mgst1抑制剂的应用及治疗肝癌药物混合物
技术领域：
：1.本发明属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本发明涉及耐药肿瘤的治疗领域。本发明提供了一种新的肿瘤耐药标志物：在肿瘤组织中高表达并导致肿瘤耐药的微粒体谷胱甘肽s-转移酶1(microsomalglutathiones-transferase1，mgst1)，将该蛋白作为靶点，可筛选针对该蛋白及其相关分子的治疗肿瘤耐药的药物。
背景技术：
：：2.肝癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，其具有早期诊断困难、恶性程度高、预后差的特点，全身系统地化疗是肝癌的主要治疗手段之一，然后，肝癌细胞化疗耐药性的出现成为治疗的主要障碍。因此，为了逆转肿瘤耐药、提高化疗疗效，本领域迫切需要通过多种方式研究肿瘤耐药的关键基因靶点，并根据这些靶点设计治疗肿瘤耐药的新药，从而引导肿瘤耐药靶向性治疗。3.微粒体谷胱甘肽s-转移酶1(mgst1)是一种膜蛋白，属于ii期解毒酶，可通过中和活性氧来保护细胞存活，其定位于内质网和线粒体膜外壁，保护线粒体膜免受脂质过氧化和氧化应激损伤。在许多癌症中发现了mgst1的异常表达，对于mgst1在癌症耐药方面的功能已有初步报道，mgst1过表达介导细胞淋巴瘤对盐酸苯达莫司汀的耐药性(t.takimoto-shimomura,h.nagoshi,s.maegawa,establishmentandcharacteristicsofanovelmantlecelllymphoma-derivedcelllineandabendamustine-resistantsubline,cancergenomicsproteomics15(3)(2018)213–223)，并保护mcf7细胞免受几种细胞抑制剂的影响，如氯苯丁腈、马法兰和顺铂等药物(k.johansson,m.ito,c.m.schophuizen,s.mathewthengumtharayil,characterizationofnewpotentialanticancerdrugsdesignedtoovercomeglutathionetransferasemediatedresistance,mol.pharm.8(5)(2011)1698–1708)。然而，mgst1在肝癌耐药中的作用尚不清楚。为了研究mgst1在肝癌耐药中发挥的作用，本发明采用基于质谱的定量蛋白质组学技术筛选和生物学功能研究，运用westernblotting、平板克隆形成、流式细胞术等方法检测mgst1对肝癌耐药细胞增殖及凋亡的影响。技术实现要素：4.本发明的目的是提供一种针对mgst1的抑制剂作为降低或消除肝癌耐药治疗的应用。5.为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案进行实现：6.本发明提供了抑制mgst1的方法，是通过抑制剂实现。7.进一步，所述抑制剂包括了：针对mgst1蛋白抑制的抗mgst1的抗体、针对mgst1编码序列的rna干扰分子或反义寡核苷酸。8.更进一步，所述抗mgst1的抗体，包括：对mgst1或其活性片段具有免疫活性，能够特异性识别并结合mgst1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体、多克隆抗体和具有免疫活性的抗体片段。9.本发明所述的针对mgst1编码序列的rna干扰分子，选自shrna、sirna、mirna、dsrna。10.进一步，所述的rna干扰分子sirna的优选序列为sirna1，正义链:11.5'-gcuuaugaguacugcaacutt-3'和反义链:12.5'-aguugcaguacucauaagctt-3'；sirna2,正义链:5'13.aguugcaguacucauaagctt-3'和反义链:14.5'-aauacaggaggccaauucctt-3'；sirna3,正义链:15.5'-ggauauggaguuacucuuutt-3'和反义链:16.5'-aaagaguaacuccauaucctt-3'。17.本发明所述的反义寡核苷酸，特异地与mgst1基因dna或mrna结合而抑制mgst1基因表达，在基因水平调控的分子药物，包括人工合成或体内表达的反义dna和反义rna。18.本发明所述的肝癌包括：原发性肝癌，继发性肝癌，以及原发性肝癌或继发性肝癌的离体培养细胞。