竹叶石膏汤配方颗粒。由图4可以看出，竹叶石膏汤配方颗粒的薄层色谱图中，与半夏对照药材相应的位置上没有相同的斑点，与甘草次酸相应的位置上有相同颜色的斑点。因此，通过法半夏的薄层色谱法对竹叶石膏汤配方颗粒进行有效鉴别，采用甘草次酸的鉴别是有效的。实验四：本实验涉及甘草次酸的薄层色谱鉴别中对点样量的考察。按实验三所述条件，分别取供试品溶液和甘草次酸溶液各2μl、4μl、5μl、8μl点于同一硅胶gf254薄层板上，按上述薄层色谱条件进行试验，如图5所示，图中，1：竹叶石膏汤配方颗粒2μl，2：竹叶石膏汤配方颗粒4μl，3：竹叶石膏汤配方颗粒5μl，4：竹叶石膏汤配方颗粒8μl，5：甘草次酸2μl，6：甘草次酸4μl，7：甘草次酸5μl，8：甘草次酸8μl。由图5可以看出，当供试品溶液的点样量为5μl和甘草次酸溶液的点样量为2μl时，在相同位置上有大小合适的斑点，因此，选择供试品溶液的点样量为5μl和甘草次酸溶液的点样量为2μl，即实施例9所述对竹叶石膏汤配方颗粒中甘草次酸的薄层色谱鉴别方法是有效的。实验五：本实验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中麦冬的薄层色谱鉴别。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒1.0g，研细，加水20ml溶解，再加盐酸2ml，加热回流1小时，放冷，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，制得供试品溶液。对照药材溶液：取麦冬对照药材1g，加水50ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，放冷，加盐酸2ml，同法制得对照药材溶液。鉴别：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液2μl和对照药材溶液4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸7：3：0.2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，参见图6所示，图中，1-4：竹叶石膏汤配方颗粒，5-8：麦冬对照药材。由图6可以看出，竹叶石膏汤配方颗粒的薄层色谱图中，与麦冬对照药材相应的位置上显相同的斑点，能对麦冬进行鉴别，因此，在竹叶石膏汤配方颗粒中使用麦冬对照药材作为对照鉴别。实验六：本实验涉及麦冬的薄层色谱鉴别中对点样量的考察。分别取供试品溶液和对照药材溶液各2μl、4μl、5μl、8μl点于同一硅胶g薄层板上，按上述薄层色谱条件进行试验，如图7所示，图中，1：竹叶石膏汤配方颗粒2μl，2：竹叶石膏汤配方颗粒4μl，3：竹叶石膏汤配方颗粒5μl，4：竹叶石膏汤配方颗粒8μl，5：麦冬对照药材2μl，6：麦冬对照药材4μl，7：麦冬对照药材5μl，8：麦冬对照药材8μl。由图7可以看出，竹叶石膏汤配方颗粒的薄层色谱图中，供试品溶液的点样量为2μl和麦冬对照药材溶液的点样量为4μl时，在相同位置上有大小合适的斑点，因此，选择供试品溶液的点样量为2μl和麦冬对照药材溶液的点样量为4μl。如实施例10所示。实施例10：本实验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中麦冬的薄层色谱鉴别。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒1.0g，研细，加水20ml溶解，再加盐酸2ml，加热回流1小时，放冷，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，制得供试品溶液。对照药材溶液：取麦冬对照药材1g，加水50ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，放冷，加盐酸2ml，同法制得对照药材溶液。鉴别：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液2μl和对照药材溶液4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸7：3：0.2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(二)含量测定仪器：aagilent1200高效液相色谱仪；chemstation色谱工作站；电子天平：bp-211d(sautoris，德国)d＝0.1mg/0.01mg，max＝210g/80g；超声波清洗器：kq3200b型，昆山市仪器有限公司；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，粒度5um，长*内径250*4.6mm厂家：phenomenex。药品与试剂：乙腈、甲醇(迪马公司，色谱纯)、水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。