一种用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物、验证方法与流程

[0001]
本发明属于中药组合物技术领域，尤其涉及一种用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物、验证方法。


背景技术：

[0002]
目前，鸡大肠杆菌病属于禽大肠杆菌病的一种，由禽致病性大肠埃希氏杆菌经口腔感染引起鸡的急性或慢性的细菌性传染病，病程常呈慢性或急性经过。在临床上鸡大肠杆菌病主要表现为多器官、多样化病变，最常见的是急性败血症和卵黄性腹膜炎。急性败血型主要病变是纤维素性心包炎、肝周炎、腹膜炎等。其他病变有卵黄性腹膜炎、输卵管炎、肠炎等脏器炎症，同时还可引起生殖器病变，导致死胚和孵化率低下。关节炎或足垫、肉芽肿、蛋黄囊炎、脐、全眼球炎、大肠杆菌性脑病、肿头综合征等也是常见症状。在病理学上禽大肠杆菌病的典型病变是胸腔、腹腔内的器官有纤维素性渗出物。根据不同病症病理组织切片常能观察到肝细胞变性，窦状隙内红细胞增多；肾小管上皮细胞脱离基底膜、坏死；肺表面的肺泡细胞塌陷，大量红细胞聚集在肺血管内。
[0003]
19世纪90年代首次报道了禽大肠杆菌病，随后世界养禽业发达国家和地区都有了关于该病不同病型的报道。中国首例禽大肠杆菌病是1982年在江苏省发现，目前几乎所有养禽省(区)市都有大肠杆菌病发生，其发生的广泛性不可忽视。
[0004]
大肠杆菌病从鸡胚到成年鸡均可感染，其中以幼龄鸡感染为主。主要传播源为患病动物和带菌者，通过粪便排出病菌，散布于外界，经消化道及呼吸系统侵入进而感染发病；同时病菌还会经过种蛋的裂缝使胚胎发生感染。最初人们认为多数分离自禽类的大肠杆菌血清型有较专一的致病性，只对禽类动物有致病作用，而不会感染其他动物和人。但是，现有技术1在2010年通过试验证明禽大肠杆菌可引起一些哺乳类动物患病，其中也包括人在内，这表明apec也是人兽共患病的一种潜在病原体。
[0005]
一般情况下，本病为生态性疾病，饲养管理不善易于诱发本病。呼吸道损伤、免疫抑制等病导致抵抗力下降及混合感染其他疫病等病原体感染使禽大肠杆菌病更易诱发。当鸡群中存在如鸡新城疫、支原体感染、葡萄球菌病等病毒性、细菌性及支原体性传染病时，常伴发大肠杆菌感染，且当其他病混合感染大肠杆菌时，发病率和死亡率都明显高于单一发病。有效防控禽大肠杆菌病将对其他疫病的控制起到积极的作用。大型集约化养殖场禽群密度过大、通风换气不良、饲料用具及环境消毒不彻底等因素也是加速本病流行的因素。不断增加的禽类新品种也是使禽大肠杆菌病的发生日趋严重的原因。当前在不少肉鸡场中几乎每批鸡都会发病，给养鸡业带来了严重的危害，大肠杆菌病已成为影响鸡群健康的首要细菌性疾病。因此，不论从对养禽业的危害还是对人类的影响上来说研究禽大肠杆菌都具有重要的公共卫生学意义。
[0006]
鸡感染致病性大肠杆菌而导致的大肠杆菌病给养鸡业带来了巨大的危害，究其导致鸡感染并发病的因素主要有以下几方面，包括有粘附素、毒素、外膜蛋白、铁转运系统等团。其中以粘附素和毒素为主。
[0007]
鸡致病性大肠杆菌主要包括的粘附因子有i型菌毛、p菌毛(i型菌毛对d-甘露糖敏感，简称msha，p型菌毛使菌体对d-甘露糖具有抗性，简称mrha)，curli菌毛和自动转运蛋白温度敏感血凝素(tsh)。其中致病性大肠杆菌在鸡的气管和气囊等处可表达对d-甘露糖敏感的i型菌毛。msha菌毛通过与上皮细胞膜上特异性碳水化合物受体相结合，从而吸附于鸡的气管、喉头等部位的上皮细胞上，同时可在一定程度上抵抗血清的杀菌作用。p菌毛在大肠杆菌在动物内脏器官的定植方面则起到了相当重要的作用固。在消化系统感染中，产肠毒素性大肠杆菌(etec)侵入宿主后，其钻附于小肠粘膜上皮细胞绒毛边沿的受体上也是依靠菌毛才得以实现的。经钻附定居后，菌毛发挥空间阻遏作用，使菌体不会因为肠蠕动、气管内纤毛摆动等作用而排除，随后菌体开始大量繁殖，同时分泌毒素造成机体细胞损伤，从而引起腹泻脱水等一系列症状。此类大肠杆菌如失去生成菌毛的能力，会严重破坏其致病机理，使其丧失致病性。由此可见，在引发大肠杆菌病的过程中菌毛起到了非常重要的作用。curli菌毛与细菌连接细胞外基质蛋白及细菌在外界环境中存活有关，tsh其由质粒编码，在apec感染早期的定植中具有重要作用国。
[0008]
大场杆菌可产生外毒素及内毒素，其中外毒素包括耐热肠毒素、不耐热肠毒素两种肠毒素及大肠杆菌素，禽大肠杆菌主要产生的是耐热肠毒素(st)，其检出率要高于不耐热肠毒素(lt)。在研究鸡、火鸡的大肠杆菌致病因子时还发现了vero毒素。毒素作用与细菌的致病作用有协同效应，可引起鸡多组织损伤。大肠杆菌的内毒素对家禽也有不同程度的致病作用，可引起发热、白细胞渗出及白细胞穿越内皮细胞等多种生物学效应。现有技术1证明内毒素可引起产蛋鸡急性死亡，其症状主要为出血性坏死和血管内凝血。现有技术2给鸡注射自制的内毒素，试验中的鸡出现精神萎靡，缩颈低头，翅膀下垂等现象，血象指标显示鸡体内血清白蛋白含量升高，纤维蛋白原及红细胞数值降低。剖检后可见主要的病理变化为心包炎和心包积液等，组织切片显示心脏和肝脏出现淋巴细胞浸润现象，后期则可见到血管内皮细胞肿胀、变性、坏死和脱落，心肌细胞、肝细胞变性，坏死等现象。
[0009]
目前，抗菌药物和大肠杆菌疫苗是防治禽大肠杆菌病的重要手段，其在养殖业上广泛使用，极大地促进了畜牧业规模化、集约化的发展。但抗生素大量持续的使用造成了畜禽产品中严重的药物残留现象和耐药菌的大量产生。
[0010]
对于消费者，抗菌药物残留会引起消费者的急、慢性中毒，还有可能引发过敏反应。人类胃肠道内的正常菌群也会受到抗生素残留的不良影响，残留的抗生素会导致部分敏感菌受到抑制或被杀死，这将使得胃肠道内菌群失调。从而会导致一些条件致病菌或体外病原乘机侵入，引发疾病。
[0011]
对于生态平衡，由于抗菌药的反复使用，病原微生物对其产生抗药性，出现耐药株，导致以往高效的药物变为低效药物。近年来西方医学在防治禽大肠杆菌病的过程中发现，大肠杆菌对药物极易产生抗药性，伴随着抗菌西药临床使用的不规范，大肠杆菌的耐药谱越来越宽，耐药菌株不断出现。不但对抗单种抗生素的能力变强，还出现了大量多重耐药菌。随着大肠杆菌的抗药谱不断加宽，过去常用的一些抗菌药物对于禽大肠杆菌病已失去了治疗作用，如链霉素、庆大霉素、氯霉素等抗生素已成为许多地区养禽场的禁用药物。根据临床治疗效果显示，目前丁胺卡那霉素、环丙沙星、氟呱酸等药物对大肠杆菌抑制作用最强，庆大霉素、痢特灵、卡那霉素、恩诺沙星、氯霉素等作用中等，青霉素的抑菌作用最低。中国兽医药品监察所曾对其保存的大肠杆菌进行了药敏试验，发现大肠杆菌的耐药性发展势
头非常严重。从20世纪50年代基本上不存在耐药性问题到90年代竟然有87％的菌株同时对5种以上的抗菌素有耐药性。这将对环境造成极大的危害，同时随着疫病防治形势的目趋严重，用药情况愈加复杂，菌株的耐药性会更加广泛。
[0012]
为了尽量减少大肠杆菌耐药菌的出现，免疫接种就成为预防禽大肠杆菌病较好的办法，现在主要应用的疫苗有灭活疫苗、亚单位疫苗和活疫苗。灭活疫苗根据佐剂的不同还可以分为油乳剂疫苗、蜂胶灭活苗等。
[0013]
对于灭活疫苗由于禽致病性大肠杆菌的血清型很多，引起不同地区不同鸡场发病的血清型都不相同，所以菌体灭话苗距达到完全抵抗我国复杂的禽大肠杆菌病病情还有很远的距离。同时在给成年鸡注射大肠杆菌油佐剂苗时，注苗后鸡群有程度不同的注苗反应，主要表现精神不好，喜卧，吃食减少等，在开产后注苗往往会影响产蛋。
[0014]
亚单位疫苗的制作原理是利用菌毛是e.coil的重要致病因子，其能使苗体钻附在细胞表面，同时，由于大肠杆菌的菌毛抗原是一种可以被免疫系统所识别的特异蛋白质，因此其在大肠杆菌病的预防方面有着重要意义。自从1973年证明大肠杆菌菌毛有良好的抗原性以后，研究者相继研制了不同种应对禽致病性大肠杆菌的菌毛苗，现有技术3提取大肠杆菌o1菌毛研制成单价和多价菌毛油佐剂灭活苗，免疫鸡后能相应的抵抗大肠杆菌o1型的攻击。现有技术4也研制出具有一定免疫原性的禽大肠杆菌菌毛疫苗。当前还有利用基因工程技术生产出的钻附性疫苗，给防制幼畜大肠杆菌腹泻带来了新的前景。但是因为禽大肠杆菌血清型太过复杂，所以当前禽大肠杆菌的基因工程疫苗尚未见报道，同时这也和饲养者愿意付出的防治成本有关。
[0015]
用弱毒菌苗来预防鸡大肠杆菌病并不常见，但也确有弱毒菌苗研究成功的报道。现有技术4分别用非致病性大肠杆菌菌株(bt-7)、非致病性菌株(j5)制成活疫苗，现有技术5则选择了大肠杆菌o2血清型，通过原生质体融合技术成功地培育出具有双抗性及双抗原性的融合双价弱毒菌苗，通过实验证明这些疫苗都有良好的保护效果，但是对于活苗的应用有害怕会带来新污染的顾虑。
[0016]
生物信息学、蛋白质组学、基因组学等高新技术随着科学的进步都将综合运用在疫苗研发方面，这必将取得新的进展，可以鉴定出更多合适的候选菌苗株。然而，部分优势apec血清型如o1，o2和o
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等，这些菌株在不同感染阶段的感染机制是不同的，这将是设计和研发交叉保护菌苗必须克服的一大障碍。
