一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ROS敏感性纳米试剂及其制备方法与流程

一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros(reactive oxygen species，活性氧)敏感性纳米试剂及其制备方法。


背景技术：

2.癌症在我国乃至世界范围内都是人类健康的宿敌，癌症的发病率也在日益增加。最新调查结果显示，2019年全球癌症新发病例达2000余万例，死亡更是超过千万例。其中，中国癌症的发病人数和死亡人数更是高居全球第一。目前，常用的癌症治疗方法并不能提供令人满意的治疗效果，且存在特异性低、毒副作用强、复发率高等缺陷。早期的癌症难以发现，而肿瘤细胞又易通过淋巴血管等途径转移扩散，导致癌症的治愈率不理想。目前临床癌症的治疗方法是手术治疗、放射治疗和化学治疗。然而，手术治疗存在高风险、创伤面积大和易复发的缺点；放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时会损伤机体的正常细胞，导致正常生理功能受损，同时还会产生多药耐药性。因此，人们亟需开发新型的癌症治疗方案和药物来攻克这一难题。
3.光动力疗法是近些年新兴的一种有效的癌症治疗方法，在特定波长光照射下可以产生具有细胞毒性的单线态氧，选择性地清除肿瘤细胞而不损害健康组织和器官，因此在肿瘤治疗中受到广泛关注作为用于癌症诊断的成像探针，也可用于指导癌症治疗。然而，光敏剂传递效率低和诊断不敏感严重限制了其在临床中的使用。现已开发了一些方法通过利用对肿瘤微环境有反应的纳米药物载体。纳米药物载体具有优越的细胞穿透能力，可以提高药物的作用，并控制其释放和靶向肿瘤细胞。从而减少了药物的剂量和副作用。通过提高纳米载体的肿瘤靶向聚集能力，以及在细胞内激活光敏剂，是提高光动力治疗效果的有效途径。
4.然而，随着医疗技术不断发展，一些肿瘤细胞的耐药性也显现出来，单一性的治疗体系已不能满足目前癌症治疗的要求，我们需要结合多种治疗手段，开发全新的纳米药物制剂。近年来出现了一种全新的细胞死亡方式铁死亡(ferroptosis)。铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡的主要机制是，在二价铁的作用下，催化不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而导致脂质过氧化物堆积进而诱导细胞死亡。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有问题而提供一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros(reactive oxygen species，活性氧)敏感性纳米试剂及其制备方法，该纳米试剂可以有效的通过被动靶向聚集到肿瘤位置，经肿瘤细胞内吞后与肿瘤内的活性氧物质相互作用，以实现同时激活光动力治疗和铁死亡的效应，从而达到癌症的精准治疗。
6.本发明所述的一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂，其
特征在于：该纳米试剂由一种光敏剂修饰的ros敏感性两亲性嵌段聚合物构建，所述的光敏剂修饰的ros敏感性两亲性聚合物包括两亲性生物可降解聚合物(即含有端氨基基团的甲氧基聚乙二醇胺作为大分子引发剂，一步引发成环氨基酸单体开环聚合形成的聚合物主骨架)、尾端连接光敏剂基团和侧链修饰的可诱导铁死亡的ros敏感性感性单体；所述的光敏剂修饰的ros敏感性两亲性聚合物能自组装为一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂，其中疏水部分自组装成为疏水的核，而亲水部分成为亲水的外壳。最终，利用薄膜分散法驱使光敏剂修饰的ros敏感性两亲性嵌段聚合物自组装成可协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂，使其通过肿瘤微环境作用下，实现光动力与铁死亡治疗协同作用抑制肿瘤增长的效果。
7.本发明所述的一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂的制备方法，其步骤如下：
8.(1)将作为亲水链段的甲氧基聚乙二醇胺(mpeg-nh2)大分子引发剂和成环氨基酸单体混合后置于有机溶剂1中，在氮气、30～35℃下搅拌70～72小时，然后倒入分离溶剂中，搅拌、沉降、过滤、真空干燥后得到聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg)；