竹叶石膏汤配方颗粒(自制，141101)，牡荆苷(批号：111687-200602中国药品生物制品检定所，含量测定用)、异荭草苷(批号：111974-201401中国药品生物制品检定所，含量测定用)、香草酸(批号：110776-200402中国药品生物制品检定所，含量测定用)、甘草苷(批号：111610-200604中国药品生物制品检定所，含量测定用)、甘草酸铵(批号：110731-201317中国药品生物制品检定所，含量测定用)、人参皂苷rg1(批号：110703-201128中国药品生物制品检定所，含量测定用)、人参皂苷re(批号：110754-201324中国药品生物制品检定所，含量测定用)、人参皂苷rb1(批号：110704-201424中国药品生物制品检定所，含量测定用)。实施例11：本实施例涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中甘草苷和甘草酸铵的含量测定。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒，研细，取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液；对照品溶液：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品，加70％乙醇制成每1ml含甘草苷20μg、甘草酸铵80μg的对照品溶液；(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅵd)测定，测定条件如下：色谱柱：菲罗门luna5uc18(2)，柱温为30℃，填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.05％磷酸溶液，进行梯度脱洗，检测波长：237nm，流速为1.0ml/min。梯度脱洗流程如下：0～8min：19％流动相a、81％流动相b，8～35min：19～50％流动相a、81～50％流动相b，35～36min：50～100％流动相a、50～0％流动相b，36～40min：100～19％流动相a、0～81％流动相b。经液相色谱仪进行测定，竹叶石膏汤配方颗粒中甘草苷的含量≥0.3mg/g，甘草酸的含量≥0.5mg/g。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。色谱图参见图8所示。试验七：对实施例11所述竹叶石膏汤配方颗粒含量测定的方法学考察：(1)专属性考察专属性考察按含量测定方法制备阴性溶液、供试品溶液进行专属性试验，实验结果表明溶剂对甘草苷的测定无影响，该方法专属性好。参见图9～11。(2)线性考察线性考察分别精密吸取对照品溶液(甘草苷20.4μg/ml，甘草酸33.2μg/ml)5μl、10μl、15μl、20μl、30μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(x，μg)为横坐标，以峰面积值(y)为纵坐标进行线性回归计算，得回归方程为甘草苷：y＝24.65x+16.97，r2＝0.999，甘草酸：y＝6.211x+4.054，r2＝0.999结果见表12、表13、图12、图13。表12甘草苷标准曲线结果表进样量(x，μg)10.220.430.640.861.2峰面积(y，mau*s)25851778110401512表13甘草酸标准曲线结果表进样量(x，μg)16.633.249.866.499.6峰面积(y，mau*s)110208312416624结果表明：甘草苷进样量在10.2～61.2μg范围内，甘草酸进样量在16.6～99.6μg范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系。(3)精密度考察精密吸取甘草苷、甘草酸混合溶液(甘草苷20.4μg/ml，甘草酸33.2μg/ml)对照品溶液10μl，连续进样6次，测定甘草苷的峰面积，计算rsd，结果见下表14所示。表14精密度试验结果表结果表明，rsd<3％，表明精密度良好。(4)中间精密度考察取同一批供试品(141101)，分别由a、b两人，在不同时间，各处理三份样品，用同一台设备按含量测定方法测定本品甘草苷的含量，计算rsd。结果见下表15、表16所示。表15甘草酸中间精密度结果表表16甘草苷中间精密度结果表结果表明，甘草酸的rsd％为1.0％，甘草苷的rsd％为1.69％，表明中间精密度良好。(5)重复性考察精密称取样品约(141101)2.0g，共6份，置具塞锥形瓶中，按照选定供试品处理方法制备样品溶液，测定含量，计算rsd，结果见下表17、表18所示。表17甘草酸重复性试验结果表18甘草苷重复性试验结果以上结果表明∶甘草酸的rsd％为0.82％，甘草苷的rsd％为0，均小于3％，此方法重复性良好。(6)稳定性考察精密称取样品约(141101)2.0g，置具塞锥形瓶中，按照选定供试品处理方法制备样品溶液，室温保存，分别于0、2、4、6、8、10、12小时精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定样品中甘草苷、甘草酸峰面积积分值，计算rsd，结果见表19。