[0017]
其他治疗禽大肠杆菌的方法还有很多，包括益生菌制剂疗法等。因为抗生素在抑制细菌的同时也抑杀了鸡体内的正常的微生物，导致动物体菌群失调。目前常将乳酸菌，酵母菌、放线菌，双歧杆菌等微生态制剂添加与饲料内以调整机体内的微生物平衡，提高鸡群的抗病力，治疗由大肠杆菌引起的菌群失调所致的腹泻。
[0018]
当前越来越受到关注的治疗方法是使用中药或者采用中西药结合手段。现在已开发出了很多单方中草药、单方草药提取物还有很多是根据中医传统理论进行配伍的中草药复方，这些中兽药都取得了非常好的效果。
[0019]
首先中(兽)医自古对于传染病的防治就是非常重视的，张仲景的《伤寒论》就是针对传染病的。其次中兽医是通过“扶正”、“固本”来达到“祛邪”目的，即中兽药是通过提高机体的免疫力，阻断细菌毒素对机体的伤害，来实现治疗目的，故在理论上不易诱生耐药菌。再次，中医以治未病为主，防病于未然，可以根据疾病发生、发展、转化的规律采取使疾病朝
正向逆转的措施。最后中兽药是在中(兽)医学理论指导下研发、使用的，历经千年是具有很高安全性的。
[0020]
现代对于单味中药和中药复方的抗菌抑菌作用的研究在不断深入。近年来关于用中药防治动物传染病发表的文章也不计其数，有报道说仅《中国兽医杂志》一本杂志在2004-2006两年期间就发表了316篇相关文章。目前中兽药应用领域非常广泛，从常见的猪、禽、牛、羊、马等经济动物，到犬、猫、兔等家养宠物再到狮、虎、猴、狐、貉、小熊猫等观赏动物，不过还是以猪、牛、羊和禽等经济动物为主。涉及的疫病种类也有很多，其中二、三类传染病都有涉及，具体包括猪瘟、鸡新城疫、狂犬病、炭疽、布鲁氏菌病、巴氏杆菌病、大肠杆菌病等。
[0021]
中医治疗传染病不但是对细菌起到抑制和杀灭作用，更重要的是强调整体观念和辨证论治，而非“头疼医头，脚疼医脚”。在治疗时更强调标本兼治，整体用药，调整机体状态，促进正常或免疫机能低下的动物免疫器官发育，提高自身免疫力。此外，中药对耐药菌株的耐药性具有一定的消除作用，目前发现可以消除耐药质粒的中药多以清热、解毒和燥湿类药物为主，常用的有大黄、金银花、黄答、黄连、黄柏等，主要作用是消除大肠杆菌的r质粒。同时中药还可以减轻内毒素和炎症对机体的损伤。这些因素综合提高了中药抵抗病原的作用。
[0022]
鸡大肠杆菌的血清型众多，引起的鸡大肠杆菌病的临床表现也是多种多样的，如食欲下降、精神沉郁、拉稀等症状，剖检多见纤维素性肝周炎、心包炎，还可见腹膜炎、气囊炎、脐炎、眼炎和大肠杆菌肉芽肿等病变。中兽医认为其属于瘟疫的范畴。中兽医的辨证论治理论认为禽大肠杆菌病是由疫毒内侵、肺胃热盛、血淤气滞而引起的。当鸡群受到应激、营养不良或感染其他疾病导致免疫力下降时，会引起自身正气不足、营卫不固，使外邪有机可乘，造成疫毒入侵，引起鸡体温升高、食欲下降、精神沉郁、羽毛松乱。外界各种环境条件的变化会促进该病的发生。病初，病邪主要在表，在皮毛，病鸡症状最轻，病势最浅，属卫分证，症状为羽毛蓬乱，精神萎钝，该期较为短暂；在本期的治疗上，以培本固源、补气养血为主，以解表逐邪、清热解毒为辅。如果此时不能够很好的抑制病情，病邪便会随气血入里，进入五脏六腑，如肺、肠、心、肝等，临床表现为气喘、下痢、口渴烦饮、食欲废绝等；最终造成血淤气滞、热毒童积、阴阳俱损。此时解剖可见到心包炎、肝周炎和肠炎等病变。此时，病在里，在脏腑。治疗上应以燥湿解毒、活血化淤、清热生津为主，以健脾养胃、行气利水、养阴止痢为辅。根据禽大肠杆菌的具体症状，在中兽医的辨证论治理论下，欲治疗大肠杆菌病，应选择清热解毒、活血散淤、涩肠止泻的药物。
[0023]
在防治鸡大肠杆菌病的研究中，多味中药及中药复方经证明对鸡大肠杆菌病具有良好的防治作用。其中以清热解毒类中药为主，常见的单味抗菌中药有诃子、黄答、大黄、石榴皮、黄连、乌梅、白头翁、白术、穿心莲、板蓝根、连翘、黄柏、黄茂、大青叶等。现有技术6公开对大肠杆菌有较好抑制作用的中药有大蒜、黄连、黄答、连翘、大黄等；现有技术7公开黄连、赤芍、生大黄、虎杖、连翘、败酱草次之，甘草、丹参、积实等均具有一定的抗菌作用，其中黄连、赤芍抗菌作用最强。
[0024]
现有技术8利用中草药速效杆康(又叫白头翁散，主要成分为白头翁、秦皮、黄柏、黄连等)和金方消毒散(主要成分为黄答、板蓝根、连翘、黄连、柴胡等)治疗福建省浦城县发生的鸡大肠杆菌病，取得了很好的效果。证明白头翁、黄连、黄柏等中药可以清热解毒，凉血
止痢对治疗大肠杆菌病具有一定的效果。
[0025]
现有技术9提取了白头翁的有效成分白头翁皂普，并以其为授试药物进行了体外抑菌杀菌实验，实验中以白头翁和金霉素为对照药物，显示皂普以及金霉素对大肠杆菌的生长均有明显的抑制作用，且它们的抑菌效果随着浓度的增加而增强。3种药物对大肠杆菌的抑菌作用中以白头翁为最强，金霉素其次，白头翁皂普最低。这提示了白头翁单味药物对大肠杆菌有一定的抑制和杀灭作用。
[0026]
现有技术10以白头翁、黄茂、黄柏、地榆、当归、丹皮、桅子、木通、金银花等中药配伍成中药复方，选择庆大霉素、乳酸环丙沙星、强力霉素为对照西药，通过对实验室感染大肠杆菌病和自然感染大肠杆菌病的治疗证明以白头翁为主的中药复方对大肠杆菌病有一定的治疗作用。
[0027]
现有技术11利用白头翁15克、黄连9克、黄柏9克、当归12克、木香9克、甘草9克、苦参12克、大青叶巧克，穿心莲6克组成复方，对于天然感染的乌骨鸡大肠杆菌病治疗起到一定作用。提示白头翁、黄连、黄柏、大青叶的配伍对治疗禽类大肠杆菌病有一定的疗效。
[0028]
食品安全隐患已成为世界各国政府和人民广泛关注的政治性问题。各个国家在对动物源性食品进行进出口检验时，对于抗生素及大肠杆菌残留量都有着严格的规定。如果不能很好地控制大肠杆菌病，尽可能减少药物残留，不但会影响养禽业的发展，更会影响我国农业经济的发展。
[0029]
禽大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏杆菌经口腔感染引起的急性或慢性的禽类细菌性传染病，日龄不同的鸡只感染后可表现体温升高、剧烈腹泻、关节滑膜炎、输卵管炎或腹膜炎等症状，可造成养鸡业的严重损失。
[0030]
尽管抗生素仍是防治鸡大肠杆菌病的重要手段，但由于耐药株出现、耐药谱变宽和药物残留等严重问题，直接影响到动物产品的安全与卫生，影响人类的身体健康和生存环境。
[0031]
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有抗生素治疗鸡大肠杆菌导致耐药性、耐药谱变宽和药物残留等严重问题；同时现有中药治疗鸡大肠杆菌并不能有效、全面的进行预防与治疗，且成本高。


技术实现要素：

[0032]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物、验证方法。
[0033]
本发明是这样实现的，一种用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物，所述用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物为白连散；
[0034]
所述白连散浓度为给药浓度1.5g/kg-bw。
[0035]
进一步，所述白连散包括白头翁、黄连、黄岑、大青叶、石榴皮、诃子、山楂。
[0036]
本发明的另一目的在于提供一种所述用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用。
[0037]
进一步，所述中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用包括：将所述中药组合物制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂的任一种剂型，并口服。
[0038]
本发明的另一目的在于提供一种验证所述中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药
物中的应用的验证方法，所述中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用的验证方法包括：
[0039]
于感染禽大肠杆菌药物的鸡服用所述中药组合物后进行无菌心脏采抗凝血，分离外周血单个核细胞，以流式细胞术检测外周血单个核细胞表面的分子动态变化；同时应用mts法检测外周血下淋巴细胞在cona刺激下的增殖情况，验证所述中药组合物对鸡免疫系统的影响。
[0040]
进一步，所述中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用的验证方法包括以下步骤：
[0041]
步骤一，制备外周血单个核细胞；将制备的外周血单个核细胞即pbmc用2％1640细胞培养液悬浮，调整浓度到1
×
106个/ml，加入相应的抗体，并做对照；
[0042]
步骤二，加入抗体后，震荡混匀，避光室温孵育30分钟，1500r/min离心5min后去除上清，加1m1 pbs混匀进行上机鉴定；
[0043]
