消除PCR荧光基线期波动的方法与流程

消除pcr荧光基线期波动的方法
技术领域
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本发明涉及聚合酶链式反应中放大扩增特定dna片段的分子生物领域，尤其是涉及消除pcr荧光基线期波动的方法。


背景技术：

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众所周知，pcr（聚合酶链式反应，简称pcr）扩增中荧光信号因受到各种因素影响，最终得到的扩增数据不准确，pcr扩增曲线不平滑，给后续数据计算的准确性带来很大误差。


技术实现要素：

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本发明目的在于提供一种消除pcr荧光基线期波动的方法，对扩增曲线进行拟合标准化，实现提高后续计算的准确度。
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为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：本发明所述消除pcr荧光基线期波动的方法，包含下述步骤：步骤1，在实时荧光定量pcr反应中，采集荧光信号数据集，所述数据集包含多个数据点；将每个所述数据点与设定的顺序号一一对应，使得每一个数据点分别对应平面坐标系中的一个坐标点（x，y），其中，x值表示实时荧光pcr循环数，y值表示测得的荧光信号值，所述荧光信号值包含发光值、吸光度；步骤2，通过使用数据拟合方法应用于函数模型，计算求出函数模型中的参数值a,b,c,d,e，得到函数表达式如下：；步骤3，对所述函数表达式进行处理，求出荧光信号值达到指数扩增时的循环周期数ct值。
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优选地，所述数据拟合步骤为：步骤2.1，设置初始值：a选取所述数据集中的第一个y值；b选取1；c选取数据集中x值的中位数或均值或最小数或最大数；d选取数据集中最后一个y值；e 选择1。
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步骤2.2，设置搜索方向：采用最速下降法、gauss-newton法、levenberg-marquardt法、约束优化的搜索方法等方法中任意一种；步骤2.3，终止条件：包含迭代的次数、误差和的限值、两次相邻迭代系数最大差值限值等条件中的一个或者多个。
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优选地，计算所述ct值的方法为：将y值设为任意荧光信号水平（afi）时，带入所述函数表达式，根据函数求根方法计算所得x值即为ct值。
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本发明解决了聚合酶链式反应测光过程中荧光波动引起的数据不准确，为后续计算提供了准确、科学数据。同时，本方法函数模型系数较少，更容易实现，适用扩增曲线线型范围广。
附图说明
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图1是本发明的流程框图。
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图2是本发明数据拟合的流程框图。
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图3是本发明实施例采集到的荧光信号数据集的示意图。
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图4是本发明实施例使用函数表达式绘制的示意图。
具体实施方式
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下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
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本发明所述消除pcr荧光基线期波动的方法，按照下述步骤进行：步骤1，在实时荧光定量pcr反应中，采集荧光信号数据集，所述数据集包含多个数据点；将每个所述数据点与设定的顺序号一一对应，使得每一个数据点分别对应平面坐标系中的一个坐标点（x，y），其中，x值表示实时荧光pcr循环数，y值表示测得的荧光信号值，所述荧光信号值包含发光值、吸光度；获取到的数据如图3所示；步骤2，通过使用数据拟合方法应用于函数模型，计算求出函数模型中的参数值a,b,c,d,e，得到函数表达式如下：；步骤2.1，设置初始值为：a=9137；b=1；c=9594(均值)；d=11484；e=1；步骤2.2，设置搜索方向：采用levenberg-marquardt法进行方向设置步骤2.3，终止条件：包含迭代的次数、误差和的限值、两次相邻迭代系数最大差值限值等条件中的一个或者多个。
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选择迭代次数1000次及误差和小于1e-6作为终止条件。
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重复步骤2.2及2.3最终得到函数模型中参数值为：a=9159.77；b=16.94；c=37.37；d=11571.59；e=1.03；最终函数表达式为：使用函数表达式进行绘图，如图4所示；步骤3，计算ct：
对所述函数表达式进行处理，求出荧光信号值达到指数扩增时的循环周期数ct值；当y设置为9265时，带入函数表达式，根据函数求根方法可计算x为31.08，即ct为31.08。
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现以一组实验ct计算结果展示效果示例：1）待测样本：相同浓度样本；2）计算ct值使用相同的y设定值；ct值分布如下表格，使用本方法后相同浓度样本ct值的cv从0.97%降低为0.63%，效果显著。
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