19.进一步，原发性肝癌包括：肝细胞肝癌、肝内胆管癌，肝细胞癌混合肝内胆管癌；继发性肝癌包括：肠癌、胰腺癌转移胆囊癌、胆管癌。20.本发明所述的药物，包括：顺铂、吉非替尼、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、索拉非尼、西地尼布、帕唑帕尼、阿西替尼、瓦他拉尼、司马沙尼、舒尼替尼、雷莫芦单抗及阿柏西普。21.本发明中首次揭示了mgst1与肝癌耐药的密切关系，并提供了mgst1的抑制剂在制备降低或消除肝癌化疗耐药性的药物中的用途、其作为肝癌耐药标志物及其作为肝癌耐药预测、诊断以及药物设计和筛选的靶点的应用。本发明为克服肝癌耐药、提高疗效提供新的机理，为抗肝癌耐药提供新的靶点。附图说明22.图1.mgst1蛋白在肝癌索拉非尼耐药细胞hepg2-r中高表达；23.图2.sirna转染敲低mgst1蛋白表达水平；24.图3.平板克隆实验显示抑制mgst1表达提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性。具体实施方式25.下面结合具体实施例，具体阐述本发明。下列实施例中，索拉非尼耐药株hepg2-r按照文献方法构建(yeh,c.c.；hsu,c.h.；shao,y.y.；ho,w.c.integratedstableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(silac)andisobarictagsforrelativeandabsolutequantitation(itraq)quantitativeproteomicanalysisidentifiesgalectin-1asapotentialbiomarkerforpredictingsorafenibresistanceinlivercancer.molcellproteomics.14(6)(2015)1527-45.)；未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，如sambrook等人著，分子克隆：实验室指南(newyork：coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。所个细胞)至六孔板每孔中。48h后，细胞贴壁生长良好时，进行细胞转染。采用转染试剂盒lipofectaminernaimax进行转染，对照组转染sirnanc，实验组转染sirna1mgst1，实验操作及试剂用量参照转染试剂盒说明书即可。继续培养24h后分别加索拉非尼至终浓度0μm,8μm,继续培养细胞，观察细胞生长状态。7天左右进行结晶紫染色。采用体积浓度20％乙酸500μl溶解结晶紫20min，检测590nm处吸光值。44.结果显示，加索拉非尼0μm时，sirna1mgst1组敲低mgst1蛋白表达会抑制细胞的存活，促进凋亡，说明mgst1抑制细胞凋亡。随着索拉非尼药物浓度增加，sirna1mgst1组细胞存活率明显低于sirnanc组，每组差异均具有统计学意义(*p《0.05)(图3)，结果表明抑制mgst1表达提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性，提高索拉非尼药物对肝癌的治疗效果。45.实施例3.抑制mgst1表达提高肝癌耐药细胞对吉非替尼药物敏感性46.1.sirna设计47.根据mgst1基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成sirna2，并同时提供与mgst1基因无序列同源性的阴性对照sirna(sirnanc)。48.sirnanc49.正义链:5'-uucuccgaacgugucacgutt-3'50.反义链:5'-acgugacacguucggagaatt-3'51.sirna2mgst152.正义链:5'-ccacuguucugugcaaugatt-3'53.反义链:5'-aauacaggaggccaauucctt-3'；54.取生长良好且处于对数期的肝癌吉非替尼耐药细胞hepg2-sr细胞铺至六孔板，待细胞汇合率达50％时，采用脂质体lipofectamine2000为转染试剂，对照组转染sirnanc，实验组转染sirna2mgst1，实验操作参照lipofectamine2000试剂说明书即可。