步骤三，利用mts法检测t淋巴细胞增殖；同时确定对鸡消化道siga分泌的影响；
[0044]
步骤四，对步骤一至步骤三的数据进行分析处理，基于外周血单个核细胞中表面分子动态变化、t淋巴细胞增殖情况以及对鸡消化道siga分泌的影响验证所述中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用。
[0045]
进一步，步骤一中，所述外周血单个核细胞制备方法包括：
[0046]
(1)在感染后3、7、15天服用所述中药组合物的鸡心脏采血约l0ml，edta抗凝，以2:1加入淋巴细胞分离液及抗凝血，1500转/分钟，离心20分钟；
[0047]
(2)吸取中间乳白色淋巴细胞层加入5倍体积的2％rpmi 1640混匀，1500转/分钟，离心10分钟，去除上清，沉淀用红细胞裂解液悬浮，室温1分钟，1000转/分钟，离心10分钟；
[0048]
(3)去除上清，沉淀以2％rpmi 1640悬浮，1500转/分钟，离心10分钟，重复洗涤一次，沉淀以2％rpmi 1640悬浮，1500转/分钟，10分钟10％rpmi 1640悬浮淋巴细胞，用台盼蓝计数，将细胞用10％1640配成1
×
106个/ml浓度的悬浮液，为外周血单个核细胞即pbmc。
[0049]
进一步，步骤三中，所述利用mts法检测t淋巴细胞增殖包括：
[0050]
取96孔细胞培养板，每孔加入以10％无酚红1640培养液悬浮的pbmc 100μl，浓度为2
×
106/m l，设置两个实验组，一个对照组，实验组pbmc中加入终浓度为10mg/m l的cona，对照组加入无酚红1640培养液，每组各3个重复孔，于5％co2，37℃培养3天，每孔加入20μlmts和pms的预混液，370c孵育4h，取出后置490nm波长的酶标仪中检测od
490
；
[0051]
其中，si＝(od
刺激组-od
空白对照
)/(od
细胞对照-od
空白对照
)。
[0052]
进一步，步骤三中，所述确定对鸡消化道siga分泌的影响包括：
[0053]
获取鸡肠粘膜200μl，用1mipbs吹打混匀，6000r/min离心15min，取上清液作为待检液，4℃保存，利用elisa试剂盒进行检测，并用curve expert 14制作标准曲线。
[0054]
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明选取白头翁、黄连、大青叶等清热解毒、凉血、燥湿的药物为主，涩肠止泻、活血散淤的药物为辅组成，具有清热解毒、凉血、止痢等功效，对治疗鸡大肠杆菌病有一定作用。
[0055]
本发明从药效学、治疗效果及其对机体免疫功能影响等方面，系统地分析其对鸡大肠杆菌病的作用机理，为开发新中兽药用于鸡大肠杆菌病治疗提供可靠实验数据。本发明白连散对于鸡大肠杆菌病有一定的治疗效果；可以提高生产性能，增强机体免疫力，为鸡
大肠杆菌病的防治提供了新的选择。
[0056]
本发明白连散以白头翁汤为基础，其中主要含有白头翁、黄连、大青叶等几味中药。白头翁苦寒，归大肠经，有清热解毒、凉血、明目、消赘的功效，为治痢之要药；黄连味苦，性寒，归于胆、胃、大肠经，偏于入心，性燥，为心胃之剂，能清热燥湿，泻火解毒，可治肠辟、下痢等湿热为患之疾；大青叶苦大寒，清热凉血，解毒消斑，泻火，散癖止血，治肠炎。
[0057]
本发明的白连散对鸡大肠杆菌o2型确有一定的杀灭作用，同时具有一定的抗炎、止泻、止痛、促进肠内容物推进的药效学作用。对临床鸡大肠杆菌病具有一定的治疗作用，综合各项试验实验结果显示推荐剂量(既中剂量，给药浓度1.5g/kg-bw)。可有效减少鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率，提升动物生产性能，减轻临床症状及组织的病理损伤。在免疫学方面白连散可以通过提高机体内淋巴细胞数量及活性，增加肠粘膜siga分泌量等一系列复杂变化，提高动物机体自身的免疫力。通过以上试验证明白连散可以有效治疗禽大肠杆菌病，为后续的生产推广提供了有效的科学依据。
附图说明
[0058]
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0059]
图1是本发明实施例提供的中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用的验证方法流程图。
[0060]
图2是本发明实施例提供的中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用的验证方法原理图。
[0061]
图3是本发明实施例提供的采食量示意图。
[0062]
图4是本发明实施例提供的体重增重量示意图。
[0063]
图5(a)是本发明实施例提供的空白对照组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0064]
图5(b)是本发明实施例提供的阴性对照组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0065]
图5(c)是本发明实施例提供的西药组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0066]
图5(d)是本发明实施例提供的白连散预防组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0067]
图5(e)是本发明实施例提供的白连散高剂量组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0068]
图5(f)是本发明实施例提供的白连散中剂量组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0069]
图5(g)是本发明实施例提供的白连散低剂量组肝脏的组织病理变化(he染色)示意图。
[0070]
图6是本发明实施例提供的外周血单个核细胞(pbmc)中b细胞和t细胞数量的动态变化示意图。
[0071]
图7是本发明实施例提供的t淋巴细胞增殖情况示意图。
[0072]
图8是本发明实施例提供的siga分泌量标准曲线及变化图。
具体实施方式
[0073]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0074]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0075]
本发明实施例提供的用于治疗禽大肠杆菌的中药组合物为白连散；所述白连散浓度为给药浓度1.5g/kg-bw。
[0076]
本发明实施例提供的白连散包括白头翁、黄连、黄岑、大青叶、石榴皮、诃子、山楂。
[0077]
本发明实施例提供的中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用包括：将所述中药组合物制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂的任一种剂型，并口服。
[0078]
本发明实施例提供的中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用的验证方法包括：
[0079]
于感染禽大肠杆菌药物的鸡服用所述中药组合物后进行无菌心脏采抗凝血，分离外周血单个核细胞，以流式细胞术检测外周血单个核细胞表面的分子动态变化；同时应用mts法检测外周血下淋巴细胞在cona刺激下的增殖情况，验证所述中药组合物对鸡免疫系统的影响。
[0080]
如图1所示，本发明实施例提供的中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用的验证方法包括以下步骤：
[0081]
s101，制备外周血单个核细胞；将制备的外周血单个核细胞即pbmc用2％1640细胞培养液悬浮，调整浓度到1
×
106个/ml，加入相应的抗体，并做对照；
[0082]
s102，加入抗体后，震荡混匀，避光室温孵育30分钟，1500r/min离心5min后去除上清，加1m1 pbs混匀进行上机鉴定；
[0083]
s103，利用mts法检测t淋巴细胞增殖；同时确定对鸡消化道siga分泌的影响；
[0084]
s104，对步骤s101至步骤s103的数据进行分析处理，基于外周血单个核细胞中表面分子动态变化、t淋巴细胞增殖情况以及对鸡消化道siga分泌的影响验证所述中药组合物在制备治疗禽大肠杆菌药物中的应用。
[0085]
步骤s101中，本发明实施例提供的外周血单个核细胞制备方法包括：
[0086]
(1)在感染后3、7、15天服用所述中药组合物的鸡心脏采血约l0ml，edta抗凝，以2:1加入淋巴细胞分离液及抗凝血，1500转/分钟，离心20分钟；
[0087]
(2)吸取中间乳白色淋巴细胞层加入5倍体积的2％rpmi 1640混匀，1500转/分钟，离心10分钟，去除上清，沉淀用红细胞裂解液悬浮，室温1分钟，1000转/分钟，离心10分钟；
[0088]
