鲁斯可皂苷元在预防冠状病毒感染中的应用

1.本发明涉及生物药物领域，具体涉及鲁斯可皂苷元在预防冠状病毒感染中的应用。


背景技术：

2.2019年年底突发的新型病毒性肺炎疫情由一种冠状病毒新毒株引起，2020年年初世界卫生组织将其命名为2019新型冠状病毒(英文简写2019-ncov)，其所致疾病命名为covid-19，之后国际病毒分类学委员会冠状病毒研究小组，将该病毒命名为sars-cov-2。
3.sars-cov-2为套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、β冠状病毒属的sarbecovirus亚型，有包膜，病毒颗粒呈球形或椭圆形，具多形性，直径60～140nm，属于单正链rna病毒，基因组全长29,903bp。目前尚无针对sars-cov-2感染导致的新型冠状肺炎(covid-19)的特效药，研发出特异性药物和有效的疫苗对于抑制疾病传播和治疗至关重要。
4.北京化工大学童贻刚团队已经从穿山甲中分离培养出一株新型冠状病毒，利用该毒株筛选现有的2,406种药物，发现和验证了多种有效抑制冠状病毒的老药，部分药物经与新冠病毒的筛选模型比对，确认了两种模型的结果一致(hua-hao fan,li-qin wang,wen-li liu,xiao-ping an,zhen-dong liu,xiao qi he,li-hua song,yi-gang tong.repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019in a 2019-novel coronavirus(2019-ncov)related coronavirus)在该文献中，该毒株命名为gx_p2v/pangolin/2017/guangxi。该文献结果表明穿山甲冠状病毒gx_p2v/pangolin/2017/guangxi可以作为筛选抗新冠病毒药物的替代模型。
5.在covid-19疫情中中药发挥出巨大的潜力，目前已筛选出金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、血必净注射液和清肺排毒汤、化湿败毒方、宣肺败毒方等有明显疗效的“三药三方”。然而中药成分复杂、多样，部分中药中可能还含有有毒有害物质，因此鉴定出其中能发挥抗病毒作用的有效成分对于新冠肺炎的预防与治疗具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供鲁斯可皂苷元在预防冠状病毒感染中的应用。
7.第一方面，本发明要求保护一种鲁斯可皂苷元(ruscogenin)或其药学上可接受的盐或以鲁斯可皂苷元或其药学上可接受的盐为活性成分的物质在如下任一中的应用：
8.(a1)制备抑制冠状病毒的产品，或抑制冠状病毒；
9.(a2)制备能够预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品，或预防由于冠状病毒感染所致疾病。
10.其中，所述抑制冠状病毒可为在机体水平或细胞水平抑制冠状病毒。所述抑制冠状病毒为抑制冠状病毒复制。
11.进一步地，所述抑制冠状病毒是在冠状病毒进入宿主或宿主细胞前(即入胞前)发
挥作用。所以鲁斯可皂苷元适于制备用于预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品。
12.进一步地，所述鲁斯可皂苷元为(25rs)-鲁斯可皂苷元。
13.在本发明中，所述冠状病毒可为sars-cov-2病毒或冠状病毒穿山甲分离株gx_p2v/pangolin/2017/guangxi或其他类似冠状病毒。
14.当所述冠状病毒为sars-cov-2病毒时，由其感染所致疾病为covid-19。
15.在所述应用中，所述产品具体可为药物。
16.在本发明中，(25rs)-鲁斯可皂苷元来源于“三药三方”中的参麦注射液或生脉注射液。
17.第二方面，本发明要求保护一种产品。
18.本发明所要求保护的产品，其活性成分为鲁斯可皂苷元或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一用途：
19.(a1)抑制冠状病毒；
20.(a2)预防由于冠状病毒感染所致疾病。
21.其中，所述抑制冠状病毒可为在机体水平或细胞水平抑制冠状病毒。
22.进一步地，所述抑制冠状病毒是在冠状病毒进入宿主或宿主细胞前(即入胞前)发挥作用。所以鲁斯可皂苷元适于制备用于预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品。
23.进一步地，所述鲁斯可皂苷元为(25rs)-鲁斯可皂苷元。
24.在本发明中，所述冠状病毒可为sars-cov-2病毒或冠状病毒穿山甲分离株gx_p2v/pangolin/2017/guangxi或其他类似冠状病毒。
25.当所述冠状病毒为sars-cov-2病毒时，由其感染所致疾病为covid-19。
26.所述产品具体可为药物。
27.所述(25rs)-鲁斯可皂苷元的结构式如式i所示。
[0028][0029]
本发明基于穿山甲冠状病毒xcov(即冠状病毒穿山甲分离株gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)药物筛选模型从“三药三方”中筛选出了具有抗sars-cov-2的活性药物(25rs)-鲁斯可皂苷元。本发明对于covid-19的预防具有重要临床应用价值。
附图说明
[0030]
图1为中药单体(25rs)-鲁斯可皂苷元对穿山甲冠状病毒xcov的病毒复制抑制率。
[0031]
图2为(25rs)-鲁斯可皂苷元的ec
50
、cc
50
和si。
[0032]
图3为(25rs)-鲁斯可皂苷元的加药时间实验结果。
具体实施方式
[0033]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0034]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]
下述实施例中所用到的冠状病毒穿山甲分离株gx_p2v/pangolin/2017/guangxi，已经在以下两篇文献中公开了：
[0036]
1.hua-hao fan,li-qin wang,wen-li liu,xiao-ping an,zhen-dong liu,xiao qi he,li-hua song,yi-gang tong.repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019in a 2019-novel coronavirus(2019-ncov)related coronavirus.