表19稳定性试验结果以上结果表明∶在本实验条件下，样品供试液在12小时内稳定性良好。(7)加样回收率考察取已知含量的样品(141101，甘草苷的含量0.033％，甘草酸的含量为0.063％)约1.0g，共6份，精密称定，分别加入甘草苷、甘草酸对照品适量，按正文供试品溶液制备方法制备加样回收供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按照正文含量测定方法进行测定，计算回收率，结果见下表20、表21所示。计算公式如下：表20甘草酸回收率试验结果表21甘草苷回收率试验结果以上结果表明∶甘草酸的平均回收率为98.9％，rsd％为1.4％，甘草苷的平均回收率为99.3％，rsd％为1.6％，加样回收率良好，能够准确的测定出竹叶石膏汤配方颗粒中甘草酸、甘草苷的含量。(8)样品含量测定考察分别称取多批样品，按照选定的含量测定方法进行供试品的制备及含量测定，结果见表22。表22各样品含量结果表根据上述试验结果，3批样品中甘草酸的含量在0.07～0.09％，甘草苷的含量在0.03～0.04％之间，故暂定本品按干燥品计算，每1g含甘草酸不得少于0.05％，甘草苷不得少于0.03％。试验八：本试验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中牡荆苷、香草酸、异荭草苷的含量测定。竹叶石膏汤中淡竹叶为君药，其主要有效成分为黄酮类物质，现特进行其三种主要成分牡荆苷、香草酸、异荭草苷的含量测定方法考察。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒适量，研细，称取约2.0g，精密称定，加70％乙醇溶液25ml，精密称定，超声处理30min，放至室温，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液。对照品溶液：取牡荆苷对照品、香草酸对照品、异荭草苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含牡荆苷、香草酸、异荭草苷各60ug的对照品溶液。波长的选择：对牡荆苷、香草酸、异荭草苷对照品溶液进行全波长光谱采集，如图14～16所示，通过对光谱图的分析及样品的测定确定最佳波长为269nm。流动相的选择：采用以下两种流动相对竹叶石膏汤配方颗粒中牡荆苷、香草酸、异荭草苷进行含量测定方法进行考察，如图17、图18所示。流动相i:0.05％冰乙酸-甲醇(65:35)流动相ii：以0.05％冰乙酸为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度脱洗流程如下：0～5min：95％流动相a、5％流动相b，5～10min：95～87％流动相a、5～13％流动相b，10～30min：87％流动相a、13％流动相b，30～37min：87～84％流动相a、13～16％流动相b，37～45min：84％流动相a、16％流动相b。牡荆苷、香草酸、异荭草苷这三种成分均为黄酮类物质，几乎不溶于水。由以上两种测定方法结果表明，竹叶石膏汤配方颗粒中不含牡荆苷、香草酸、异荭草苷这三种成分，因此，无法通过牡荆苷、香草酸、异荭草苷的含量测定实现竹叶石膏汤配方颗粒的质量控制。试验九：本试验涉及对竹叶石膏汤配方颗粒(141101)中人参皂苷rg1、人参皂苷re及人参皂苷rb1的含量测定。竹叶石膏汤中人参为臣，其主要有效成分为皂苷类，现特进行其三种主要成分人参皂苷rg1、人参皂苷re及人参皂苷rb1的含量测定方法考察。供试品溶液：取竹叶石膏汤配方颗粒适量，研细，称取约2.0g，精密称定，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液。对照品溶液：精密称取人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品及人参皂苷rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的对照品溶液。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以水为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于6000。色谱图如图19所示。梯度脱洗流程如下：0～35min：19％流动相a、81％流动相b，35～55min：19～29％流动相a、81～71％流动相b，55～70min：29％流动相a、71％流动相b，70～100min：29～40％流动相a、71～60％流动相b。由以上实验结果表明，竹叶石膏汤配方颗粒中人参皂苷类成分含量极低，若对人参皂苷类成分的含量测定，其准确性差。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。当前第1页12