(3)去除上清，沉淀以2％rpmi 1640悬浮，1500转/分钟，离心10分钟，重复洗涤一次，沉淀以2％rpmi 1640悬浮，1500转/分钟，10分钟10％rpmi 1640悬浮淋巴细胞，用台盼蓝计数，将细胞用10％1640配成1
×
106个/ml浓度的悬浮液，为外周血单个核细胞即pbmc。
[0089]
步骤s103中，本发明实施例提供的利用mts法检测t淋巴细胞增殖包括：
[0090]
取96孔细胞培养板，每孔加入以10％无酚红1640培养液悬浮的pbmc 100μl，浓度为2
×
106/m l，设置两个实验组，一个对照组，实验组pbmc中加入终浓度为10mg/m l的cona，对照组加入无酚红1640培养液，每组各3个重复孔，于5％co2，37℃培养3天，每孔加入
20μlmts和pms的预混液，370c孵育4h，取出后置490nm波长的酶标仪中检测od
490
；
[0091]
其中，si＝(od
刺激组-od
空白对照
)/(od
细胞对照-od
空白对照
)。
[0092]
步骤s103中，本发明实施例提供的确定对鸡消化道siga分泌的影响包括：
[0093]
获取鸡肠粘膜200μl，用1mipbs吹打混匀，6000r/min离心15min，取上清液作为待检液，4℃保存，利用elisa试剂盒进行检测，并用curveexpert14制作标准曲线。
[0094]
下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
[0095]
实施例1：
[0096]
1.1、研究内容
[0097]
药效学研究
[0098]
以小鼠等实验动物为研究对象，对不同剂量的白连散制剂进行体外抑菌/杀菌实验、抗二甲苯致大鼠足趾肿胀实验、抑制二四二硝基苯酚的致热效应、缓解冰醋酸致小鼠腹痛实验以及对比中西医止泻效果等，从药效学角度明确其对禽大肠杆菌病的预防与治疗作用。
[0099]
1.2、临床治疗实验
[0100]
将210只21日龄spf鸡分成7组，每组30只，分别为空白组、阳性组、西药对照组、预防组、白连散高、中、低剂量组。其中预防组于攻菌前3天灌喂推荐剂量中药药液，然后与其余组一起经口服途径感染大肠杆菌。根据分组不同，分别给予不同剂量的中药或西药予以治疗。通过临床指标(采食量、增重、体温、死亡率、治愈率)观察，判断该组方的临床效果。
[0101]
1.3、对相关免疫功能的影响
[0102]
分别在感染后3，7，15天心脏采血分离外周血淋巴细胞，应用mts试剂盒检测外周血中淋巴细胞的增值变化情况；应用流式细胞术，检测外周血淋巴细胞中cd3/4/8，bu-1的动态变化，以揭示大肠杆菌感染及药物治疗后机体免疫功能的变化。
[0103]
在感染后7，15天刮取肠粘膜，应用elisa法测定siga分泌量，以探索白连散对感染大肠杆菌后鸡的粘膜免疫功能的影响。
[0104]
1.4、研究目标
[0105]
通过药效学、实验室及临床治疗试验等一系列实验，证明白连散能成为对原有抗生素的一种有效替代药品，使其成为治疗禽大肠杆菌病的新途径；观察研究免疫学指标变化情况，以研究其治病机理，为禽大肠杆菌的预防与治疗奠定一定的理论依据。
[0106]
第二章白莲散的药效作用
[0107]
摘要：为验证白连散的药效作用，就其体外最低抑菌(mic)与杀菌浓度(mbc、抗炎、止泻、止痛、肠内容物推进作用进行研究。结果显示，该组方对大肠杆菌mic为1：23，生药含量为125mg/ml；mbc为1：22，生药含量为250mg/ml；对二甲苯刺激导致的大鼠炎性反应有抗炎作用，剂量为1.5g/kg
·
bw；连续饲喂小鼠3天，剂量为0.75g和1.5g/kg
·
bw时对番泻叶造成的小鼠腹泻有治疗作用，剂量为0.75,1.5，3.0g/kg
·
bw，对冰醋酸造成的小鼠腹痛有止痛效果；1.5g/kg
·
bw剂量可提高小鼠肠内容物推进率。综上表明，此组方具有一定的杀菌、抗炎、止泻、止痛、催进肠内容物推进的效果。
[0108]
2.2材料
[0109]
2.2.1实验动物、药品和菌种
[0110]
实验动物：spf级sd大鼠和spf级昆明小鼠，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责
任公司(动物生产许可证编号：xcxk(军)2007-0001)。sd大鼠体重为180-200g之间，小鼠体重为30g左右。
[0111]
实验白连散，河北科星药业有限公司中试产品，生产批号：20110602。含生药1.0g/ml；大肠杆菌菌株o2，批号c83863，购自中国兽医药品监察所；番泻叶煎剂：番泻叶，购自北京同仁堂。番泻叶用沸水稍煎lomin，制成0.3g/ml浓度煎剂，冷却后使用。
[0112]
2.2.2主要化学试剂
[0113]
营养肉汤、营养琼脂购自北京奥博星生物科学技术有限公司
[0114]
活性炭：购自北京广泰伟业科技有限公司
[0115]
冰醋酸、二甲苯购自北京化学试剂公司
[0116]
2.2.3动物饲养条件
[0117]
大、小鼠均雌雄各半分笼饲养，饲养温度为20
±
2℃，湿度为60
±
5％。自由饮水，给药前禁食12小时，不禁水。
[0118]
2.2.4主要仪器设备
[0119]
bs 124s电子天平，sartorius公司产品。
[0120]
m ls-3020型高压灭菌锅，sanyo公司产品。
[0121]
hh-b11600-s电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂。
[0122]
centrifuge5810r低温高速冷冻离心机，ependorf。
[0123]
yj-875sa医用净化工作台，苏州净化设备公司。
[0124]
ddhz-300多用途台式恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂。
[0125]
olympus bx51型摄影显微镜：olympus corporation，japan
[0126]
925型超低温冰柜，美国forma scientific公司产品。
[0127]
2.3方法
[0128]
2.3.1体外抑菌杀菌试验
[0129]
用麦康凯培养基对大肠杆菌菌株进行培养，挑取培养基上单个菌落接种到sml营养肉汤培养基内，于37℃培养12-18h，菌液计数后用灭菌生理盐水稀释到10-6
。白连散用一次性过滤器过滤除菌。
[0130]
采用二倍稀释法测定白连散的mic。取9只试管，每支试管内加入2ml灭菌营养肉汤培养基，然后在第一支试管内加入2ml白连散，依次倍比稀释，一共稀释7个梯度，将第8支试管做为阳性对照，第9管做为阴性对照。于37℃培养箱内培养24h后观察结果。mic为无菌生长的最低稀释度。
[0131]
取肉眼观清洁透明的各试管培养物，划线接种固体营养琼脂平板，在37℃条件下培养24h，以无细菌生长的药物稀释度为该菌株的最小杀菌浓度(mbc)。
[0132]
2.3.2抗炎试验
[0133]
大鼠24只，随机分为3组，即模型对照组、白连散推荐剂量组(c 1.5g/kg
·
bw)及推荐剂量减半组(0.75g/kg
·
bw)。每组6只，雌雄各半。白连散各组按0.lml/l0g溶解相应剂量药物，灌胃给药，模型对照组以等量生理盐水代替，每日一次，连续4d。末次给药后30min，取二甲苯涂于各组大鼠右后足拓内外两面，约0.1ml，15s后在大鼠自然放松状态下测量右后足拓固定位置的厚度，以同只大鼠左后足拓同样位置厚度作对照，观察该组方的抗炎效果。数据计算方法为：肿胀度＝右后足拓厚度一左后足拓厚度，并计算各组平均值。
[0134]
2.3.3对番泻叶致小鼠腹泻的影响
[0135]
取36只健康昆明小鼠，雌雄各半，随机分为白连散低剂量组(0.75g/kg
·
bw)、白连散中剂量组(1.5g/kg
·
bw)、白连散高剂量组(3.0g/kg
·
bw)、西药对照组(市售西药思密达)、模型对照组和空白对照组，每组6只。按0.lml/l0g灌胃给药，模型对照组、西药对照组和空白对照组以等量生理盐水代替，每日一次，连续3d。末次给药后1h，除空白对照组外均灌服0.5ml番泻叶煎剂，同时西药对照组根据推荐剂量灌服思密达。然后将小鼠放在垫有滤纸的铁丝网上，每只小鼠上罩一大烧杯，每隔2h换1次滤纸。并记录在此时间段内计算腹泻的次数(包括软便、水样便、钻液便等)，比较各组间的统计学差异。
[0136]
2.3.4肠内容物推进试验
[0137]
取健康昆明小鼠12只，雌雄各半，随机分为2组：模型组、白连散推荐剂量组，每组6只。小鼠禁食24h后，实验组灌喂含有8％碳末的浓度为lg/ml的白连散，剂量为1.5g/kg
·
bw；模型组以同体积的生理盐水代替白连散混合碳末。给药后30min，颈椎脱臼处死小鼠。立即解剖取肠，平铺于玻璃板上，测量炭末头端在肠管内的移动距离和小肠全长(自幽门至回盲部)，计算推进百分率。炭末推进率百分率(％)＝炭末推进距离/小肠全长
×
100。
[0138]
2.3.5止痛试验
[0139]
雌性健康昆明小鼠24只，随机分为4组，分别为模型对照组、白连散高、中、低剂量组，每组6只。白连散各组给药浓度分别为0.75g/kg
·
bw，1.5g/kg
·
bw，3.0g/kg
