山萘酚在制备治疗或改善心脏损害的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体地，本发明提供了一种山萘酚用于制备治疗化疗药物导致的心肌损伤和心功能不全的药物组合物的用途。

背景技术：

癌症化疗药物引起的心血管并发症已成为癌症治疗中的常见问题。顺铂是一种铂类抗肿瘤药物，广泛应用于子宫内膜、颈部、头部、膀胱、睾丸、卵巢、肾脏和肺等多种实体肿瘤的治疗。虽然铂类化疗药物在癌症治疗中具有可靠性和有效性，但顺铂的副作用，如神经毒性和心脏毒性，是癌症成功治疗的主要障碍。大量研究表明，顺铂可使血浆肌钙蛋白i、肌酸激酶和肌酸激酶同工酶mb水平升高。总之，顺铂引起的心脏损伤最终导致充血性心力衰竭和猝死。因此，揭示顺铂的毒性机制，将有助于寻找治疗顺铂相关毒性的新药。目前，心肌细胞凋亡已在体内外顺铂诱导的心脏毒性模型中得到证实，但是顺铂诱导心肌细胞毒性的分子机制复杂而不清楚。

山萘酚是一种黄酮类化合物，广泛存在于各种蔬菜和水果中。大量研究表明，山萘酚具有抗炎和抗氧化作用。最近的一项研究表明，血清炎性细胞因子的降低与每天摄入高水平的黄酮醇，尤其与山萘酚密切相关。山萘酚通过抑制转移、炎症和血管生成显示出巨大的抗肿瘤潜力。然而，本领域尚没有任何关于山萘酚对于改善心脏功能缺陷或心肌细胞凋亡相关的用途。

综上所述，本领域尚缺乏有效的对于化疗药物引起的心血管并发症的治疗药物。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于治疗化疗药物引起的心血管并发症的药物。

本发明还提供了一种山萘酚用于治疗或改善心脏损害的用途，其中，所述的心脏损害是癌症化疗药物引起的心血管并发症。

本发明的第一方面，提供了一种山萘酚的用途，其在制备治疗或改善心脏损害或心脏功能障碍的药物中的应用，且所述的山萘酚具有如下式所示的结构：

在另一优选例中，所述的心脏损害是癌症化疗药物引起的心血管并发症。

在另一优选例中，所述的癌症化疗药物为顺铂。

在另一优选例中，所述的心脏功能改善包括选自下组的一个或多个指标改善：射血分数、缩短分数、血清ck-mb水平、心肌纤维紊乱、anp和bnp的mrna水平。

在另一优选例中，所述的心脏功能改善包括改善心肌细胞凋亡。

在另一优选例中，所述的心脏功能改善包括炎症因子水平降低。

在另一优选例中，所述的炎症因子选自下组：il-6、hmgb1、tnf-α、mcp-1，或其组合。

在另一优选例中，所述的心脏功能改善包括降低nf-kb的磷酸化水平。

在另一优选例中，所述的心脏功能改善包括抑制炎性细胞因子的释放。

在另一优选例中，所述的改善心肌细胞凋亡包括抑制sting和/或tbk1的磷酸化。

在另一优选例中，所述的改善心肌细胞凋亡包括阻断nf-kb信号通路。

本发明的另一方面，提供了一种山萘酚的用途，其用于制备治疗或预防与sting的活性或表达量相关的疾病或病症的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1山萘酚减弱顺铂诱导的肥厚和心功能不全。a-b.用超声心动图测量射血分数(a)和缩短分数(b)。c.elisa试剂盒检测血清ck-mb水平。d.心脏组织切片h&e染色观察心肌纤维紊乱。e-f.rt-qpcr检测anp和bnp的mrna水平。g.心脏与体重之比(hw/bw)。(各组n＝6；与生理盐水组比较，#p＜0.05，#p＜0.01，##p＜0.001；*，与cddp组比较；*p＜0.05，**p＜0.01＝。

图2山萘酚减少顺铂诱导的心肌细胞凋亡；a.tunel染色及定量分析显示心肌细胞凋亡。b.蛋白免疫印迹分析和定量分析检测凋亡相关蛋白bax和抗凋亡相关蛋白bcl-2的表达。(每组n＝6；与生理盐水组比较，p＜0.001；*，与cddp组比较；***p＜0.001＝。