9.(2)将含有羧基基团的光敏剂和用来活化光敏剂中羧基基团的化合物混合后置于无水溶剂中，在氮气、30～35℃下避光搅拌2～3小时，得到反应体系a；之后将步骤(1)得到的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg)溶于无水溶剂中，得到反应体系b；然后把反应体系b添加到反应体系a中，在氮气下、30～35℃避光搅拌24～28小时；最后在避光条件下透析，冷冻干燥得到光敏剂修饰的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg-ce6)；
10.(3)将步骤(2)得到的光敏剂修饰的聚氨基酸主骨架、链保护剂和含有双端氨基基团的小分子化合物混合后置于无水溶剂中，在氮气、50～55℃下避光搅拌70～72小时，然后依次在盐酸和去离子水中透析，冷冻干燥后得到侧链带有自由氨基基团的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-p(ed)lg-ce6)；
11.(4)将能够诱导铁死亡的ros敏感性单体和活化敏感单体中羧基基团化合物混合后置于无水溶剂中，在氮气、30～35℃下避光搅拌2～3小时，得到反应体系c；然后将步骤(3)得到的侧链带有自由氨基基团的聚氨基酸主骨架溶解于无水溶剂中，并添加到反应体系c中，在氮气下，30～35℃避光搅拌24～28小时，透析，冷冻干燥得到光敏剂修饰的ros敏感性两亲性嵌段聚合物(mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6)；
12.(5)步骤(4)得到的光敏剂修饰的ros敏感性两亲性嵌段聚合物(mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6)通过薄膜分散法制备纳米颗粒，具体包括以下过程：所述的薄膜分散法是将光敏剂修饰的ros敏感性两亲性嵌段聚合物溶于有机溶剂2中，之后置于圆底烧瓶中，真空状态下旋转蒸发至烧瓶内壁形成一层干燥的薄膜，然后在烧瓶中加入去离子水，超声5～10分钟至薄膜全部分散，透析，冷冻干燥得到ros敏感性纳米试剂(ppa@ce6)。
13.优选的，步骤(1)所述的亲水链段甲氧基聚乙二醇胺(mpeg-nh2)大分子引发剂，其平均分子质量为1000～5000。
14.优选的，步骤(1)所述的成环氨基酸单体为聚谷氨酸苄酯羧酸酐(blg-nca)或天冬氨酸苄酯内环酸酐单体(bla-nca)。
15.优选的，步骤(1)所述的大分子引发剂与成环氨基酸单体的摩尔比例为1：20～40。
16.优选的，步骤(1)所述的有机溶剂1为无水三氯甲烷、无水二氯甲烷或无水二甲基
甲酰胺中的一种。
17.优选的，步骤(1)所述的用于分离聚合物的溶剂为乙醚。
18.优选的，步骤(2)所述的含有羧基基团的光敏剂为二氢卟吩e6(ce6)、间-四(4-羧基苯基)卟啉或脱镁叶绿酸盐a中的一种。
19.优选的，步骤(2)所述的活化光敏剂中羧基基团的化合物是二环己基碳二亚胺(dcc)与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)组合的缩合剂或n'n-羰基二咪唑(cdi)其中的一种。
20.优选的，步骤(2)所述的光敏剂与活化光敏剂中羧基基团的化合物的摩尔比为1：1～1.1。
21.优选的，步骤(2)所述的透析条件为：透析袋的截留分量为1000～3500da，透析时间为48～72小时，透析液为去离子水。
22.优选的，步骤(3)所述的含有双端氨基基团的小分子化合物为乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺或四亚乙基五胺中的一种。
23.优选的，步骤(3)所述的链保护剂为2-羟基吡啶，用于防止聚氨基酸主链断发生断裂。
24.优选的，步骤(3)所述的光敏剂修饰的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg-ce6)与含有双端氨基基团的小分子化合物的摩尔比为1：20～30，光敏剂修饰的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg-ce6)与链保护剂的摩尔比为1：5～10。
25.优选的，步骤(3)所述的透析条件为：透析袋的截留分量为1000～3500da，先在0.05～0.1mol/l盐酸中透析48～72小时，再在去离子水中透析24～48小时；
26.优选的，步骤(4)所述的能够诱导铁死亡的ros敏感性单体为花生四烯酸(aa)、二十二碳四烯酸或二十二碳六烯酸(dha)中的一种。