·
bw，按0.lml/l0g灌胃给药，模型对照组以等量生理盐水代替，每日一次，连续3d。于末次给药1h后，各组小鼠均通过腹腔注射0.6％冰醋酸0.2ml，观察并记录15min内的小鼠扭体反应次数，以及精神状况等各种疼痛表现。
[0140]
2.3.6统计学分析
[0141]
使用excel进行实验数据整理，应用spss17.0统计处理软件anova程序进行方差分析，实验数据用平均值士标准差表示。p<0.05表示差异显著。
[0142]
2.4结果
[0143]
2.4.1体外抑菌杀菌试验
[0144]
实验结果显示，白连散对大肠杆菌体外抑菌的最高稀释度为23，最低抑菌浓度为1：8，生药含量为125mg/ml；对大肠杆菌体外杀菌最高稀释度为22，最低杀菌浓度为1：4，生药含量为250mg/ml。
[0145]
2.4.2抗炎试验
[0146]
经二甲苯刺激致炎的抗炎实验结果见表1。从表可见与模型对照组比较，白莲散各组抗炎效果显著。
[0147]
表2-1白连散抗炎实验数据
[0148][0149]
注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)
[0150]
2.4.3对番泻叶致小鼠腹泻的影响
[0151]
通过实验证明，白连散低、中剂量组均对番泻叶造成的小鼠腹泻有一定的治疗作用。根据实验观察所得，表明中剂量组在给药两小时后止泻效果最好(表2-2。与对照组相比，模型组粪便多成水样便，粪便不成形，而不同浓度的实验组粪便状态多呈软便或粘液便，随时间推移粪便形状逐渐成形。
[0152]
表2-2对番泻叶致小鼠腹泻影响数据
[0153][0154]
注：同列不同小写字母表示差异显著(p≤0.05)
[0155]
2.4.4肠内容物推进试验
[0156]
在白连散对肠内容物推进试验中，模型组与白连散推荐剂量组的碳末推进百分率平均值分别为61.07％，92.4％，表明白连散能显著增强肠内容物推进。
[0157]
2.4.5止痛试验
[0158]
通过给药和冰醋酸刺激，显示空白组小鼠精神沉郁，全身收缩，呈甸甸前进，出现扭体反应及静止不动、闭眼等现象，行动能力下降，蜷缩成团。随着药物使用浓度的升高，小鼠精神状态好转，活动次数增加，精神状态良好，扭体应明显减少，详见表2-3。三个剂量组均有一定止痛效果，高、中剂量组差异显著，且中剂量效果更好。详见表2-3。
[0159]
表2-3止痛实验数据
[0160][0161]
注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)
[0162]
2.5讨论
[0163]
在临床上禽大肠杆菌病主要表现为多器官、多样化病变，具体症状为高热，腹泻，出现纤维素性心包炎、肝周炎、腹膜炎、肠炎等组织炎症反应。中兽医的辨证论治理论认为禽大肠杆菌病是由疫毒内侵、胃肠热盛、血淤气滞引起。气滞癖血又阻塞脉络，导致气血运
行受阻，脏腑升降失调，经络沟通闭塞而引起机体疼痛。治疗时宜以清热解毒、凉血、燥湿药物为主，佐以涩肠止泻、活血散淤药物，共达清热解毒、凉血止痢之功效。
[0164]
利用中药治疗大肠杆菌病的药物必应有缓解以上临床症状的功效，同时应符合中医对于大肠杆菌病的辨证分析。因此本发明选择杀菌、抗炎、止泻、止痛、促进肠内容物推进等试验，以验证白连散在治疗禽大肠杆菌病方面确有一定的药效学作用。
[0165]
本次试验用组方以白头翁汤为根本，根据中医辩证施治法进行加减，以期达到对禽大肠杆菌病的治疗作用。方剂中白头翁苦寒，清热解毒、凉血止痢，为治痢之要药；黄连、黄答皆苦寒，相须合用，清热燥湿、泻火解毒；大青叶苦大寒，清热解毒、凉血消斑，共助白头翁清胃肠湿热而止痢；石榴皮、诃子酸涩温，涩肠止泻、敛肺平喘，与黄连相伍，善治久泻久痢；山植酸甘、微温，破泄之力较强，能消食化积，散癖行滞，可助白头翁通肠止痢。通过方剂组成分析认为该方剂主要功能清热解毒、凉血燥湿而止痢符合中医对于大肠杆菌病的辨证分析。
[0166]
有报道白头翁、大青叶、黄连均有很好的抗病原微生物的作用，且白头翁、大青叶等单味中药对禽大肠杆菌o2有一定杀菌作用，本发明所用复方包含这几味药。体外抑菌杀菌试验显示，白连散最低抑菌生药含量为125mg/ml，最低杀菌生药含量为250mg/ml。其联合配伍应用后也显示了较好的抑菌、杀菌作用。
[0167]
有研究表明白头翁对大鼠pm中合成b4(ltb4)及5-hete有明显抑制作用，对炎性介质ltb4的抑制率为94.9。白头翁对细菌脂多糖((lps)刺激巨噬细胞分泌il-6有明显抑制作用，且随培养时间的延长而增强，并可减轻机体过度炎症反应和全身性损伤，有助于治疗内毒素血症。蓼蓝叶(大青叶)煎剂可抑制二甲苯引起的家兔局部皮肤炎症反应，可使大鼠甲醛性脚肿减轻或消退加速。本发明组方抗炎试验显示中剂量组抗炎效果最显著，低剂量组有一定效果。
[0168]
白头翁有镇痛、镇静、解痉及对肠粘膜有收敛止血作用，可增强机体免疫力，通过增加肠粘膜修复因子egfr和tgf131mrna的表达，促进肠粘膜的修复，提高愈合速度，达到防治动物腹泻的目的，同时可促进肠道内细菌产生的有毒代谢产物及细菌的排出。本发明显示三个剂量组均对番泻叶造成的小鼠腹泻和疼痛有一定的作用，且中剂量组止泻和止痛效果最好。肠内容物促进显著，加之部分药物的消食化积作用，更有利于有毒代谢物质的排泄，促进病情好转。
[0169]
2.6小结
[0170]
通过体外最低抑菌(mic)与杀菌浓度(mbc)、抗炎、止泻、止痛、肠内容物推进作用等试验的研究，表明此白连散对于大肠杆菌感染引起的相应症状有一定的药效学作用。
[0171]
第三章禽大肠杆菌病临床治疗试验
[0172]
摘要：将210只21日龄spf鸡分成7组，每组30只，分别为空白组、阳性组、西药对照组、白连散预防组、高、中、低剂量组。其中空白组为空白对照组，预防组于攻菌前3天灌喂推荐剂量中药药液，然后与其余组一起经人工口服途径感染大肠杆菌o2型。然后根据不同分组分别给予不同剂量的中药或西药予以治疗。以在治疗过程中观察临床症状，记录一般生产性能变化及药物治疗情况。结果显示，与阳性对照组相比白连散治疗组发病率、死亡率减少，治愈率有所提高，发病动物临床症状减轻，有效缓解因为疾病导致的各项生产性能下降。
[0173]
3.1禽大肠杆菌病主要由大肠杆菌经口腔感染发生，可引起腹泻及由于肠粘膜损伤引起的肝周炎、胸膜炎、腹膜炎等相关病症。尽管抗生素使用起到一定作用，但药物残留导致食品安全问题值得关注。且对常发地区或鸡场，药物治疗效果日渐降低，本病很难得到有效地控制。中药以其治疗整体效果、低残留等优势日益受到重视。
[0174]
白连散组方中含有白头翁、黄连、大青叶等几味中药。白头翁苦寒，归大肠经，有清热解毒、凉血、明目、消赘的功效，为治痢之要药；黄连味苦，性寒，归于胆、胃、大肠经，偏于入心，性燥，为心胃之剂，能清热燥湿，泻火解毒，可治肠辟、下痢等湿热为患之疾；大青叶苦大寒清热凉血，解毒消斑，泻火，散癖止血，治肠炎。中兽医的辨证论治理论认为禽大肠杆菌病是由疫毒内侵、肺胃热盛、血淤气滞引起，治疗时宜以清热解毒、凉血、燥湿药物为主，佐以涩肠止泻、活血散淤药物，共达清热解毒、凉血、止痢之功效。而该组方清热解毒、凉血、燥湿而止痢符合中医对于大肠杆菌病的辨证分析。
[0175]
本发明从临床角度出发，研究不同浓度的白连散对禽大肠杆菌病的治疗效果，通过观察其临床症状、生产性能、组织病理学的变化，证明其能成为对原有抗生素的一种有效替代药品，为预防、治疗禽大肠杆菌病提供新的思路与途径，在疾病的预防与治疗中起到关键的作用。
[0176]
3.2材料
[0177]
3.2.1实验动物与细菌
[0178]
21日龄spf鸡购自北京梅里亚维通华实验动物技术有限公司。
[0179]
大肠杆菌菌株o2，批号c83863，购自中国兽医药品监察所。
[0180]
3.2.2实验药品
[0181]
白连散，河北科星药业有限公司中试产品，生产批号：20110602。含生药1.0g/ml；
[0182]
大捕快(氧氟沙星溶液)，购自生泰尔生物科技集团。批号：120410
[0183]
3.2.3主要试剂
[0184]
营养肉汤，北京奥博星生物技术有限公司，生产批号：201001100
[0185]
营养琼脂，北京奥博星生物技术有限公司，生产批号：201001180
[0186]
麦康凯琼脂，北京奥博星生物技术有限公司，生产批号：201001220
[0187]
苏木精(h9627)：sigma，u.s.a
[0188]
伊红y(醇溶)：北京化学试剂公司
[0189]
中性树胶(neutral balsam)：上海国药集团化学试剂有限公司
[0190]
3.2.3主要仪器设备
[0191]
cc
·
jh-1型正/负压隔离器：天津市津航净化空调工程公司
[0192]
olympus bx51型摄影显微镜：olympus corporation，japan
[0193]
spn3001f型电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司
[0194]
a0860型滑走式切片机：american optical corporation，u.s.a.