图3山萘酚显著抑制顺铂诱导的心肌组织炎症；a.免疫组化染色及定量分析显示巨噬细胞浸润。b-e.用rt-qpcr检测il-6(b)、hmgb1(c)、tnf-α(d)和mcp-1(e)的mrna水平。f-g.用相应的elisa试剂盒检测il-6(f)和tnf-α(g)的蛋白含量。h.蛋白免疫印迹分析和定量分析检测nf-kb的磷酸化和表达(每组n＝6；与生理盐水组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，##p＜0.001；*，与cddp组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001＝。

图4山萘酚抑制顺铂诱导的h9c2细胞死亡；a.用顺铂(0.1、0.5、1、5、10μm)孵育24h后，用mtt法检测h9c2细胞的存活率。b.山萘酚(1，5，10μm)预处理1h后，将h9c2细胞与顺铂(10μm)共孵育24h，mtt法检测细胞活力。c-d.山萘酚(1，5，10μm)预处理1h后，用顺铂(10μm)孵育h9c2细胞24h，tunel染色检测细胞凋亡。采用tunel染色(c)和定量分析(d)的典型图像对h9c2细胞进行凋亡检测。e-f.用山萘酚(1，5，10μm)预处理1h后，用顺铂(10μm)孵育h9c2细胞24h，收集总蛋白。蛋白免疫印迹分析和定量分析检测bax和bcl2的表达。(n＝3个独立实验；与ctr或dmso组比较，#p＜0.05，#p＜0.001；*，与cddp组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001＝。

图5山萘酚抑制顺铂诱导的炎症反应；a.h9c2细胞经山萘酚(1、5、10μm)预处理1h后，与顺铂(10μm)共孵育6h，收集总rna。rt-qpcr检测hmgb1、mcp-1、tnf-α和il-6的mrna水平。b.山萘酚(1、5、10μm)预处理1h后，用顺铂(10μm)孵育h9c2细胞24h，收集培养基。用相应的elisa试剂盒检测il-6和tnf-α的含量。c.山萘酚(1、5、10μm)预处理1h后，将h9c2细胞与顺铂(10μm)共孵育1h，收集总蛋白。蛋白免疫分析和定量分析检测nf-kb的磷酸化和表达(n＝3个独立实验；#，vs.dmso组，##p＜0.01，#p＜0.001；*，vs.cddp组；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001＝。

图6sting参与顺铂诱导的炎症；a.用蛋白免疫印迹分析和定量分析检测心肌组织中sting和tbk1的磷酸化(每组n＝6；与生理盐水组相比，#p＜0.001；*，与cddp组；**p＜0.01，***p＜0.001。b.h9c2细胞与顺铂(10μm)孵育0.5、1h或2h，收集总蛋白。采用蛋白免疫印迹分析和定量分析方法检测sting和tbk1的磷酸化。c.山萘酚(1、5、10μm)预处理1h后，将h9c2细胞与顺铂(10μm)共孵育1h，收集总蛋白。采用蛋白免疫印迹分析和定量分析方法检测sting和tbk1的磷酸化。d.将特异性sirna转染h9c2细胞24h，收集总rna。rt-qpcr法检测sting的mrna水平。转染特异性sirna转染h9c2细胞24h，用山萘酚(10μm)预处理1h，再与顺铂(10μm)孵育24h，用蛋白免疫印迹分析和定量分析检测bax和bcl-2(e)的表达，mtt法检测细胞活力(f)。用相应的elisa试剂盒检测培养基中il-6(g)和tnf-α(h)的含量(n＝3个独立实验；与ctrl或dmso组相比，##p＜0.01，##p＜0.001；*，vs.cddp组；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001＝。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，发现了山萘酚对顺铂所致心脏损害具有保护作用，并对其作用的分子机制进行了深入研究。结果表明，山萘酚能减轻顺铂所致的心肌损伤和心功能不全，减轻心肌细胞的炎症和凋亡，并且山萘酚的心脏保护作用与其抑制sting介导的nf-kb活化密切相关。基于上述发现，发明人完成了本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本文已经详细地描述了本申请，其中也公开了其具体实施例，对本领域的技术人员而言，在不脱离本申请的精神和范围的情况下针对本申请的实施例进行各种变化和改进将是显而易见的。