27.优选的，步骤(4)所述的能够诱导铁死亡的ros敏感性单体与侧链带有自由氨基基团的聚氨基酸主骨架的摩尔比例为0.8～1：1。
28.优选的，步骤(4)所述的活化敏感单体中羧基基团化合物为二环己基碳二亚胺(dcc)与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)组合的缩合剂或n'n-羰基二咪唑(cdi)其中的一种。
29.优选的，步骤(4)所述的能够诱导铁死亡的ros敏感性单体和活化敏感单体中羧基基团化合物的摩尔用量比为1：1～1.1。
30.优选的，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述的无水溶剂为无水二甲基亚砜(dmso)。
31.优选的，步骤(4)所述的透析条件为：透析袋的截留分量为1000～3500da，透析时间为48～72小时，透析液采用去离子水。
32.优选的，步骤(5)所述的有机溶剂2为无水氯仿。
33.优选的，步骤(5)所述的透析条件为：透析袋的截留分量为30000～50000da，透析时间为12～24小时，透析液采用去离子水。
34.优选的，步骤(5)所述的旋转蒸发温度为35～40℃。
35.优选的，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)所述冷冻干燥的温度范围是-40℃～-60℃。
36.优选的，步骤(5)所述的制备的ros敏感性纳米试剂的粒径为40～60nm，有利于通过被动靶向，有效聚集在肿瘤位置。
37.与目前技术相比，本发明具有以下优点：
38.(1)本发明提供一种简单、有效的多功能纳米治疗试剂制备方法，选用甲氧基聚乙二醇胺作为大分子引发剂，一步开环聚合制备聚氨基酸主骨架，随后尾端修饰光敏剂，侧链接枝花生四烯酸单体，来获得目标聚合物。最后，用一种简单的薄膜分散法来制备ros敏感性纳米试剂。该制备策略，具有可调控、方式简单、灵活和重复性强等优点。
39.(2)制备获得的ros敏感性纳米试剂具有良好的生物相容性和生物可降解性。
40.(3)制备获得的ros敏感性纳米试剂较小的尺寸，有利于纳米颗粒在肿瘤部位的有效聚集。
41.(4)制备获得的ros敏感性纳米试剂，在肿瘤细胞内，不仅可通过内源性的活性氧刺激使疏水的花生四烯酸释转化成亲水的脂质过氧化物而激活光动力治疗，还可以通过产生的单线态氧和脂质过氧化物共同作用加强铁死亡效果，从而有效提高癌症治疗效率。
附图说明
42.图1为制备得到的mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6氢核磁谱图。
43.图2为制备得到的mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6紫外吸收光谱图。
44.图3为制备获得的ros敏感性纳米试剂(ppa@ce6)的透射电镜图
45.图4为制备得到的ros敏感性纳米试剂在羟基自由基作用下的单线态氧产生检测图。
46.图5为制备得到的ros敏感性纳米试剂在无660nm激光辐射下，对肿瘤细胞内谷胱甘肽消耗测试图。
47.图6为制备得到的ros敏感性纳米试剂在660nm激光辐射下，对肿瘤细胞内谷胱甘肽消耗测试图。
48.图7为制备得到的ros敏感性纳米试剂在有和无660nm激光辐射下，对肿瘤细胞内gpx4活性能力分析图。
49.图8为制备得到的ros敏感性纳米试剂在无660nm激光辐射下的细胞毒性测试图。
50.图9为制备得到的ros敏感性纳米试剂在660nm激光辐射下的细胞毒性测试图。
51.图10为制备得到的ros敏感性纳米试剂的体内和体外荧光成像图。
52.图11为制备得到的ros敏感性纳米试剂在不同条件作用下对肿瘤生长抑制作用的曲线图。
53.图12为制备得到的ros敏感性纳米试剂在不同条件作用下对肿瘤生长抑制作用分离的肿瘤质量图。
54.图13为制备得到的ros敏感性纳米试剂在不同条件作用下对肿瘤生长抑制的肿瘤组织h&e和tunel染色图。
55.图14为制备得到的ros敏感性纳米试剂在体内组织(心：heart；肝：liver；脾：spleen；肺：lung；肾：kidney；肿瘤：tumor)h&e和tunel染色的毒理图。
具体实施方式
56.下面结合附图和具体实施例对发明详细说明，所述实施例用于帮助理解本发明，不应视为对本发明保护范围的限制。
57.仔细检查下，实施例的步骤必须与发明内容所述的步骤相一致；实施例中的原料
必须为发明内容中所述原料中的一种；实施例中的原料用量、时间温度等工艺参数必须在发明内容所述的数据范围以内！