[0195]
dhg-9075a型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司
[0196]
病理图像分析系统6.0：olympus公司，日本
[0197]
3.3方法
[0198]
3.3.1实验动物分组及处理
[0199]
3周龄spf雄性来航鸡210只，随机分为7组，每组30只鸡。对照组与阳性对照组分别
在隔离器中饲养，阳性药物对照组及白连散预防组、低剂量组、中剂量组、高剂量组分别于三层育雏鸡笼饲养。饲料中不含任何药物，自由采食及饮水，全程试验巧天。试验期内在开始攻菌前3天对预防组给予推荐剂量的白连散，以起到预防作用，而后统一攻菌，攻菌后当天各组既分别灌服不同浓度的药物予以治疗，连续7天，7天后停药，饲养至15天。组别和处理见表。
[0200]
表3-1试验动物分组处理
[0201][0202]
3.3.2生产性能的影响
[0203]
称取每只鸡攻菌前和7天后的体重变化，计算日增重量。同时称取每日饲喂量和剩余量，计算每日采食量。
[0204]
3.3.3临床症状观察
[0205]
临床症状观察精神状态、羽毛紊乱度、行为、食欲、粪便形状等。记录死亡率、治愈率和总有效率等实验数据。
[0206]
临床疗效判定标准：
[0207]
无效：病鸡精神高度沉郁，喜卧，羽毛粗乱，闭眼昏睡，食欲下降，剧烈腹泻，出现急性死亡。
[0208]
有效：病鸡精神状态较好、活泼，呼吸、食欲渴欲接近正常，羽毛逐渐整齐有光泽，排便次数减少，个别鸡排稀粪。
[0209]
痊愈：精神状态正常活泼，食欲完全恢复，羽毛整齐有光泽，排便正常。
[0210]
3.3.4剖检病理变化观察
[0211]
3.3.4.1剖检观察
[0212]
剖检病理变化包括肠浆膜、心外膜、心内膜有无明显小出血点；肠壁粘膜是否有大量粘液；
[0213]
肝脏颜色、被膜厚度、是否质脆、有无出血点和坏死灶；肌胃是否出血；心包积液及心包膜厚度与透明度；关节是否肿大有无渗出液。
[0214]
细菌分离与鉴定：对在试验过程中死亡鸡只，均进行剖解和大肠杆菌分离鉴定。
[0215]
无效：剖检肝脏呈棕黄色、质地变脆、有坏死点和出血点，心包腔有纤维素性分泌物、包膜增厚，肠道内容物含有血液、肠道出血。
[0216]
有效：剖检肝脏质脆、有少量坏死点，颜色较均一，心包出现积液，心包膜和肝被膜有纤维素伪膜，肠道有散在出血点。
[0217]
痊愈：剖检肝脏、心脏和肠道均恢复正常状态。
[0218]
3.3.4.2病理切片取材与制作
[0219]
在攻菌感染后的7天，将每组随进取5只鸡心脏采血致死，剖检，无菌摘取肝脏，于福尔马林溶液中固定48h，期间换液一次，修块后以流动水冲洗掉福尔马林溶液，然后进行常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制成5}m厚的石蜡切片。
[0220]
3.3.4.3 h-e染色
[0221]
首先将石蜡切片以不同浓度的二甲苯、酒精进行常规脱蜡，苏木精液中浸染8-10min，以蒸馏水冲洗后，盐酸-乙醇溶液分色，自来水冲洗蓝化30min，在伊红溶液中浸染2sec入流水冲洗，最后依次在95％乙醇，80％乙醇，95％乙醇、石炭酸二甲苯中浸泡1-2min，二甲苯i 5min，二甲苯ii 5min的程序进行常规脱水，脱水后的切片迅速以中性树胶封固以防氧化风干。
[0222]
3.3.5细菌残留量检定
[0223]
攻菌后15日每组取3只鸡心脏取血致死，无菌摘取肝脏，称取0.1g肝脏加入1m1生理盐水进行研磨，研磨后的悬浊液静置沉淀30min后取上层清液加入15m1营养琼脂中制成平板，待琼脂凝结后于37℃培养48h，期间每12h取出观察计数一次。观察每组肝脏内大肠杆菌残余量。
[0224]
3.3.6数据处理与统计分析
[0225]
统计分析将采用spss 11.。统计分析软件进行计算。
[0226]
计量资料将采用均数士标准差进行统计描述。用药各组治疗前后的变化与阳性对照组进行比较采用方差分析(anova)和t检验进行比较。
[0227]
3.4结果
[0228]
3.4.1生产性能的影响
[0229]
3.4.1.1采食量
[0230]
在试验期间通过对每日饲喂量和剩余量的统计后发现，鸡感染大肠杆菌后采食量会严重下降，但是在阳性药及白连散的治疗作用下，实验动物的采食量下降会有一定的缓解，其中预防组及高剂量组可较好的缓解作用。(见图3)
[0231]
3.4.1.2增重量
[0232]
分别与试验开始前、后称取每只鸡的重量，计算差值并统计数值制图4，由表可见感染大肠杆菌后增重量会严重下降，阳性药及白连散都可以较好的抑制这种现象，提高动物生产性能。其中以高剂量组效果最为明显。
[0233]
3.4.2临床观察
[0234]
攻菌后可见除空白组外均出现腹泻、精神沉郁、喜卧不动、采食量减少等症状。试验期间阳性对照组死亡2只，其余组无死亡情况。预防组、低剂量组、西药组各1只，阳性对照组2只出现关节病变，发病鸡关节肿大，跋行，后期不能站立，关节腔内有黄色分泌物。随攻菌及用药时间增加，实验动物整体趋于恢复状态，腹泻现象有所减缓，精神有所好转，食欲增加。
[0235]
3.4.3剖检结果
[0236]
对试验过程中死亡鸡只进行剖检，死亡鸡呈现大肠杆菌败血症症状，肝脏肿大，颜色暗黄不均质脆，肠道气肿，有黄绿色粪便。
[0237]
于攻菌后3天、7天、巧天每组分别随机剖检5只，比较各器官状态。由剖检可见，攻菌后3天，阳性组部分心脏表面有干酪样物质附着，肝脏颜色暗黄颜色不均，有淤血现象，质
脆易出血，肠道内有黄绿色液体状粪便，出现严重肠鼓气现象。其余组以高剂量组、中剂量组、预防组、西药组、低剂量组的顺序症状逐渐递减。高剂量组、中剂量组均未在心脏上观察到干酪样物质，肝脏颜色也较为均一，肠道内可见黄绿色稀粪，未见肠道鼓气。低剂量组及西药组可见肠道鼓气现象。空白对照组未见异常。攻菌7天后各组剖检现象均有好转，在肠道方面，各组均不见肠道鼓气现象，但是阳性对照组依旧可见肠道内黄绿色稀粪，其余组未见同样现象。观各组样品中心脏，未见心脏上附着干酪样物质。肝脏观可知，阳性对照组肝脏颜色依旧不均一，质脆有淤血现象，触碰易出血；西药组肝脏恢复较差，也呈现较不均一状态，切割后表明渗血；白连散各组肝脏恢复较好，肝脏颜色趋于均一，但依可不同程度见到轻微颜色不均现象。
[0238]
3.4.4病理切片观察
[0239]
通过病理切片观察可见到空白组组织正常，细胞大小形态正常，无炎性细胞侵润。各攻菌组呈现细菌性肝炎变化，肝脏中央静脉和窦状隙扩张，肝索紊乱，细胞间以中性粒细胞侵润为主，肝细胞发生颗粒变性，有嗜酸性坏死现象，也可见有融合性的凝固性坏死。其中阳性对照组出现大片深红色嗜酸性小体，肝细胞排列紊乱，窦状隙内红细胞增多。其余中药各组组织病变均散在发生。
[0240]
3.4.5细菌性检定
[0241]
经过18小时的培养后进行细菌计数，统计数据。由表3-4可见空白对照组肝脏内未检出大肠杆菌符合试验设计，阳性组体内有大量大肠杆菌残留，西药组与低剂量组都有一定的残留，但是相较阳性组数量还是有很大差距的，高剂量组、中剂量组及预防组差异则更加明显。
[0242]
表3-2攻菌15天后肝脏内残余菌量
[0243][0244]
表中不同小写字母代表差异显著p＜0.05，不同大写字母代表差异极显著p≤0.01
[0245]
3.5结果
[0246]
中兽医认为鸡大肠杆菌病属疫病范畴，根据辨证论治理论认为当鸡群受到物理、化学等应激及其他病原刺激时引起自身正气不足、营卫不固，使外邪疫毒入侵，引起鸡精神沉郁、高烧、食欲不振及羽毛蓬乱等症。临床可见呼吸困难、下痢、口渴烦饮、食欲废绝等，解剖可见心包炎、肝周炎和肠炎等病变。治疗时宜以清热解毒、凉血、燥湿药物为主，佐以涩肠止泻、活血散淤药物，以健脾养胃、行气利水、养阴止痢为辅，共达清热解毒、凉血、止痢之功效。
[0247]
本发明所用白连散由白头翁、黄连、黄答、大青叶等组成，通过试验证明此复方可以较好的缓解和治疗鸡大肠杆菌病，减少发病率、死亡率，提高动物生产性能，加快机体清
除细菌速度。市售有“速效杆康”(又叫白头翁散)和“金方消毒散”等成品药，其主要成分为白头翁、秦皮、黄柏、黄连、黄答等，与试验用白连散有相似配伍，这些成品药经过临床应用具有良好的抑菌、杀菌的功效，同时可以调整和恢复家禽的胃肠功能，提高机体自身的免疫力和抵抗力，从而起到降低大肠杆菌病的发病率和减轻发病后的损害，在福建省的临床应用过程中治愈率达到91.5％。以白头翁、黄连等为主要药物配伍的中药方剂还有很多，在临床应用中同样显示了很好的治疗效果。