采用蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)检测蛋白质表达水平。mgst1抗体购自美国genetex公司，货号gtx114551。蛋白质印迹法结果显示实验组转染sirna2mgst1后，mgst1的表达水平相比于对照组降低(图2)，说明转染成功，sirna2mgst1可以实现mgst1的表达敲低。55.2.细胞转染和收集56.培养肝癌吉非替尼耐药细胞hepg2-sr细胞，生长良好时胰酶消化，培养基终止吹打，得细胞悬浮液，稀释后，六孔板每孔加2ml细胞液含105个细胞。48h后，细胞贴壁生长良好时，进行细胞转染。采用脂质体lipofectamine2000为转染试剂，sirnanc与sirna2mgst1各转染2μlsirna加至300μlopti-mem培养基，10μlrnai试剂加至300μlopti-mem培养基，吹打混匀30分钟后加入，转染6小时后换成正常培养基。24-48h后分别换液，加吉非替尼0μm,2μm,4μm,继续培养细胞48h，观察细胞生长状态。57.3.细胞凋亡检测58.加入100μl胰酶消化2min后收集细胞，3mlpbs清洗3次，离心收集细胞沉淀，采用美国bd公司细胞凋亡检测试剂盒(货号556547)，按照试剂盒说明书进行操作，使用1×bindingbuffer重悬细胞，5μlfitc加5μlpi避光染色15min，上机检测荧光强度，并进行统计学分析。59.结果显示，在加药吉非替尼终浓度0μm,2μm,4μm时，sirna2mgst1组细胞凋亡率为分别是(7.09±2.4)％，(14.38±2.6)％，(24.65±3.7)％，明显高于sirnanc组的凋亡率(4.69±2.1)％，(9.62±3.2)％，(17.25±3.4)％，结果表明抑制mgst1表达导致肝癌细胞对吉非替尼药物敏感性增加，提高吉非替尼药物对肝癌的治疗效果。60.实施例4.抑制mgst1表达提高肝癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶药物敏感性61.1.sirna设计合成62.根据mgst1基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成sirna2，并同时提供与mgst1基因无序列同源性的阴性对照sirna(sirnanc)。63.sirnanc64.正义链:5'-uucuccgaacgugucacgutt-3'65.反义链:5'-acgugacacguucggagaatt-3'66.sirna2mgst167.正义链:5'-ccacuguucugugcaaugatt-3'68.反义链:5'-aauacaggaggccaauucctt-3'；69.2.细胞转染和收集70.在10cm培养皿中培养肝癌耐药细胞bel-7402-5-氟尿嘧啶细胞，对数生长期时加入0.5ml胰酶消化2min，加入6mlrpmi1640培养基吹打细胞得到细胞悬液，计数稀释后，六孔板每孔加2ml细胞液(含104个细胞)。48h后，细胞贴壁生长良好时，进行细胞转染。采用转染试剂盒lipofectaminernaimax进行转染，对照组转染sirnanc，实验组转染sirna2mgst1，实验操作及实际用量参照转染试剂盒说明书即可。继续培养24h后分别加加5-氟尿嘧啶0μm,10μm,20μm,继续培养细胞48h，观察细胞生长状态。71.3.细胞凋亡检测72.加入100μl胰酶消化2min后收集细胞，3mlpbs清洗3次，离心收集细胞沉淀，采用美国bd公司细胞凋亡检测试剂盒(货号556547)，按照试剂盒说明书进行操作，使用1×bindingbuffer重悬细胞，5μlfitc加5μlpi避光染色15min，上机检测荧光强度，并进行统计学分析。73.结果显示，在5-氟尿嘧啶药物终浓度为0μm,10μm,20μm时，sirna2folr1组细胞凋亡率为(7.13±1.2)％，(18.95±2.9)％，(34.26±4.7)％，明显高于sirnanc组的凋亡率(3.96±1.8)％，(12.54±3.1)％，(19.76±3.6)％，结果表明抑制mgst1表达提高肝癌耐药细胞5-氟尿嘧啶药物敏感性，提高5-氟尿嘧啶药物对肝癌的治疗效果。74.综上所述，通过抑制肝癌耐药细胞中mgst1的表达，可以增强肝癌的化疗治疗效果。75.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12