各个实施例中，山萘酚购自美国selleck公司。

实施例1山萘酚减轻顺铂所致心肌肥厚和心功能不全

为探讨山萘酚对顺铂诱导的心肌肥大和心功能不全的保护作用，采用山萘酚预处理对顺铂所致小鼠心肌肥厚和心功能不全的保护作用。采用皮下注射顺铂(3mg·kg^-1·2day^-1)一周建立顺铂致心脏损伤动物模型，山萘酚(10mg·kg^-1·day^-1)于注射顺铂前一周开始口服给药，连续给药两周。对照组皮下注射等量顺铂，在注射顺铂前一周开始口服给予等量1％cmc-na溶媒。

用超声心动图测量射血分数和缩短分数，结果如图1a-b所示，结果显示，顺铂处理可降低ef和fs，而山萘酚治疗可显著改善顺铂诱导的心功能不全。

用elisa试剂盒检测治疗后各组的血清ck-mb水平，心脏组织切片h&e染色观察心肌纤维紊乱，并通过rt-qpcr检测anp和bnp的mrna水平。结果显示，顺铂诱导血清ck-mb水平升高，但山萘酚治疗后小鼠的ck-mb水平有所改善(图1c)。心脏组织的组织学分析显示顺铂诱导的小鼠心肌纤维紊乱增加，但山萘酚治疗的小鼠心肌纤维紊乱被逆转(图1d)。同时顺铂提高了anp和bnp的mrna水平，但kpf治疗逆转了这些变化(图1e-f)。

心脏与体重之比(hw/bw)如图1g中所示，心脏与体重(hw/bw)比值的增加被认为是由心肌肥大引起的，图1g显示山萘酚降低了顺铂引起的hw/bw比值的增加。以上结果表明，山萘酚对顺铂所致心肌肥厚和心功能不全有保护作用。

实施例2山萘酚降低顺铂诱导的心肌细胞凋亡

为了进一步探讨山萘酚的保护作用，我们对心肌组织中心肌细胞凋亡进行了分析，具体步骤如下：

1、切片于二甲苯，100％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，70乙醇脱蜡；

2、按1∶100的比例，用0.3％tritonpbs稀释2mg/ml的proteinasek溶液，使其终浓度为20μg/ml；每个样本上滴加100μl浓度为20μg/ml的proteinasek溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20min；

3、用pbs溶液润洗样本2-3次，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体；

4、按1∶5的比例用去离子水稀释5×equilibrationbuffer，每个样本滴加100μl1×equilibrationbuffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30min；

5、以ddh2o34μl，5×equilibrationbuffer10μl，fitc-12-dutplablingmix5μl，recombinanttdtenzyme1μl配置tdt孵育缓冲液，每个样本加入50μltdt孵育缓冲液，在37℃孵育60min，避光操作；

6、dapi染色5分钟，pbs洗涤3次，每次5min；

7、于荧光显微镜下分析样本。tunel染色结果显示山萘酚缓解顺铂诱导的心肌细胞凋亡(图2a)。另一方面，顺铂增加了凋亡相关蛋白(bax)的表达，降低了抗凋亡相关蛋白(bcl-2)的表达，但经山萘酚处理后，这些变化被逆转(图2b)。以上提示山萘酚对顺铂诱导心肌细胞凋亡有着保护作用。

实施例3山萘酚能显著抑制顺铂诱导的心肌组织炎症反应

采用皮下注射顺铂(3mg·kg^-1·2day^-1)一周建立顺铂致心脏损伤动物模型，山萘酚(10mg·kg^-1·day^-1)于注射顺铂前一周开始口服给药，连续给药两周。对照组皮下注射等量顺铂，在注射顺铂前一周开始口服给予等量1％cmc-na溶媒。空白组皮下注射等量生理盐水，在注射顺铂前一周开始口服给予等量1％cmc-na溶媒。

结果如图3中所示。免疫组织化学染色显示顺铂增加了心肌组织中cd68的表达，表明巨噬细胞浸润心肌组织的数量增加。山萘酚预处理逆转了这种增加(图3a)。rt-qpcr与elisa实验结果显示心脏组织中炎症因子il-6、hmgb1、tnf-α和mcp-1(图3b-e)的水平增加，但山萘酚处理可逆转这些变化(图3f-g)。由于nf-kb信号通路被认为是炎症的关键，我们在心脏组织中对其进行了检测。如图3h所示，顺铂诱导nf-kb的磷酸化，而山萘酚有效地抑制了顺铂诱导的心肌组织nf-kb的磷酸化。这些结果表明，山萘酚对顺铂所致的心脏炎症有明显的抑制作用，这可能与山萘酚的心脏保护作用有关。