[0248]
内毒素是大肠杆菌重要的致病因子，中药提取物黄岑苷可减少内毒素含量，减轻内毒素对脏器的损伤和内毒素对内皮细胞膜结构的损伤；黄岑苷还具备抑制内毒素所致的细胞蛋白分泌功能增强、蛋白水解酶的释放及氧自由基的产生等功效。试验中白连散各组实验动物经剖检后可见肝脏颜色更均一，淤血及坏死现象更轻微，病理切片显示中药组肝脏结构损伤较小。表明中药起到了一定的保护作用。
[0249]
各种试验表明白头翁、黄连、黄答、大青叶等对于大肠杆菌具有良好的杀菌作用，试验中细菌学检测显示了中药组在攻菌巧天后体内大肠杆菌数有显著下降，表明应为中药的作用而促进了机体对于感染菌的清除。
[0250]
白连散集清热、解毒、杀菌、促进免疫于一体，可显著降低大肠杆菌发病率及死亡率，加快恢复速度，减少实质器官的损伤，提高动物的生产性能，标本兼治，能有效治疗鸡大肠杆菌病。
[0251]
第四章白连散对鸡感染大肠杆菌后的免疫影响
[0252]
摘要：以大肠杆菌o2型感染21日龄spf鸡，在口服攻毒后3、7、15日分别无菌心脏采抗凝血，分离外周血单个核细胞，以流式细胞术检测外周血单个核细胞表面的分子动态变化。同时应用mts法检测外周血下淋巴细胞在cona刺激下的增殖情况，以此说明大肠杆菌感染对鸡免疫系统的影响。结果显示，与阳性对照组对比，后b淋巴细胞数量有一定的上升，3到7天时时上升趋势，在7天时数值相对最高，到第15天时有所下降。但是t细胞数量有所增加，在感染后15天时白连散预防组、高剂量组cd4
+
/cd8
+
比值显著高于空白对照组(p≤0.01)。以上结果表明，白连散可以有效提高机体免疫力，保护机体减少病菌对机体的伤害。
[0253]
4.1大肠杆菌感染动物体后会引起机体一系列的免疫反应，体液免疫及细胞免疫在该病的抗感染过程中，发挥着重要的作用。
[0254]
其中机体细胞免疫主要依靠体内的t细胞。t细胞膜表面分子基因主要以白细胞分化抗原(clusterofdifferentiation，cd)、组织相容性抗原以及膜表面的受体等构成。cd3分子能表达于全部t细胞上，是t细胞共同的表面标志。cd3可将tcr(t cell receptor)与抗原结合所产生的活化信号传递到细胞内部并激活细胞。根据cd4和cd8可将t细胞分成两个重要亚群。cd4存在于辅助性t细胞(th)表面，而cd8主要存在于细胞毒性t细胞(ctl)表面。cd4
+
t细胞主要识别与mhc ii类分子及其他共刺激分子结合的、被加工过的外源性抗原。外源性抗原活化cd4
+
t细胞后，启动免疫反应。另外cd4
+
t细胞对其他免疫细胞，如nk细胞和cd8
+
t细胞提供关键性的辅助作用，然后这些细胞分化增殖，参与免疫反应。cd8
+
t淋巴细胞识别结合于mhc工分子上的内源性抗原，主要功能是清除被病毒感染的细胞。mhc i类分子分布于几乎所有有核细胞表面，重要生理功能是对cd8细胞的抗原识别功能起限制性作用。
[0255]
t细胞的增殖试验又称为t细胞活化或转化试验。t细胞在体外经过某种物质(如刀豆蛋白cona，lps等)刺激后细胞的代谢和形态会发生一定的变化。主要的表现为：在较短时
间内细胞表面的电荷会发生变化，随后数小时细胞内酶被活化，细胞内蛋白和核酸的合成量会在23-48h时增加，从而引起细胞发生一系列的增殖变化，如细胞形态改变、细胞浆增多、细胞出现空泡化、染色质疏松、核仁明显。这种淋巴细胞增殖又称淋巴母细胞转化，因为在细胞增殖过程中淋巴细胞会逐渐转化为淋巴母细胞。淋巴细胞转化率的高低，标志着机体免疫功能状态的高低。有大量报道证实多种中药及中药提取物可以有效地促进机体淋巴细胞数目的增加，提高淋巴细胞的转化率。
[0256]
分泌型免疫球蛋白a(s1ga)是粘膜免疫系统的主要体液防御因子，它是防御病菌在肠道粘膜粘附和定植的第一道防线，s1ga通过多种机制参与对病原微生物的控制，当细菌钻附素刺激肠粘膜上皮表面时，特异性淋巴细胞作用于肠道粘膜固有层和肠道上的一些腺体，进而分化为浆细胞，分泌siga，阻止肠道微生物及其毒素分子对肠粘膜的攻击，起到粘膜免疫保护作用。通过对粘膜siga滴度的测定，可以来说明机体免疫功能强弱变化。
[0257]
本发明应用流式细胞术检测了外周血单个核细胞表面分子的动态变化，为进一步研究大肠杆菌感染对鸡体免疫中影响以及白连散的治疗作用机制提供基础。
[0258]
4.2材料
[0259]
4.2.1实验动物与病毒(同2.2.1)
[0260]
4.2.2实验试剂及配制方法
[0261]
edta抗凝血的配制：15％edtak2，即10m1内溶解edtak21.5mg，依据1.5-2.2mg/ml的工作浓度；可取15m1 edtak2湿润试管后干燥备用。
[0262]
2xrpm i-1640浓缩液：按使用说明书配制，过滤除菌，4℃保存。
[0263]
小牛血清：gibco公司产品，56℃灭活30min，-20℃冻存备用。
[0264]2×
104u/ml青霉素链霉素液(双抗)：100m l三蒸水中加青霉素、链霉素各2x106u溶解，过滤除菌，分装后，于-20℃冰箱冻存备用。
[0265]
2％rpmi 1640营养液：将1ml小牛血清加入50ml2
×
rpmi 1640溶液中，同时加入1ml浓度为2
×
104u的青霉素-链霉素液。
[0266]
100/rpmi 1640营养液：将1ml小牛血清加入50ml2
×
rpmi 1640溶液中，同时加入1ml浓度为2
×
104u的青霉素-链霉素液。
[0267]
0.5％台盼蓝溶液：称取台盼蓝，置研钵内加蒸馏水研磨溶解，配成1％水溶液。再配制1.70％naci水溶液。将2种溶液等量混合，6000r/min离心10min，取上清室温保存备用
[0268]
抗鸡bu-1-fitc(克隆号：ct-3)；抗鸡cd3-sprd(克隆号：ct-4)；抗鸡cd4-fitc(克隆号：ct-8)；抗鸡cd8-pe(货号：8220-09)；抗鸡mhc ii类分子(克隆号：2g11)以上试剂购自southernbiotech公司。
[0269]
鸡淋巴细胞分离液：购自天津tbd公司。
[0270]
mts试剂盒：购自promega公司，产品名：ceiititeraqueou one solution cell proliferationassay，产品编号：g3580。
[0271]
鸡分泌型免疫球蛋白a(siga)酶联免疫试剂盒：购自武汉华美生物工程有限公司。
[0272]
4.2.3主要仪器设备
[0273]
mls-3020型高压灭菌锅，sanyo公司产品。
[0274]
bs124s电子天平，sartorius公司产品。
[0275]
飞鸽牌tgl-16g台式离心机，上海安亭科学仪器厂。
[0276]
yl-875sa医用净化工作台，苏州净化设备公司。
[0277]
s2-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂。
[0278]
二氧化碳培养箱，rrecision公司产品。
[0279]
4.3方法
[0280]
4.3.1动物分组及攻菌
[0281]
参见3.1.1。
[0282]
4.3.2外周血单个核细胞(pbmc)的制备
[0283]
分别在感染后3，7，15天鸡心脏采血约l0ml，edta抗凝，以2：1加入淋巴细胞分离液及抗凝血，1500转/分钟，20分钟；小心吸取中间乳白色淋巴细胞层加入5倍体积的2％1640混匀，1500转/分钟，10分钟，倾去上清，沉淀用红细胞裂解液悬浮，室温1分钟，1000转/分钟，10分钟；倾去上清，沉淀以2％1640悬浮，1500转/分钟，10分钟，重复洗涤一次，沉淀以2％1640悬浮，1500转/分钟，10分钟10％1640悬浮淋巴细胞，用台盼蓝计数，将细胞用10％1640配成1
×
106个/ml浓度的悬浮液，为pbmc。
[0284]
4.3.3流式细胞术检测pbmc中表面分子
[0285]
将分离的pb mc用2％1640细胞培养液悬浮，调整浓度到1
×
106个/ml，加入相应的抗体，并做对照。加入抗体后，震荡混匀，避光室温孵育30分钟，1500r/min离心5min后弃去上清，加1m1pb s混匀进行上机鉴定。bu-1表示b细胞的数量；cd3表示t细胞的数量；cd3/4表示辅助性t细胞；cd3/8表示细胞毒性t细胞；仅cd8阳性的表示nk细胞；mhc ii类分子分别表示外源性抗原加工功能。