58.(一)制备mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6
59.(1)mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6的合成过程如式(i)所示。首先，将1g甲氧基聚乙二醇胺(mpeg-nh2，平均分子量为5000)和1.0532g的blg-nca混合后溶于30ml无水二甲基甲酰胺中，反应溶液在氮气保护、30℃下搅拌反应72小时。反应结束后，将溶液倒入300ml乙醚溶液中，通过搅拌、沉降、过滤和真空干燥得到聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg)。
60.(2)将264mg二环己基碳二亚胺(dcc)和147mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)组合的缩合剂与636mg的ce6混合后溶于10ml无水二甲基亚砜(dmso)中，反应溶液在氮气保护、30℃下避光搅拌2小时，得到反应体系a。将1g的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg)溶解在10ml无水dmso中后滴加到反应体系a中，30℃下避光搅拌24h。最后，在避光条件下，在去离子水中(采用截留分子量3500的透析膜)透析72h，-50℃冷冻干燥得到光敏剂修饰的聚氨基酸主骨架(mpeg-b-pblg-ce6)。
61.(3)将0.5g的mpeg-b-pblg-ce6和0.4774g 2-羟基吡啶一起溶于10ml无水dmso中，随后加入2.013ml的乙二胺，该混合溶液在氮气保护、50℃下避光搅拌反应72小时。反应结束后，先在0.05mol/l的盐酸溶液中透析(截留分子量为3500的透析膜)72小时，然后再在去离子水中透析48小时后，-50℃冷冻干燥得到mpeg-b-p(ed)lg-ce6。
62.(4)将58mg的n'n-羰基二咪唑(cdi)和108mg花生四烯酸(aa)共同溶于6ml无水dmso中，在氮气、30℃下避光搅拌2h，得到反应体系c。把200mg的mpeg-b-p(ed)lg-ce6溶解在5ml无水dmso后，将其注入反应体系c，在氮气、30℃下避光搅拌24h。在去离子水中透析(用截留分子量1000的透析膜)72h后，-50℃冷冻干燥得到最终产物mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6。
[0063][0064]
利用核磁氢谱进行化学结构鉴定(参见图1)，结果证明，在3.41ppm和3.58ppm出现的特征峰属于mpeg，在2.01ppm、2.41ppm和2.92ppm的特征峰属于pblg主链，在7.32ppm和5.45ppm的特征峰属于aa，以上结果证明成功的合成了mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6。利用紫外吸收光谱进行光敏剂ce6负载的鉴定(参加图2)，如图所示，mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6在400nm、500nm和660nm的吸收峰完全与游离的ce6保持一致，这个结果说明了ce6成功接枝到mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6上。
[0065]
(二)制备ros敏感性纳米试剂(ppa@ce6)
[0066]
将20mg的mpeg-b-p(ed-aa)lg-ce6置于圆底烧瓶中，之后置入10ml无水氯仿，搅拌至全部溶解。所得混合溶液，在40℃抽真空条件下通过旋转蒸发去除氯仿，直至瓶内壁形成一层干燥的薄膜。然后，在烧瓶中加入去离子水(20ml)超声5分钟至全部分散。在去离子水中(用截留分子量30000的透析膜)透析24小时后，-50℃下冷冻干燥得到ros敏感性纳米试
剂。
[0067]
采用高清透射电子显微镜测定纳米试剂的形貌和粒径尺寸，结果指明所制备的纳米试剂呈均一的颗粒状，显示其粒径大约为50nm左右，证明成功制备ros敏感性纳米试剂(参见图3)。
[0068]
(三)评价ros敏感性纳米试剂在羟基自由基(
·
oh)作用下单线态氧产生的性能
[0069]