实施例4山萘酚抑制顺铂诱导的h9c2细胞死亡

首先，我们建立了顺铂抑制h9c2细胞活力的细胞模型。实验组h9c2细胞系(购自中国科学院上海细胞库)用顺铂(0.1、0.5、1、5、10μm)孵育24h，空白组用1μlpbs孵育24h。

用mtt法检测h9c2细胞的存活率，结果如图4a所示，在5和10μm浓度水平下，顺铂对于h9c2细胞的活性产生了显著的抑制。

随后，我们评估了山萘酚预处理后顺铂(10μm)诱导的h9c2细胞活力，具体步骤包括：用1、5、10μm山萘酚孵育h9c2细胞1h，然后用10μm顺铂处理24h，结果如图4b所示，结果显示，顺铂对h9c2细胞增殖有明显的抑制作用，但山萘酚预处理对h9c2细胞有剂量依赖性的保护作用。采用tunel染色(c)和定量分析(d)的典型图像对h9c2细胞进行凋亡检测，结果显示山萘酚可减少顺铂诱导的心肌细胞凋亡(图4c-d)。

收集总蛋白进行蛋白免疫印迹分析和定量分析，检测bax和bcl2的表达，结果显示，顺铂增加了凋亡相关蛋白(bax)的表达，降低了抗凋亡相关蛋白(bcl-2)的表达，但通过山萘酚处理h9c2细胞，这些顺铂诱导的改变被逆转(图4e-f)。上述结果表明，山萘酚对顺铂诱导的h9c2细胞凋亡具有剂量依赖性保护作用。

实施例5山萘酚抑制顺铂诱导的炎症反应

心肌组织炎症反应普遍，加重心肌细胞损伤，导致细胞凋亡。因此，我们检测山萘酚是否抑制顺铂诱导的炎性细胞因子的释放。h9c2细胞经山萘酚(1、5、10μm)或dmso预处理1h后，与顺铂(10μm)共孵育6h。空白组用dmso预处理1h后，与1μlpbs共孵育6h。

收集总rna，rt-qpcr检测hmgb1、mcp-1、tnf-α和il-6的mrna水平，显示顺铂可增加炎性细胞因子的mrna水平，包括hmgb1、mcp-1、tnf-α和il-6(图5a)。

收集培养基，用相应的elisa试剂盒检测il-6和tnf-α，得到细胞培养液中il-6和tnf-α的分泌结果(图5b)，显示山萘酚处理降低了h9c2细胞中以上炎症因子水平(图5a-b)。

收集总蛋白进行蛋白免疫分析和定量分析，检测nf-κb的磷酸化和表达。结果如图5c显示，山萘酚能有效降低顺铂诱导的h9c2细胞nf-κb的磷酸化水平。以上结果表明，山萘酚可能通过抑制炎症反应减轻顺铂对h9c2细胞的损伤。

实施例6sting参与顺铂诱导的炎症反应

研究表明，cgas/sting信号通路能够检测胞浆dna并诱导先天免疫。据报道，缺乏cgas的小鼠表现出明显mi后的早期存活率改善，减少病理重构，消除炎症程序的诱导，并促进巨噬细胞转化为修复表型。

采用皮下注射顺铂(3mg·kg^-1·2day^-1)一周建立顺铂致心脏损伤动物模型，山萘酚(10mg·kg^-1·day^-1)于注射顺铂前一周开始口服给药，连续给药两周。对照组皮下注射等量顺铂，在注射顺铂前一周开始口服给予等量1％cmc-na溶媒。空白组皮下注射等量生理盐水，在注射顺铂前一周开始口服给予等量1％cmc-na溶媒。

用蛋白免疫印迹分析和定量分析检测心肌组织中sting和tbk1的磷酸化，结果如图6a所示。结果显示，顺铂增加心肌组织中sting和tbk1的磷酸化，而山萘酚治疗逆转了顺铂诱导的以上变化。

采用蛋白免疫印迹分析和定量分析方法检测sting和tbk1的磷酸化。将h9c2细胞与顺铂(10μm)孵育0、0.5、1h或2h，收集总蛋白进行蛋白免疫印记实验，结果显示，顺铂诱导了sting和tbk1的时间依赖性激活(图6b)，然而h9c2细胞经山萘酚(1、5、10μm)或dmso预处理1h后，与顺铂(10μm)共孵育1h(空白组不经顺铂处理，用dmso预处理1h后，与1μlpbs共孵育1h)。收集总蛋白进行蛋白免疫印记实验，结果显示，山萘酚预处理以剂量依赖的方式抑制顺铂刺激的h9c2细胞中sting和tbk1的磷酸化(图6c)。