[0286]
4.3.4mts法检测t淋巴细胞增殖
[0287]
取96孔细胞培养板，每孔加入以10％无酚红1640培养液悬浮的pbmc 100μl，浓度为2
×
106/m l，设置两个实验组，一个对照组，实验组pbmc中加入终浓度为10mg/m l的cona，对照组加入无酚红1640培养液，每组各3个重复孔，于5％co2，37℃培养3天，按照mts试剂盒说明书操作，每孔加入20μlmts和pms的预混液，370c孵育4h，取出后置490nm波长的酶标仪中检测od
490
。
[0288]
si＝(od
刺激组-od
空白对照
)/(od
细胞对照-od
空白对照
)
[0289]
4.3.5对鸡消化道siga分泌的影响
[0290]
分别于7、15d，每组各取5只鸡，刮取肠粘膜200μl，用1mipbs吹打混匀，6000r/min离心15min，取上清液作为待检液，4℃保存。严格按照elisa试剂盒说明书操作，实验数据用excle2007统计，并用curve expert 14制作标准曲线。
[0291]
4.3.4数据处理与统计分析
[0292]
应用exce12007对得到的流式数据进行整理分析，p≤0.01表示差异极显著，p≤0.05表示差异显著。
[0293]
4.4结果
[0294]
4.4.1外周血单个核细胞中表面分子动态变化
[0295]
结果显示，pbmc中在攻菌后b淋巴细胞数量有所增加(见表4-1)。各组与空白对照组相比差异不显著，但是可见b细胞数量有一定程度上升，各时段内各治疗组数值均比阳性对照组高。在各治疗组中以第7天时b细胞数值最高，到第15天时有一定的下降。在感染3天时阳性组cd4
+
/cd8
+
比值最低。其余组相较空白对照组数值虽有一定下降但不显著。在感染
后15天时白连散预防组、高剂量组cd4
+
/cd8
+
比值显著高于空白对照组(p≤0.01)。见表4-2。
[0296]
表4-1外周血中单个核细胞(pbmc)中b细胞数量动态变化
[0297][0298]
表4-2外周血中单个核细胞(pbmc)中cd4'与cd8't细胞数量比值动态变化
[0299][0300]
表中不同大写字母代表数值间差异极显著p}o.01
[0301]
4.4.2 t淋巴细胞增殖变化
[0302]
以mts法测定下淋巴细胞增殖情况，数据统计如表4-3。感染后3天各组下淋巴细胞增殖相较空白对照组有所下降，但是无显著差异。感染后7天白连散低剂量组下淋巴细胞增殖显著高于阳性对照组。
[0303]
表4-3 t淋巴细胞增殖情况
[0304][0305]
表中不同小写字母代表数值间差异极显著p＜0.05
[0306]
4.4.3 siga表达量变化
[0307]
以elisa法检测样品，通过curve expert 1.4制作标准曲线并计算后，数值显示感
染后7天和15天时白连散各组siga分泌量均显著高于阳性对照组。(p≤0.01)
[0308]
表4-4肠道siga分泌量动态变化
[0309][0310]
表中不同大写字母代表数值间差异极显著p≤o.01。
[0311]
淋巴细胞是执行免疫反应的主要细胞，淋巴细胞的数量是反映机体免疫功能状态的一种非常重要且直观的指标。b细胞在动物体液免疫中发挥着非常重要的作用，机体体液免疫功能的高低与b淋巴细胞数量有着密切的关系。其还参与抗原提成和分泌细胞因子调节免疫，能较有效的抵抗胞外细菌感染。在正常生理状态下鸡体内b淋巴细胞数量随日龄增长而缓慢增长，最终趋于稳定，机体的免疫功能也逐步趋于完善。本发明中，随着日龄增长空白对照组b淋巴细胞数量确有一定增长，符合前人报道。试验中鸡感染大肠杆菌后3天、7天、15天时各实验组b淋巴细胞数量均相较空白对照组都有一定量的上升，7天时各实验组b淋巴细胞数量值达到最高，其中以预防组数量最高。在第巧天时除空白对照组外各组数值均有一定的下降，西药组下降幅度最大，白连散实验组下降极少。因为大肠杆菌属于胞外感染菌，感染后激发机体体液免疫抵抗感染，使外周血中b淋巴细胞数量上升，在数值上可见白连散组b淋巴细胞数目比西药组高，可以表明白连散对于提高机体体液免疫作用有一定的效果。有试验表明抗生素可缩短抗体持续时间，有免疫抑制作用。试验中15日时西药组、阳性对照组b淋巴细胞数下降明显可能与抗生素导致的机体发生免疫抑制有关以及细菌感染对机体损伤过大，免疫系统的防御功能下降。
[0312]
禽类t细胞在胚胎期来源于卵黄囊，孵化后来源于骨髓的多能干细胞，在胸腺中发育成熟。它参与细胞免疫并对b细胞进行调节。t细胞中可分为cd4，cd8两个亚群，分别识别内、外源性抗原。t淋巴细胞cd4
+
，cd8
+
亚群浓度与鸡的免疫防御密切有关。有试验表明cd4，cd8分子对当机体免疫功能强时cd4
+
t细胞含量高，机体可以迅速启动免疫反应抵抗病原，保护机体不受外源性病原微生物侵害。相反，由于cd8
+
t细胞主要功能是清除被病毒感染的细胞，所以当cd8
+
t细胞含量升高时，被感染的细胞能被识别出来的就越多，表明机体本身的免疫功能下降。因此cd4
+
/cd8
+
比例高则证明机体自身免疫功能、抗病力能相对较强，低则相反。试验中在感染3天时阳性组cd4
+
/cd8
+
比值最低，说明感染后机体受到细菌攻击，免疫功能下降。其余组相较空白对照组数值虽有一定下降但不显著，说明药物协助机体清除病原菌，减轻免疫系统的损伤。在感染后15天时白连散预防组、高剂量组cd4
+
/cd8
+
比值相较空白对照组有了显著回升(p≤o.01),说明白连散对免疫系统起到了很好的调节作用，增强了机体抵抗力。白连散中有黄茂这味中药，经试验证实黄茂可促进雏鸡外周血中淋巴细胞增殖，有很好的提高雏鸡免疫力的作用。现有技术也通过试验证明以黄茂为主的白连散有显
著提高免疫抑制小鼠下细胞亚群cd4
+
及cd4
+
/cd8
+
的比值，降低cd8
+
数值。
[0313]
刀豆蛋白a(concanavalina，cona)是一个常用的丝裂原，它能活化t淋巴细胞使其分裂增殖。外周血t淋巴细胞在cona刺激后显著增殖，表明机体的免疫水平有所提高，免疫力增强，积极抵抗细菌感染。试验中感染后7天白连散低剂量组下淋巴细胞增殖显著高于阳性对照组及空白对照组，说明白连散可以在一定程度上提高t淋巴细胞活性，其主要原因应该也是组方中添加了黄茂、白头翁等可以提高机体免疫力的药物，同时因为药方是在中医理论指导下完成的，综合调理机体各项机能，在各味药材相互协调的作用下提高了机体整体素质。
[0314]
siga等抗体由肠粘膜上皮细胞分泌，是肠道免疫屏障的重要组成部分。参与机体免疫监控和防御，可阻止机体对内毒素。大量试验证明肠粘膜siga水平高低与肠粘膜免疫屏障功能高低有很大关系。同时有很多关于中药方剂及提取物有增强siga分泌水平的报道。现有技术以中药清凉冲剂饲喂雏鸡，表明清凉冲剂可以提高鸡的粘膜免疫指标siga的含量。试验中结果显示感染后阳性对照组siga分泌量显著下降，推测为在细菌的侵害作用下鸡肠道粘膜严重受损，粘膜免疫受到抑制。试验期间白连散各组siga分泌量均显著高于阳性对照组(p≤o.01)，其中高剂量组增加量最为明显，且呈持续增长趋势。低剂量组在感染7天时分泌量较低，推测可能为药物剂量较小，经过机体代谢后表明白连散可以提高鸡肠道siga分泌量，加强肠道粘膜免疫力。
[0315]
试验中药方剂对机体免疫系统有一定的调节作用，通过提高机体内淋巴细胞数量及活性，增加肠粘膜siga分泌量等一系列复杂变化，增强免疫系统功能，在一定程度上提高机体抗病力，减轻病菌对机体的伤害。
[0316]
白连散对鸡大肠杆菌o2型确有一定的杀灭作用，同时具有一定的抗炎、止泻、止痛、促进肠内容物推进的药效学作用。对临床鸡大肠杆菌病具有一定的治疗作用，综合各项试验实验结果显示推荐剂量(既中剂量，给药浓度1.5g/kg-bw)。可有效减少鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率，提升动物生产性能，减轻临床症状及组织的病理损伤。在免疫学方面白连散可以通过提高机体内淋巴细胞数量及活性，增加肠粘膜siga分泌量等一系列复杂变化，提高动物机体自身的免疫力。通过以上试验证明白连散可以有效治疗禽大肠杆菌病，为后续的生产推广提供了有效的科学依据。
[0317]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。