[0037]
2.lam,t.t.,jia,n.,zhang,y.et al.identifying sars-cov-2-related coronaviruses in malayan pangolins.nature 583,282
–
285(2020).https://doi.org/10.1038/s41586-020-2169-0。
[0038]
本发明中所使用的gx_p2v/pangolin/2017/guangxi先进行的菌种保藏，后发表论文，保藏证明中的xcov即为文献1中的病毒gx_p2v/pangolin/2017/guangxi和文献2中的gx/p2v。
[0039]
所述xcov已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.19295；保藏日期：2020年2月14日；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类学命名：冠状病毒。
[0040]
实施例1、从“三药三方”中筛选具有抗sars-cov-2活性的药物单体
[0041]
一、实验方法
[0042]
1、细胞培养和病毒培养
[0043]
非洲绿猴肾细胞系vero e6是从美国模式培养物集存库(atcc，1586号)中获得的，在37℃、5％co2的条件下，在含有10％胎牛血清(fbs；gibco invitrogen)的dmem培养基(gibco)中培养。
[0044]
将穿山甲分离株xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)在vero e6细胞中繁殖，用噬斑实验测定病毒滴度。所有感染实验均在生物安全2级(bls2)实验室进行。
[0045]
抗covid-19中药化合物库(产品号l6720，含从“三药三方”分离纯化得到的389种中药单体)为上海陶素生化科技有限公司产品。所有药物的初始浓度均为10mm(毫摩尔每升)。
[0046]
2、利用sars-cov-2高度同源的穿山甲冠状病毒xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)从抗covid-19中药化合物库中筛选潜在的抗新型冠状病毒药物
[0047]
96孔细胞板中种上2.5
×
104个vero细胞，24小时后用moi＝0.01的xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)感染vero细胞，同时向每孔中分别加入终浓度为50μm的389种中药单体，在第2天时通过显微镜镜下观察细胞病变，对没有明显细胞病变的培养孔提取细胞和上清中的rna，用qrt-pcr测定细胞和上清中的病毒复制情况以及细胞内参基因
gapdh的表达情况。在没有明显细胞毒性的情况下，对病毒复制抑制率达90％以上视为潜在抗新冠病毒药物。
[0048]
3、潜在抗病毒药物ec
50
及cc
50
测定
[0049]
96孔细胞板中种上2.5
×
104个vero细胞，24小时后用moi＝0.01的xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)感染vero细胞，同时向其中加入终浓度分别为50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm、0.78125μm和0.390625μm的中药单体，在第3天时通过显微镜镜下观察细胞病变，对没有明显细胞病变的培养孔提取细胞和上清中的rna，用qrt-pcr测定细胞和上清中的病毒复制情况以及细胞内参基因gapdh的表达情况。
[0050]
ec
50
是指能够有效抑制50％细胞感染病毒的药物浓度，数值越小说明对病毒的抑制效果越好。
[0051]
cc
50
是使得50％的细胞发生病变时的药物浓度，数值越高说明对细胞的毒性越低。
[0052]
si：选择性指数，为cc
50
与ec
50
的比值，数值越大说明成药的可能性越高。
[0053]
4、加药时间实验
[0054]
24孔细胞板中种上2.5
×
105个vero细胞，24小时后用moi＝0.01的xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)感染vero细胞，分别在全感染周期(加病毒时和加病毒孵育2h后)、入胞前(加入病毒时)、入胞后(加病毒孵育2h后)向其中加入浓度为25μm的潜在有效药物，在第3天时通过显微镜镜下观察细胞病变，对没有明显细胞病变的培养孔提取细胞和上清中的rna，用qrt-pcr测定细胞和上清中的病毒复制情况以及细胞内参基因gapdh的表达情况。
[0055]
5、病毒rna提取及实时定量rt-pcr(qrt-pcr)
[0056]
根据制造商的说明，使用axyprep
tm
体液病毒dna/rna微型制备试剂盒(axygen，产品编号ap-mn-bf-vna-250)和axyprep
tm