将制备好的ros敏感性纳米试剂分别分散在含有和不含有氯化亚铁(fecl2)和过氧化氢(h2o2)的去离子水溶液中(在含有fecl2和h2o2的溶液中，fecl2和h2o2的浓度均为100μm，ros敏感性纳米试剂的浓度均为1mg/ml)通过fecl2与h2o2发生fenton反应产生的羟基自由基来模拟细胞内环境中的ros)，加入单线态氧绿色荧光探针(sosg，1μm)后，选用660nm激光器照射(功率：50mw/cm2)，随后采用荧光分光光度计在525nm处测定荧光强度。结果显示所制备的ros敏感性纳米试剂在含有羟基自由基的溶液中能够加强单线态氧的生成，说明所制备的纳米试剂在活性氧的存在下可以激活光敏剂产生更多的单线态氧(参见图4)。
[0070]
(四)评价ros敏感性纳米试剂消除肿瘤细胞内gsh的能力
[0071]
将hepg2肿瘤细胞以1
×
104个/孔接种于96孔板中，当细胞完全伸展后，用ros敏感性纳米试剂孵育细胞4小时后，细胞用pbs洗涤，随后用660nm的laser辐射15分钟(功率：100mw/cm2)，最后再分别孵育1小时、2小时和4小时，并且用无纳米试剂处理的细胞作为参照组，无激光照射的作为对比组，随后收取细胞，并悬浮在pbs溶液中，超声处理。然后依照gsh检测试剂的使用说明去测定不同时间点的gsh含量。结果显示在无光照射条件下，gsh浓度稍为降低，说明aa可能被羟基自由基氧化成了脂质过氧化物而成为一种新的活性氧，来消耗gsh；对比在激光照射条件下，gsh含量明显减低，说明产生的单线态氧可以更好的消除gsh。而且在4小时后gsh含量还明显低于对照组，说明了ros敏感性纳米试剂具有较强的肿瘤细胞内消除gsh的能力(参见图5和6)。
[0072]
(五)评价ros敏感性纳米试剂对肿瘤细胞内gpx4活性的抑制能力
[0073]
将hepg2肿瘤细胞以1
×
104个/孔接种于96孔板中，当细胞完全伸展后，用ros敏感性纳米试剂孵育细胞4小时后，细胞用pbs洗涤，随后用660nm的laser辐射10分钟(功率：100mw/cm2)，无激光照射的作为对比组，再孵化12小时后，收取细胞，并悬浮在pbs溶液中，超声处理。然后依照谷胱甘肽过氧化物测定试剂盒的使用说明去测定gpx4的活性。结果显示ros敏感性纳米试剂在光的照射下能更明显的抑制gpx4的活性(参见图7)。
[0074]
(六)评价ros敏感性纳米试剂对肿瘤细胞内gpx4活性的抑制能力
[0075]
将hepg2肿瘤细胞以1
×
104个/孔接种于96孔板中，当孵育24小时后，细胞分别用ros敏感性纳米试剂和游离的ce6(freece6)(ce6浓度设置为0.5、1、2、4和8μg/ml)处理，孵育细胞4小时后，更换细胞培养液，超声处理，用660nm的laser辐射20分钟(功率：100mw/cm2)，无激光照射的作为对比组。再孵育24小时后。用cck-8检测细胞毒性，结果显示在没有laser照射下，ros敏感性纳米试剂没有明显的细胞毒性，而光照之后，ros敏感性纳米试剂显示了明显的细胞毒性，且细胞毒性随ce6的浓度增加而增强(参见图8和9)。
[0076]
(七)评价ros敏感性纳米试剂的肿瘤聚集能力
[0077]
取体重为25g左右的babl/c雌性裸鼠5只，皮下接种hepg2肿瘤细胞，当肿瘤增长到100mm3左右时，经尾部静脉注射ros敏感性纳米试剂(ce6：2mg/kg)，之后用小鼠体内荧光系统检测不同时间点小鼠体内荧光成像情况，24小时成像后，牺牲小鼠，剥离肿瘤和其它主要
器官(心：heart，肝：liver，脾：spleen，肺：lung，肾：kidney)并进行荧光成像分析。结果显示ros敏感性纳米试剂能够通过被动靶向有效的聚集在肿瘤细胞(参见图10)
[0078]
(八)评价ros敏感性纳米试剂的肿瘤抑制效果及生物安全性评估
[0079]
取体重为25g左右的babl/c雌性裸鼠25只，皮下接种hepg2肿瘤细胞，当肿瘤增长到100mm3左右时，随机分为5组(分别为saline作为对照组、游离的ce6+laser、游离的aa、ros敏感性纳米试剂(ppa@ce6)和ppa@ce6+laser)。freece6、freeaa和ppa@ce6分别经尾部静脉注射(ce6：5mg/kg)，注射24小时后，freece6和ppa@ce6组用激光照射30分钟(功率：0.25w/cm2)，每隔3天对小鼠的肿瘤体积用游标卡尺测量，治疗21天后，牺牲小鼠，分离体内荧光系统检测不同时间点小鼠体内荧光成像情况，24小时成像后，牺牲小鼠，分离肿瘤和其它主要器官(心：heart，肝：liver，脾：spleen，肺：lung，肾：kidney)并对分离的肿瘤进行称量，而肿瘤组织进行h&e和tunel染色。结果指明ros敏感性纳米试剂能够高效的抑制肿瘤增长(参见图11，12和13)。此外，对其它主要器官也进行了h&e和tunel染色，以此来评估生物安全性，结果如图14显示，ros敏感性纳米试剂对其它主要器官组织，并没有引起明显的毒副作用，展现了良好的生物安全性。