接下来，我们研究了山萘酚在顺铂引起h9c2细胞中的抗凋亡作用是否依赖于sting。用sirna敲低sting的表达水平(图6d)。采用蛋白免疫印迹法检测细胞中bax和bcl-2的表达，h9c2细胞经山萘酚(1、5、10μm)或dmso预处理1h后，与顺铂(10μm)共孵育24h(空白组不经顺铂处理，用dmso预处理1h后，与1μlpbs共孵育24h)，收集总蛋白，结果如图6e所示，在顺铂暴露前，通过sirna抑制sting的表达可降低h9c2细胞中bax表达的增加，并提高bcl-2的表达。此外，在sting敲低的情况下，山萘酚未能改善顺铂刺激下h9c2细胞的存活率(图6f)。

为了进一步证实山萘酚的抗炎作用取决于其对sting的抑制作用，我们通过抑制sting的表达观察了山萘酚对顺铂诱导的炎症反应的影响。如图6g-h所示，顺铂未能增加sting敲低下h9c2细胞的炎症因子。以上提示sting参与了顺铂诱导的炎症和细胞凋亡，并且抑制sting的表达可阻断nf-kb信号通路来抑制顺铂诱导的炎症和细胞凋亡。

讨论

顺铂作为一种抗肿瘤药物，临床应用广泛，并伴有心脏毒性、肾毒性、肝毒性等副作用，据报道，顺铂引起的心脏毒性主要表现为心电图改变、心律失常、心律失常等。最终，心脏毒性事件可导致充血性心力衰竭和猝死。因此，有必要寻找一种有效的心脏毒性治疗策略，了解导致心脏毒性的机制，有助于开发预防顺铂相关毒性作用的新方法和手段。

山萘酚是一种黄酮醇，在预防炎症和氧化应激方面具有不可忽视的潜力。据报道，山萘酚可减轻angii诱导的心脏重构和心力衰竭。在这项研究中，我们发现山萘酚可以在体内减轻顺铂诱导的心脏功能不全和肥大(图1)。此外，山萘酚可减少顺铂诱导的心肌细胞凋亡(图2)。提示山萘酚对顺铂所致心肌损伤有保护作用。此外，我们发现顺铂可诱导体内炎性因子表达增加和巨噬细胞浸润，但山萘酚治疗逆转了这些变化(图3)。以上提示山萘酚可能通过抑制nf-kb介导的炎症反应减轻顺铂所致的心脏损伤。

顺铂诱导小鼠心肌组织caspase-3活性及bax和bak(bcl-2家族促凋亡蛋白)表达增加，表明心肌细胞凋亡增加。作为细胞内dna传感器，cgas可以识别自身和非自身dna。在与胞质双链dna(dsdna)结合后，cgas通过消耗腺苷三磷酸(atp)和鸟苷三磷酸(gtp)诱导环gmp-amp(cgamp)的合成。第二信使cgamp诱导sting聚合并转录激活干扰素调节因子3(irf3)来增加1型干扰素的产生。有趣的是，我们发现心脏组织中的sting和tbk1的磷酸化增加(图6a)，nf-kb被顺铂激活(图3h)。山萘酚能降低sting和tbk1的磷酸化(图6a)，并抑制顺铂诱导小鼠nf-kb的活化(图3h)。在顺铂刺激的h9c2细胞中也观察到类似的结果。为了确定sting在山萘酚的心脏保护作用中的作用，将stingsirna转染到h9c2细胞中(图6d)。山萘酚不能抑制炎症因子的表达，也不能减少顺铂诱导的h9c2细胞凋亡(图6e-h)，提示山萘酚可能通过阻断sting/nf-kb信号通路抑制顺铂诱导的心脏炎症反应。

山萘酚具有调节氧化应激、炎症、血管生成和凋亡相关的信号转导途径的作用。在本项目中，我们发现山萘酚通过抑制sting/nf-kb介导的炎症反应来减轻顺铂引起的心脏损伤。此外，我们的研究结果清楚地表明靶向性sting可能是治疗顺铂所致心力衰竭的新策略。今后，对山萘酚具有抗炎作用的天然活性成分的研究应引起重视。