多用途总rna微型制备试剂盒(axygene，产品编号ap-mn-ms-rna-250g)采集细胞培养上清液和vero细胞进行rna提取。用带有gdna酶的hifairⅱ1链cdna合成试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，产品编号11121es60)进行反转录，用hieff-qpcr-sybr-green-master mix(上海翊圣生物科技有限公司，货号：11202es08)或两步taqman探针检测qrt-pcr系统(applied-biosystem)进行qpcr，所用引物的序列信息在表1中示出。经测序确认后，由北京瑞博兴科生物科技有限公司将pcr产物插入t载体，产生标准质粒。标准曲线是通过测定质粒连续稀释(10
3-109)的拷贝数而产生的，进而通过标准曲线可利用qrt-pcr得到的ct值计算病毒拷贝数。
[0057]
sybr-green法扩增程序如下：95℃5min，40个循环，95℃10s，55℃20s，72℃31s。
[0058]
taqman法：50℃2min，95℃10min，40个循环，95℃10s，60℃1min。使用graphpad-prism 8.3.0软件分析数据。
[0059]
表1研究中使用的引物序列
[0060]
引物名称序列(5
’-3’
)xcov-fggtgattgccttggtgatattgxcov-rgcaagtagtgcagaagtgtattgxcov-ptctgtgagcaaaggcggtagaacc(5
’-
fam，3
’-
tamra)gapdh-fagcctcaagatcatcagcaatggapdh-ratggactgtggtcatgagtcctt
gapdh-pccaactgcttagcacccctggcc(5
’-
fam，3
’-
tamra)
[0061]
二、实验结果
[0062]
通过实时定量pcr技术检测发现，50μm的(25rs)-鲁斯可皂苷元在感染复数0.01的xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)感染细胞48小时后，对病毒复制抑制率为99.77％(图1)。
[0063]
(25rs)-鲁斯可皂苷元的ec
50
、cc
50
和si分别为11.70μm、》50μm、》4.27(图2)。
[0064]
加药时间实验表明，(25rs)-鲁斯可皂苷元主要在入胞前的阶段(病毒进入细胞前)起作用(图3)。
[0065]
三、讨论
[0066]
在本发明中，发明人在sars-cov-2相关冠状病毒即穿山甲冠状病毒xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)模型中进行了抗冠状病毒活性药物的筛选。基于实验室前期研究结果发现，xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)感染哺乳动物细胞vero(非洲绿猴肾细胞)以后能使细胞产生非常明显的细胞病变。基于这一特点，发明人在前期使用xcov(即gx_p2v/pangolin/2017/guangxi)感染96孔细胞培养板中的vero细胞，同时向每个细胞培养孔中加入分离自“三药三方”的药物单体(389种中药单体)，进行潜在的抑制病毒复制的活性药物筛选。在第2天时通过显微镜下观察细胞病变，结果发现(25rs)-鲁斯可皂苷元对病毒感染细胞抑制明显，可作为潜在抗病毒药物。进一步通过实时荧光定量pcr技术检测发现，50μm的(25rs)-鲁斯可皂苷元在感染复数0.01的xcov感染细胞48小时后，对病毒复制抑制率为99.77％。由于xcov与目前的sars-cov-2高度同源，且xcov感染细胞的受体与sars-cov-2一致，如果药物对xcov感染细胞有抑制作用，则其对sars-cov-2的感染也有抑制作用(参考文献：hua-hao fan,li-qin wang,wen-li liu,xiao-ping an,zhen-dong liu,xiao qi he,li-hua song,yi-gang tong.repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019in a 2019-novel coronavirus(2019-ncov)related coronavirus.)。
[0067]
同时，为了进一步验证(25rs)-鲁斯可皂苷元的效果测定了其ec
50
和cc
50
。(25rs)-鲁斯可皂苷元的ec
50
、cc
50
和si分别为11.70μm、》50μm、》4.27。这些结果表明(25rs)-鲁斯可皂苷元具有较好的抗病毒活性且毒副作用较低，具有潜在临床应用价值。
[0068]
最后，对(25rs)-鲁斯可皂苷元作用时期进行了探究。(25rs)-鲁斯可皂苷元主要在病毒入胞前的阶段起作用。这一结果进一步有力证明了(25rs)-鲁斯可皂苷元的潜在抗病毒活性。
[0069]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。